CN102217546B - 一种甘薯胚性愈伤长期增殖保存的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘薯胚性愈伤长期增殖保存的方法。其过程包括继代胚性愈伤的选取、胚性愈伤的继代增殖、胚性愈伤诱导成成熟胚再生。本发明的有益效果是工艺流程简单，胚性愈伤增殖率高，可继代时间长，弥补了甘薯组织培养过程中取材受季节限制、胚性保持时间短等限制胚性愈伤长期利用的技术难题，为甘薯的转基因技术提供了良好的受体材料，也为周年生产甘薯组培苗提供了大量的高效再生材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种甘薯胚性愈伤组织通过植物组织培养和显微监控技术达到增殖和长期继代保存的方法。
背景技术
甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)是世界上重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源作物，在亚洲、非洲和拉丁美洲等热带、亚热带、温带地区广为栽培。甘薯在世界粮食生产中，总产排列第7位。在我国粮食生产中，仅次于水稻、小麦和玉米，居第4位，具有重要的经济价值和战略地位。目前我国甘薯常年种植面积在5-6×106hm2，占世界总面积的60％以上，年总产量占世界总产量的80％以上。
由于甘薯遗传上的高度杂合性和种间、种内广泛存在的杂交不亲和性，限制了其育种中亲本的自由选配。加之，甘薯遗传资源匮乏，遗传基础狭窄，优异近缘野生种利用困难和病虫、病毒病危害严重，极大地制约了甘薯的生产和发展。利用植物基因工程技术能有效克服常规育种中存在的物种隔离和基因连锁等障碍，对甘薯品种选育和生产无疑具有潜在的推动意义。甘薯的遗传转化研究起步较晚，虽然取得了一些进展，但仍存在着受体材料制备困难，嵌合体和转化效率低等问题，缺乏一个高效的遗传转化体系，因而限制了甘薯基因工程的发展。
甘薯胚性愈伤组织可以由体细胞胚胎发生途径再生植株，是甘薯转基因利用的主要受体材料。刘庆昌(1996)在生物技术学报发表文章对甘薯胚性悬浮培养的研究表明：28周内悬浮培养甘薯品种栗子香可保持100％植株再生能力，37周即降为45.8％。目前甘薯胚性愈伤组织培养中存在的主要问题是：(1)利用目前的胚型愈伤悬浮液体增殖技术，甘薯胚性愈伤的胚性保持时间短。(2)胚性愈伤与非胚性愈伤共存，易被增值能力快的非胚型愈伤竞争而失去生存能力和空间，丧失再生能力。(3)胚性愈伤易分化形成胚状体，失去增殖能力，丧失胚性。(4)外植体取材受甘薯生育期限制，需每年在春季进行茎尖诱导制备胚性愈伤，生产成本高，胚性愈伤扩繁数量少，无法满足高效遗传转化体系受体材料长期提供的需要。针对以上问题，本发明开发一种甘薯胚性愈伤长期继代增殖的组培方法，为组培苗生产和转基因实验长期提供材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘薯胚性愈伤长期继代增殖的组培方法，它是利用茎尖分生组织培养过程中诱导形成的胚性愈伤进行形态筛选继代，达到长期保存和扩增胚性愈伤，以用于生产和实验的方法。
本发明所设计的甘薯胚性愈伤长期继代增殖方法通过以下技术方案实现，具体如下：
(1)、继代胚性愈伤的选择处理：在茎尖分生组织脱分化诱导出愈伤后，在体视镜下筛选可保持胚性的结构致密、近球形的胚性愈伤，剔除鱼雷胚、子叶胚和结构松散的非胚性愈伤，移入含有1-3mg/L 2，4-D的MS固体培养基中培养，所用培养基体积为25mL，培养皿直径直径为9cm，每培养皿放置20-30块直径2-3mm的胚性愈伤，培养条件为22±1℃，黑暗；
(2)、胚性愈伤的继代增殖过程：按步骤(1)培养每45天后，胚性愈伤长至5-8mm，在体视镜下剔除鱼雷胚、子叶胚和非胚性愈伤，选择颗粒致密的心形和球形胚性愈伤部分，用尖头镊子夹取并按照步骤(1)所述方法培养，1块愈伤可切取为2-3块，实现几何级数增长，3年后理论上可增至224-324个保持胚性的胚性愈伤；
(3)、胚性愈伤经体细胞胚胎发生途径再生：将按照步骤(2)增殖的胚性愈伤组织转移到含1.0mg/L ABA的MS固体培养基中，28±1℃，每日13h，3000Lx光照下培养3-4周，体细胞胚发育并成小植株，再将获得的小植株转移到MS固体培养基中，在28±1℃，每日13h，3000Lx光照下培养3-4周，即可获得完整植株。
本发明的优点：
1)胚诱导率低是甘薯组培中存在的主要问题，也是制约甘薯转基因、体细胞植株工厂化生产的瓶颈，通过胚性愈伤继代增殖，可大量提供转基因受体材料，解决胚诱导率低的问题。
2)以往利用胚性悬浮系增殖方式，增殖速度快，虽短时间可获得大量胚性愈伤，但因其继代频繁，胚性愈伤在继代10次后，出现愈伤老化，胚性丧失，再生率下降等问题，使得此方法获得的胚性愈伤只能使用6个月；又因其几何增殖，大量愈伤获得时间集中，加大了遗传转化的工作量；经常剥取茎尖诱导胚性愈伤，费工、费钱，还受生育期及气候等自然条件的极大限制；由于缺乏长期足量的胚性愈伤作为受体材料而影响了转基因工作的进程。本发明方法可以弥补以上不足，长期保存胚性愈伤，实现转基因材料的长期大量提供。
3)利用体视镜下的愈伤形态筛选，继代时仅挑取结构致密，近圆形的胚性愈伤，剔除非胚性、鱼雷胚等成熟胚，减少了非胚性愈伤对胚性愈伤的竞争，保持了胚性愈伤的良好胚性。胚性愈伤增殖率高，保存时间长，具有很大的应用价值。
4)组织培养的适宜温度为28±1℃，本发明采用22±1℃，既有效减缓了胚性愈伤的快速生长，又保证了胚性愈伤的大量增殖。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
1)诱导胚性愈伤：将甘薯品种徐55-2的茎尖，用70％酒精表面消毒30s，立即转入0.1％的HgCl2溶液中消毒3分钟，用无菌水洗涤4-5次。在解剖镜下切取长约0.5mm的茎尖组织(可带1-2片叶原基)，将茎尖组织培养在2.0mg/L的2，4-D的MS固体培养基上，培养条件为28℃，黑暗。诱导胚性愈伤。
2)将诱导得到的胚性愈伤组织切成小块，移入2.0mg/L2，4-D的MS固体培养基，培养条件为22℃，黑暗。45天后，在Leica EZ4D型显微摄像系统下选择颜色亮黄，致密颗粒部分的球形胚和心形胚，移入新鲜2.0mg/L2，4-D的MS固体培养基，培养条件为22℃，黑暗。
3)每45天，按照步骤2)的方法进行选择继代培养，此条件下培养的胚性愈伤可实现几何级数增长，累计获得3万块胚性愈伤组织，并且可保持3年体细胞胚胎发生途径的完全再生能力，即将增殖的胚性愈伤组织转移到含1.0mg/LABA的MS固体培养基中，在28℃，每日13h，3000Lx光照下培养3-4周，体细胞胚发育并成小植株，再将获得的小植株转移到MS固体培养基中，在28℃，每日13h，3000Lx光照下培养3-4周，即可获得完整植株。
Claims (2)
1.一种甘薯胚性愈伤长期增殖保存的方法，其特征在于：它是利用茎尖分生组织培养过程中诱导形成的胚性愈伤进行形态筛选继代，达到长期保存和扩增胚性愈伤，具体步骤如下：
(1)、胚性愈伤的选择处理：将甘薯茎尖分生组织诱导获得的胚性愈伤，在体视镜下选择颗粒致密、心形和球形的胚性愈伤，切成直径2-3mm小块后移入含有1-3mg/L2，4-D的MS固体培养基中培养，培养条件为22±1℃，黑暗；
(2)、胚性愈伤继代增殖：培养每45天后，胚性愈伤长至5-8mm；在体视镜下剔除鱼雷胚、子叶胚和非胚性愈伤，选择颗粒致密的心形和球形胚性愈伤部分，用尖头镊子夹取并按照步骤(1)所述方法培养，1块胚性愈伤能够切取为2-3块，实现几何级数增长；
(3)、胚性愈伤经体细胞胚胎发生途径再生：将按照步骤(2)增殖的胚性愈伤组织转移到含1.0mg/L ABA的MS固体培养基中，28±1℃，每日13h，3000Lx光照下培养3-4周，体细胞胚发育成小植株，再将获得的小植株转移到MS固体培养基中，在28±1℃，每日13h，3000Lx光照下培养3-4周，即可获得完整植株。
2.根据权利要求1所述的一种甘薯胚性愈伤长期增殖保存的方法，其特征在于步骤(1)所用培养基体积为25mL，培养皿直径为9cm，每培养皿放置20-30块直径2-3mm的胚性愈伤。
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