CN107494261B - 一种建立菜心悬浮细胞系的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种建立菜心悬浮细胞系的培养方法，包括菜心无菌苗的培养、胚性愈伤组织的诱导和菜心悬浮细胞系的建立。本发明建立的菜心悬浮细胞系的培养方法，具有繁殖速度快，能在短期内提供大量均匀一致菜心悬浮细胞液的特点，为进一步利用基因工程等生物技术方法选育抗虫、抗逆、抗除草剂和其它优良性状的菜心新品种提供了新的途径和方法。
Description
技术领域
本发明涉及植物悬浮细胞培养技术领域，具体地，涉及一种建立菜心悬浮细胞系的培养方法。
背景技术
菜心（Brassica parachinensis L.），又名菜薹，是十字花科芸薹属白菜亚种中的一个变种，起源于广东。菜心风味独特，生育周期短、复种指数高，具有较高的经济效益，在蔬菜的周年供应上有重要的地位，是我国华南地区的特色蔬菜之一，在广东和广西栽培历史悠久，品种资源尤为丰富，因而其品种改良备受蔬菜育种学家的重视。目前迫切需要具有抗虫、抗逆、抗除草剂和其它优良性状的菜心新品种，但是菜心品种中对主要农艺性状有用的种质资源相对较少，因此采用基因工程的方法获得新的品种或种质资源便显得尤为重要。通过基因工程技术将功能基因转入菜心植株中，可以便捷地得到功能基因的特定功能，极大地简化田间选育的工作强度和缩短育种时间。
悬浮细胞是良好的基因工程实验材料，在研究植物遗传转化、体细胞胚胎发生、人工诱变、生物反应器等方面有巨大的应用潜力和前景。其中，基于细胞和分子生物学研究的植物悬浮细胞培养，具有相对快速的繁殖率、培养条件易于优化和控制、产物分离较容易等优点，已成为基因工程育种领域不可或缺的手段。
悬浮细胞系的建立受很多因素的影响，如基因型、外植体的取材部位、愈伤组织的选择和接种量（接种密度）、培养基配方以及环境因素（如温度、光照、pH、振荡速度等）。植物细胞更容易聚集成团、植物细胞对剪切力更敏感、植物细胞代谢途径与细胞生长关系复杂、不同年龄的植物细胞中液泡体积变化较大导致细胞对渗透压的忍受力有差异等，是构建植物悬浮细胞培养的主要瓶颈。目前，虽然有关植物悬浮细胞培养技术方面的研究有了很大的进步，但尚没有关于建立菜心悬浮细胞系培养方法的报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种建立菜心悬浮细胞系的培养方法，该方法具有繁殖速度快，能在短期内提供大量均匀一致菜心悬浮细胞液的特点，为进一步利用基因工程等生物技术方法选育抗虫、抗逆、抗除草剂和其它优良性状的菜心新品种提供了新的途径和方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种建立菜心悬浮细胞系的培养方法，包括如下步骤：
S1.胚性愈伤组织的诱导：将无菌苗下胚轴外植体接入初代愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导，所述初代愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+0.5～3 mg/L毒莠定+1mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L结冷胶，培养基pH为5.8；
S2.将步骤S1获得的愈伤组织先后接入继代培养基A和继代培养基B中进行多次反复交替继代培养，所述继代培养基A的配方为：MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+3 g/L结冷胶+400 mg/L水解酪蛋白，培养基pH为5.8；所述继代培养基B的配方为：MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L结冷胶+400 mg/L水解酪蛋白+1 mg/LABA；
S3.菜心悬浮细胞系的建立：将步骤S2获得的胚性愈伤组织接入液体继代培养基C中进行继代培养，最终获得均匀的悬浮细胞液，所述液体继代培养基C的配方为：MS+1.5mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+400 mg/L水解酪蛋白，培养基pH为5.8。
本发明提供一种建立菜心悬浮细胞系的培养方法，通过该方法能在短时间内获得大量均匀的菜心悬浮细胞液，在光学显微镜下菜心细胞呈饱满球状、分散而不团聚，适合开展各项细胞学和分子生物学等研究。
优选地，步骤S1中所述初代愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+1.5 mg/L毒莠定+1mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L结冷胶，培养基pH为5.8。
优选地，步骤S1中所述胚性愈伤组织的诱导条件为25℃、光照时间16h光照/8h黑暗、光照强度1600–2000 lux。
本发明研究表明，与常规商业植物组培培养基B5培养基相比，在MS培养基中外植体经诱导形成的愈伤组织更明显，因此选用MS培养基为愈伤组织诱导培养基。其次，发明人在MS培养基中，研究添加不同激素（2,4-D和毒莠定）配比条件下愈伤组织的诱导率和褐化率，发现在0.5～3 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA的激素配比培养基中愈伤组织的诱导率显著高于其它组，而愈伤组织褐化率显著低于其它组。结合经济方面考虑，因此选择毒莠定较低浓度配比作为初代愈伤组织诱导培养基，即MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L结冷胶，培养基pH为5.8。
优选地，步骤S2中所述继代培养基A和B的培养条件均为25℃、黑暗条件下培养15d。
优选地，步骤S3中所述继代培养的过程为：将淡黄色胚性愈伤组织按1 g/50 mL的接种量接入液体继代培养基C中振荡培养1周后，用网筛过滤掉大的细胞团，滤液离心后去掉上清液，将沉淀细胞接入新鲜液体继代培养基C中继代培养1周，纱网过滤后收集滤液；之后每7 d继代培养一次，将悬浮细胞沉降片刻后倒去一半上清液，补充新鲜液体继代培养基C至50 mL继续悬浮培养；每2周将细胞过多的悬浮细胞分瓶；每4周用纱网过滤悬浮细胞，保留滤液，最终获得均匀的悬浮细胞液。
优选地，步骤S3中所述振荡培养条件为25℃、散射光、转速140 r/min。
优选地，步骤S3中所述离心条件为4℃、转速3500 r/min、离心10 min。
优选地，步骤S3中所述网筛孔径为40目，所述纱网孔径为100目。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明提供的培养方法简单易行，生产成本低，繁殖速度快。
（2）本发明提供的方法能在短期内得到大量均匀的菜心悬浮细胞液，提高了悬浮细胞系的质量和产量，为进一步利用基因工程等生物技术方法选育抗虫、抗逆、抗除草剂和其它优良性状的菜心新品种提供了新的途径和方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中生长在培养瓶中的无菌苗。
图2为本发明实施例2中切取无菌苗下胚轴获得的外植体。
图3为本发明实施例2中不同基本培养基上菜心愈伤组织的诱导情况。
图4为本发明实施例2中继代培养后得到的淡黄色胚性愈伤组织。
图5为本发明实施例3中建立菜心悬浮细胞系的过程图；a为初步接入液体继代培养基A中的胚性愈伤组织、b为均匀的菜心悬浮细胞液、c为40倍下光学显微镜下菜心细胞形态。
图6为本发明实施例4中菜心悬浮细胞的生长曲线图。
图7为本发明实施例4中不同蔗糖浓度下菜心悬浮细胞生物量的变化情况。
图8为本发明实施例4中菜心悬浮细胞系生长周期中培养液pH变化曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种建立菜心悬浮细胞系的培养方法，包括如下步骤：
一、菜心无菌苗的培养，包括如下步骤：
取菜心种子，在超净台中用75%的酒精浸润约45s，期间不断震荡；用无菌水冲洗4～5次；再用2% NaClO溶液消毒20 min，用无菌水冲洗4～5次；将种子置于灭过菌并铺有无菌滤纸的培养皿中。然后将灭过菌的种子接入装有播种培养基的培养瓶内，每瓶播种约20粒。接完后用封口膜将瓶盖接缝处封好，放入恒温培养箱于25℃、光照时间16h光照/8h黑暗、光照强度1600～2000 lux条件下培养5d（图1）。所述播种培养基的配方为：1/2 MS+30g/L蔗糖+10 g/L琼脂，培养基pH为5.8。
二、胚性愈伤组织的诱导，包括如下步骤：
挑取组培瓶中长势良好的无菌苗，在无菌条件下切取其下胚轴，并将下胚轴切成0.5～1 cm小段作为外植体进行愈伤组织的诱导实验，如图2所示。
1.愈伤组织诱导培养基的确定：
选择不同的常规商业植物组培培养基，即MS和B5培养基，将下胚轴外植体分别接入培养基中进行愈伤组织诱导，在25℃、光照时间16h光照/8h黑暗、光照强度1600～2000lux条件下培养3 d，观察诱导效果。通过比较分析，发现B5培养基诱导效果不明显，而MS培养基中愈伤组织形成明显，如图3所示，因此确定愈伤组织诱导培养基为MS培养基。
2.初代愈伤组织诱导激素配比的确定：
在MS培养基中分别添加以下配比的植物激素：
（1）0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA；
（2）0.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA；
（3）1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA；
（4）0.5 mg/L毒莠定+1.0 mg/L 6-BA；
（5）1.5 mg/L毒莠定+1.0 mg/L 6-BA；
（6）3 mg/L毒莠定+1.0 mg/L 6-BA。
除上述配比激素外，每组培养基均添加30 g/L蔗糖、3 g/L结冷胶（gelrite）和10mg/L抗坏血酸，培养基pH为5.8。所有试剂材料均为市场常用产品。
在MS培养基中，添加以上不同激素配比进行愈伤组织的诱导，每种激素配比的培养基分装成3个平板，将这些外植体放于4℃冰箱中冷藏48h，之后将其置于25℃恒温培养箱中黑暗培养。通过比较诱导效果（诱导率和褐化率），得出最佳愈伤组织诱导激素配比。
培养15d后，统计不同激素配比培养基中愈伤组织的诱导率和褐化率，结果如表1所示：
表1 不同激素配比培养基中愈伤组织的诱导率与褐化率
注：表中同列数据含有相同字母者差异不显著，p<0.05
表1显示，激素配比（5）和（6）培养基中愈伤组织的诱导率显著高于其它组，且这两组愈伤组织褐化率显著低于其它组，从经济方面考虑，选择毒莠定较低浓度配比作为初代愈伤组织诱导培养基，即MS+0.5～3 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L结冷胶，培养基pH为5.8。
3.胚性愈伤组织的纯化与继代培养
选用颜色和质地均一、疏松无定型的愈伤组织接到继代培养基A上，在25℃、黑暗无菌条件下培养15d；然后将未褐化的愈伤组织接于继代培养基B上，在25℃、黑暗条件下继续培养15d；之后再转入继代培养基A中，如此反复交替继代培养愈伤组织，直至出现淡黄色、松散颗粒状的胚性愈伤组织（图4），用于后续悬浮培养。
所述继代培养基A的配方为：MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L结冷胶+400 mg/L水解酪蛋白，培养基pH为5.8，添加的水解酪蛋白可为愈伤组织的生长提供丰富的有机氮素营养，具有刺激细胞分裂、促进愈伤组织健康生长的作用。
所述继代培养基B的配方为：MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L结冷胶+400 mg/L水解酪蛋白+ 1 mg/L ABA，添加的ABA即脱落酸，在诱导胚性愈伤组织形成、不定芽的正常发育及保持愈伤组织胚性等方面有重要作用。
三、建立菜心悬浮细胞系的培养方法，包括如下步骤：
将1g淡黄色胚性愈伤组织接种于含50 mL液体继代培养基A（不含结冷胶）的三角瓶中（图5a），于25℃摇床散射光下140 r/min振荡培养1周后，用40目网筛过滤掉大的细胞团（渣），然后将滤液在3500 r/min，4℃条件下离心10 min，倒掉上清液，再将沉淀细胞接种到新鲜液体继代培养基A中继代培养1周，再用100目的纱网过滤，收集滤液。全程需无菌条件下操作。
之后每7 d继代培养一次，继代方法为：首先将悬浮细胞沉降片刻，倒去一半上清液，补充新鲜液体继代培养基A至50 mL继续悬浮培养；每2周将细胞过多的悬浮细胞分瓶；每4周用100目的纱网过滤悬浮细胞，保留滤液。当悬浮细胞系中没有出现肉眼可见颗粒物，镜检悬浮细胞系组成为离散单细胞时，完成菜心悬浮细胞系的建立，最终获得均匀的悬浮细胞液（图5b）。在光学显微镜下，菜心细胞呈饱满球状、分散而不团聚，适合开展各项细胞学和分子生物学等研究（图5c）。
实施例2
本发明对菜心悬浮细胞生长曲线及其影响因素进行了研究，研究结果如下：
1.菜心悬浮细胞系的生长曲线
自菜心悬浮细胞系被继代的当天开始，每隔2天取1 mL悬浮细胞液用中性红进行染色，然后置于细胞计数器上，用显微镜进行观察计数。通过细胞计数板计数得到的结果绘制成悬浮细胞系生长曲线图（图6）。菜心悬浮细胞系与其它植物所建立的悬浮细胞系一样，其生长曲线呈典型的S型，在一个完整的生长周期中存在延迟期、对数生长期、减慢期和静止期这几个特征时期。经过短暂的适应期后，细胞进入为期1周左右的对数生长期，在这一时期细胞数量急剧增加，逐渐在第10 d时达到峰值，细胞数大约57个/mL。之后细胞数量的变化不太明显，处于生长的静止期。大约2d后由于培养基中的营养成分已在细胞代谢的过程中被大量消耗，导致细胞数量呈现缓慢下降的趋势，至第14d时，培养液中的细胞数量减少到大约53个/mL。由以上分析我们可以得出，菜心细胞在悬浮培养的过程中生长周期为2周左右。
2.不同蔗糖浓度对菜心悬浮细胞系生长的影响
碳源是植物组织培养中必需的营养因子，通常在培养基中需要加入20~30g/L蔗糖作为培养基碳源。培养基中蔗糖浓度对培养物的生长有明显影响，“碳饥饿”可能改变离体细胞的发育方向和改善某些遗传操作的效率。在本发明中，选取初始浓度为0.16 g/L的悬浮细胞以10/50的稀释倍数，在0、10、20、30、40 和50 g/L六个蔗糖浓度下继代培养，通过检测7 d后悬浮细胞的生物量来研究蔗糖浓度对菜心悬浮细胞系生长的影响，结果如图7显示。蔗糖浓度为30 g/L时，悬浮细胞生物量最大，达到了0.178 g/mL，而在0和10 g/L的蔗糖浓度下，悬浮细胞的生物量仅为0.031 g/mL和0.057 g/mL。结果表明，蔗糖不仅为细胞生长提供了所必需的碳源，而且还能保持细胞生长环境内适当的渗透压。蔗糖浓度过低，不仅碳源得不到充足的保证，还会发生营养物质外渗现象，最终导致细胞死亡；反之，蔗糖浓度过高也会因为细胞内水分外渗而出现生理性缺水现象，引起细胞生物量降低。
3.菜心悬浮细胞系生长过程中pH变化
培养环境中的pH值是影响细胞生长的一个重要参数。pH值的升降直接影响细胞质膜的电位，影响细胞质膜的通透性，从而影响细胞内外物质的交流，抑制了细胞的生长。由菜心悬浮细胞系生长周期中pH值变化情况统计结果绘制出pH值变化曲线（图8），从培养液的pH值变化来看，继代培养4d后，培养液的pH值迅速下降，此时细胞处于缓慢增殖时期，生长相对迟缓，在随后的几天内，细胞数目和pH值都呈缓慢变化趋势。当对数期时增加到顶峰，继续培养，pH缓慢下降并保持相对稳定。因此可见，该培养液具有较好的缓冲能力，整个培养过程中pH值始终能维持在5.8~5.0左右，能够满足植物细胞培养全过程对pH的要求。
4.接种量对菜心悬浮细胞系生长的影响
初始接种量对悬浮细胞系的生长有一定的影响，细胞进行生长分裂首先需要达到一定的起始密度，但细胞过多又需消耗大量的养分，可能导致养分不足而影响生长。因此，适宜的接种量既能使细胞达到最大的生长速率，又不会引起养分的浪费或不足。在本发明中，我们从稳定的悬浮细胞系中取5 mL、10 mL和15 mL悬浮细胞液进行培养，通过对整个细胞周期过程中细胞形态进行观察，发现初始悬浮细胞的量过多或过少，细胞增殖及生长状况都不理想，因此将初始接种量定为10 mL悬浮细胞液。
Claims (8)
1.一种建立菜心悬浮细胞系的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.胚性愈伤组织的诱导：将无菌苗下胚轴外植体接入初代愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导，所述初代愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+0.5～3 mg/L毒莠定+1 mg/L6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L结冷胶，培养基pH为5.8；
S2.将步骤S1获得的愈伤组织先后接入继代培养基A和继代培养基B中进行多次反复交替继代培养，所述继代培养基A的配方为：MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+3g/L结冷胶+400 mg/L水解酪蛋白，培养基pH为5.8；所述继代培养基B的配方为：MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L结冷胶+400 mg/L水解酪蛋白+1 mg/L ABA；
S3.菜心悬浮细胞系的建立：将步骤S2获得的胚性愈伤组织接入液体继代培养基C中进行继代培养，最终获得均匀的悬浮细胞液，所述液体继代培养基C的配方为：MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+400 mg/L水解酪蛋白，培养基pH为5.8。
2.根据权利要求1所述菜心悬浮细胞系的培养方法，其特征在于，步骤S1中所述初代愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L结冷胶，培养基pH为5.8。
3.根据权利要求1所述菜心悬浮细胞系的培养方法，其特征在于，步骤S1中所述胚性愈伤组织的诱导条件为25℃、光照时间16h光照/8h黑暗、光照强度1600～2000 lux。
4.根据权利要求1所述菜心悬浮细胞系的培养方法，其特征在于，步骤S2中所述继代培养基A和B的培养条件均为25℃、黑暗条件下培养15 d。
5.根据权利要求1所述菜心悬浮细胞系的培养方法，其特征在于，步骤S3中所述继代培养的过程为：将淡黄色胚性愈伤组织按1 g/50 mL的接种量接入液体继代培养基C中振荡培养1周后，用网筛过滤掉大的细胞团，滤液离心后去掉上清液，将沉淀细胞接入新鲜液体继代培养基C中继代培养1周，纱网过滤后收集滤液；之后每7 d继代培养一次，将悬浮细胞沉降片刻后倒去一半上清液，补充新鲜液体继代培养基C至50 mL继续悬浮培养；每2周将细胞过多的悬浮细胞分瓶；每4周用纱网过滤悬浮细胞，保留滤液，最终获得均匀的悬浮细胞液。
6.根据权利要求5所述菜心悬浮细胞系的培养方法，其特征在于，步骤S3中所述振荡培养条件为25℃、散射光、转速140 r/min。
7.根据权利要求5所述菜心悬浮细胞系的培养方法，其特征在于，步骤S3中所述离心条件为4℃、转速3500 r/min、离心10 min。
8.根据权利要求5所述菜心悬浮细胞系的培养方法，其特征在于，步骤S3中所述网筛孔径为40目，所述纱网孔径为100目。
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