CN104719161B - 一种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，以非洲菊花托为外植体材料，培养于含6‑苄氨基嘌呤、激动素、苯基噻二唑基脲、萘乙酸、毒莠定、水解酪蛋白的体细胞胚诱导培养基中，诱导体细胞胚，体细胞胚萌发后，将其继代培养于分化培养基中，获得再生植株。本发明以非洲菊的花托做外植体，不经过愈伤组织阶段，通过体细胞胚途径获得再生植株，可避免外植体经脱分化诱导愈伤组织再生植株途径而发生突变。利用本发明进行非洲菊组织培养培育种苗，使培养程序简化、培养周期缩短、种苗质量提高，为非洲菊的大量离体繁殖优质种苗及转基因研究提供基础材料。

Description

一种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法

技术领域

本发明属于非洲菊组织培养技术领域，具体涉及一种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法。

背景技术

非洲菊(Gerbera jamesonii)又称扶郎花，原产南非，系菊科大丁草属多年生草本植物，具有花色丰富、花型独特、产花量高、观赏期长等优点，是世界五大切花之一。由于非洲菊自花不孕，种子苗变异大，分株繁殖可以保持原有的种性特征，不发生变异，但存在繁殖过程中种苗易被病虫害侵染，受季节限制，增殖速度慢等问题，难以适应规模化、工厂化生产的需求，且长期无性繁殖还存在病毒积累，种性退化等问题。

非洲菊在国际、国内花卉市场上发展迅速，良种种苗需求大，成本高，目前产业化生产中使用的非洲菊种苗多为组培苗。一般非洲菊的培养程序是：利用非洲菊花托、花瓣、嫩叶、茎尖、叶茎等为起始外殖体，脱分化诱导形成愈伤组织，再将愈伤组织培养于分化培养基获得不定芽，从而利用不定芽增殖培养，最后将不定芽分割后诱导生根。此操作过程复杂，周期长，还存在外植体经过愈伤组织途径形成的种苗容易发生变异等问题。

何俊平等开展了非洲菊品种玲珑再生体系建立的研究，以非洲菊花托为外植体，研究了不同消毒浓度、消毒时间的消毒效果以及激素种类对外植体不定芽分化、增殖及生根的影响。结果表明，用2％次氯酸钠灭菌10min对玲珑外植体有良好的消毒效果。花托诱导不定芽分化的最佳培养基为MS+10.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA，芽体分化率达60.5％。增殖培养基以MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA最为适宜，增殖系数为3.70。生根培养基以1/2MS+0.1mg/L NAA最为适宜，生根率达100％。【何俊平，涂小云，周艳宝等，非洲菊品种玲珑再生体系的建立，江苏农业科学，2012，40(7)：56－58】。

冯新等以非洲菊无菌苗的带节茎段为外植体开展组织培养研究，结果表明，以0.8-1.2cm的非洲菊带节茎段为外植体，可以不通过愈伤组织途径，直接诱导出芽。非洲菊带节茎段诱导芽苗的最佳培养基为MS+6-BA 3.0mg/L+NAA0.1mg/L。较高浓度的6-BA有利于增殖系数的提高，但容易出现玻璃化现象，高浓度的NAA会使芽苗叶色退绿，故最适合的增殖培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L。非洲菊芽苗生根的浓度范围较宽，最佳生根培养基为1/2MS+NAA 0.2mg/L。【冯新，赖呈纯，赖钟雄,非洲菊离体快繁条件的优化，亚热带农业研究，2009，5(4)：222-228】。

王春彦等为探寻非洲菊离体叶片培养的不定芽再生条件，完善非洲菊离体叶片的不定芽再生体系，以不同解离方式的离体叶为外植体，进行不同激素浓度配比的试验。结果表明，除叶柄剪半的外植体无不定芽再生外，另外2种离体叶在叶柄基部均有器官型再生不定芽和器官发生型再生不定芽。自株丛基部撕脱的离体叶于1/2MS+KT5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L的培养基中，器官型不定芽的再生率最高达60％～70％。再生比例为1～2，器官发生型再生率20％～30％，再生比例1～2。器官型不定芽再生主要集中在接种后4～12天的时间段内，而器官发生型不定芽形成主要集中在接种后12～24天的时间段内。若将KT换成不同浓度的6-BA，则以自株丛基部撕脱离体叶的器官型再生率最高达60％～70％，再生比例4～5，器官发生型再生率为50％～60％，再生比例为2～3。试验表明：6-BA和KT二者同属细胞分裂素类物质，二者浓度上的变化对不定芽再生影响不大，而二者种类不同对不定芽再生差异很大。【王春彦，罗凤霞。非洲菊离体叶培养诱导不定芽研究，中国农学通报2011，27(13)：144-148】。

利用体细胞胚途径培养非洲菊再生植株，可简化培养程序、缩短培养周期，降低种苗培育成本，提高种苗质量，降低或避免种苗发生变异。

王丽花等以非洲菊的未受精胚珠为试材，研究胚珠发育时期培养基及供体基因型对非洲菊的未受精胚珠离体诱导效果的影响，并以根尖染色体计数为基础对获得的33株再生植株的倍性进行了流式细胞术鉴定。结果表明，胚珠发育时期培养基及供体基因型均极显著影响愈伤组织和胚状体的诱导频率，且外轮舌状花完全水平展开内轮管状花开放前1d，剥取的胚珠诱导频率较高；MS中的大量元素和有机物+Heller中的微量元素+1/2铁盐+0.5mg/L2，4-D预培养7～10d有利于启动雌核发育诱导胚状体形成；经胚状体或愈伤组织2种途径可再生植株。【王丽花，瞿素萍，吴学尉等。非洲菊未受精胚珠离体培养影响因素研究，西南农业学报，2013，26(4)：1639-1644】。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，以非洲菊的幼小花托为外植体，不经过愈伤组织阶段，通过体细胞胚途径获得再生植株，可避免外植体经脱分化诱导愈伤组织再生植株途径而发生突变，为非洲菊的大量离体繁殖优质种苗及转基因研究提供基础材料，取材方便，操作简单，又不伤害母株。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，包括如下步骤：

1)选取非洲菊花蕾，清洗，70％酒精消毒30-60s，0.1％HgCl₂消毒8-14min，用无菌水冲洗，吸干表面水分待用；

2)剥去非洲菊花蕾上的花萼和小花序，得到花托，并切去花托的外表层，作为外植体；

3)将步骤2)的外植体整体接种到权利要求1所述的诱导培养基中，弱光照培养5～8天；

所述的用于非洲菊体细胞胚的诱导培养基，包含如下表1所示物质：

表1

其中，每升诱导培养基中添加蔗糖30-40克/升；琼脂粉6.5-8克/升；培养基pH＝5.5-6.5；

4)将步骤3)培养的外植体置于强光照下培养，培养45天左右后获得非洲菊体细胞胚，继续培养10-15天，体细胞胚逐渐萌发，形成小芽；

5)将萌发2-3片叶的非洲菊体胚小芽转接于新鲜的分化培养基上，小芽不断生长发育，叶片数逐渐增多，基部形成根系，获得再生植株。

进一步，步骤1)中，花蕾直径为4-7mm，清洗前于4-6℃冷藏处理24-48h。

优选地，步骤3)中，弱光照培养的光照强度为300-500lx，步骤4)中，强光照培养的光照强度为2400-2800lx，培养温度23-26℃。

进一步，步骤5)中所述的分化培养基的组份如表2所示：

表2

其中，每升分化培养基添加蔗糖25-35克，琼脂粉6.5-7.0克；所述分化培养基pH＝5.5-6.5。

本发明的诱导培养基中，高浓度的无机盐和蔗糖可满足体胚诱导过程中需要的矿物元素、碳源供应及较高的渗透压条件；适当增加铁盐浓度，可保证铁素的稳定供应，有利于细胞的分裂。

本发明的诱导培养基中，添加的6-苄氨基嘌呤(缩写为6-BA)、激动素(缩写为KT)是细胞分裂素类物质，在植物组培中具促进芽的增殖作用，萘乙酸(缩写为NAA)是生长素类物质，具促进生根作用，也有用于诱导愈伤组织，苯基噻二唑基脲(缩写为TDZ)具有很强的细胞分裂素活性(CTK)，其CTK活性要比一般植物生长调节剂的CTK高几十倍至几百倍，研究表明：它可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等，并且可以对其它的植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，是一个作用力很强的植物生长调节剂。

毒莠定(缩写为PIC)是一种除草剂，是非常规激素，本发明在组织培养中发现，它对诱导胚性愈伤组织具有一定的促进作用。在本发明中，采用较高浓度的6-BA，与较低浓度的KT、TDZ、NAA、PIC等多种植物生长调节剂联合使用，基本培养基和植物生长调节剂综合作用，诱导非洲菊的外植体，使其不经过愈伤组织，而直接产生体细胞胚，得到再生植株。

本发明的分化培养基中，大量元素含量较低，而铁盐浓度较高，维生素B6、维生素B1和烟酸添加量保持较高浓度，并添加了水解酪蛋白。原因是：MS培养基中，无机盐浓度较高，实验中发现，含较高浓度无机盐的培养基对非洲菊小芽的生长有抑制和毒害现象，不利其进一步生长；而较高浓度的有机物可为小苗生长提供充足的有机氮源等营养成分，有利于小苗的进一步生长；适当增加铁盐浓度，也可稳定供应此阶段所需的铁素，促进细胞的分裂与伸长。铁还影响到叶绿体的结构组成与叶绿素形成，缺铁时，小苗会有失绿症状出现。

在分化培养基中添加较低浓度的温和的细胞分裂素KT和生长素吲哚乙酸IAA，对小苗离开高浓度生长调节剂后的生长，具有一定的缓冲作用，小苗能生长良好，但如果激素浓度稍高，则不利于成苗，容易长愈伤或小芽增殖。

植物的体细胞胚胎(简称体细胞胚)发生是指体细胞在特定的条件下，不是经过细胞融合，而是通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程，此过程中形成类似合子胚的结构，发育成为体细胞胚，体细胞胚具有两极性，在发育的早期阶段，从方向相反的两端分化出茎端和根端，因此，小芽成苗相对容易。而通过愈伤组织分化的不定芽是单向极性的，不定芽需进行诱导生根培养，才能获得再生植株。

而由器官发生途径获得再生植株时，一般也需要先诱导成芽，然后诱导芽生根形成再生植株。器官发生的植株常是多细胞起源的，特征上可能是嵌合的，不利于优良性状的保存和纯化。

因此，利用本发明进行非洲菊组织培养培育种苗，可简化培养程序、缩短培养周期、提高种苗质量。本发明可为大量离体繁殖优质种苗及非洲菊的转基因研究提供基础材料。

本发明的有益效果：

1)本发明利用非洲菊的幼小花托整体作外植体，通过诱导体细胞胚途径再生植株，避免了通过愈伤组织途径得到再生植株时难度大及容易发生植株突变的问题。

2)本发明利用直径为4-7mm的幼小非洲菊花托为外植体，取材容易，又不影响母株的正常生长，为成功诱导体细胞胚提供了良好的基础材料。

3)植物新发生的组织或器官相对幼嫩、生命力旺盛，本发明以幼小花托作外植体，其体积小，生命活力强，加上对培养物前期进行弱光照培养，大大控制了培养物的褐化现象；1周后及时转移至强光照培养又为体细胞胚的成功诱导及生长发育提供了良好的光照条件。

4)本发明在非洲菊体胚苗的培养过程中，由于在前期体细胞胚形成过程中具两极性特征，因此，无需特意诱导生根，成苗率高。

5)利用本发明的方法诱导非洲菊体细胞胚，具有获得体细胞胚速度快、数量多，结构完整的特点，可为大量离体繁殖优质种苗及其转基因研究提供基础材料，对非洲菊离体组织培养研究进程及其基因工程育种具有促进作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中的幼小花蕾。

图2为本发明实施例1中发育过程中的球形胚。

图3为本发明实施例1中发育过程中的心形胚。

图4为本发明实施例1中发育过程中的鱼雷形胚。

图5为本发明实施例1中发育过程中的子叶形胚。

图6为本发明实施例1中的再生植株(体胚苗)。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株

1)配制本发明的用于诱导非洲菊体细胞胚的培养基，配方如表3所示。

表3

其中，诱导培养基中添加蔗糖35g/L；琼脂粉6.5g/L，pH＝5.8-6.0。

2)选取生长健壮、无病虫害的非洲菊幼小花蕾(直径为5-6mm，见图1)，用流水冲洗30min后，再用洗洁精水搅拌清洗，再在超净台上用70％(体积比)酒精消毒30-60s，然后用0.1％(体积比)HgCl₂消毒10min，最后用无菌水冲洗5次，吸干其表面水分待用。

3)在超净台上，用解剖刀剥去小花蕾上的花萼和小花序，并切去其外表层。

4)将花托整体接种到步骤1)配制的诱导培养基中，进行弱光照培养7d，光照强度为300-500lx。

5)7天后将步骤4)的培养物置于强光照培养，光照强度为2400-2800lx，培养45-50d后即可获得非洲菊体细胞胚，体细胞胚诱导率达55.6％，继续培养10-15d，体细胞胚(最初为球形胚见图2)逐渐萌发变为心形胚(见图3)、鱼雷形胚(见图4)、子叶形胚(见图5)，最终成芽。

6)将萌发2-3片叶的非洲菊体胚小芽转接于分化培养基，在分化培养基上，小芽不断生长发育，且叶片数逐渐增多，并且，基部形成根系，30d后获得再生植株(见图6)，成苗率达100％，

其中，分化培养基的组分如表4所示：

表4

此外，分化培养基中还添加蔗糖30g/L，琼脂粉6.0g/L，pH为5.8。

在本实施例中，外植体培养、体细胞胚诱导及植株再生过程中，培养室温度均为24-26℃。

实施例2通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法

参照实施例1的培养过程，除将表1诱导培养基中的植物生长调节剂部分的含量调整为表5所示含量外，其余步骤同实施例1。

表5

植物生长调节剂	用量mg/
		6-BA	7
KT	0.8
		TDZ	0.05
NAA	0.4
		PIC	0.3

其中，mg/L表示每升培养基中含各成分的毫克数，培养基中蔗糖30g/L；琼脂粉6.5，pH＝5.8-6.0。

体胚诱导率为45.5％，小芽的成苗率为100％。

利用本发明进行非洲菊组织培养培育种苗，可简化培养程序、缩短培养周期、提高种苗质量，本发明可为非洲菊的大量离体繁殖优质种苗及转基因研究提供基础材料。

Claims (4)

1.一种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)选取非洲菊花蕾，清洗，70％酒精消毒30-60s，0.1％HgCl₂消毒8-14min，用无菌水冲洗，吸干表面水分待用；

2)剥去非洲菊花蕾上的花萼和小花序，得到花托，并切去花托的外表层，作为外植体；

3)将步骤2)的外植体整体接种到诱导培养基中，弱光照培养5～8天；

4)将步骤3)培养的外植体置于强光照下培养，培养45-50天，获得非洲菊体细胞胚，继续培养10-15天，体细胞胚逐渐萌发，形成小芽；

5)将萌发2-3片叶的非洲菊体胚小芽转接于新鲜的分化培养基上，小芽不断生长发育，叶片数逐渐增多，基部形成根系，获得再生植株；

其中，步骤3)所述诱导培养基的组分为：

其中，每升诱导培养基添加蔗糖30-40克，琼脂粉6.5-8.0克；所述诱导培养基pH＝5.5-6.5；

其中，步骤5)所述的分化培养基组分如下：

其中，每升分化培养基添加蔗糖25-35克，琼脂粉6.5-7.0克；所述分化培养基pH＝5.5-6.5。

2.根据权利要求1所述的通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，其特征在于，步骤1)中，所述非洲菊花蕾直径为4-7mm，清洗前于4-6℃冷藏处理24-48h。

3.根据权利要求1所述的通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，其特征在于，步骤3)中，所述弱光照培养的光照强度为300-500lx，培养温度23-26℃。

4.根据权利要求1所述的通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，其特征在于，步骤4)中，所述强光照培养的光照强度为2400-2800lx，培养温度23-26℃。