CN1155308C - 一种抗水稻白叶枯病育种材料的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于新品种选育技术领域，具体涉及一种抗水稻白叶枯病育种材料的选育方法。其特点是，将栽培稻和疣粒野生稻的原生质体分别通过以碘乙酰胺(IOA)和X-射线处理，通过不对称细胞融合得到再生植株，并与栽培稻进行回交。以RAPD、白叶枯病菌株接种鉴定、荧光原位杂交、抗性基因拟合指纹分析对植株进行鉴定，确定抗白叶枯病水稻育种材料。
Description
技术领域
本发明属于农作物新品种新材料的选育方法范畴，其国际专利分类号为A01H1/02。
背景技术
野生稻是重要的品种资源。野生稻的许多重要的农艺形状，如高抗病虫性，可以在水稻的育种上得到应用。但是，由于生殖及遗传的隔离，野生稻与栽培稻之间的遗传交流是很困难的，这给野生稻在育种上的应用造成了障碍。随着现代生物技术的发展，打破野生稻与栽培稻间的隔离，从而使它们之间实现遗传交流已成为可能。我国科学家丁颖于1929年应用杂交法就得到了普通野生稻(O. rufipogon)和栽培稻之间的杂种，并从中选育得到品种中山1号，在生产中得到大面积的推广应用(林世成，闵绍楷主编，1971，中国水稻品种及其系谱，上海科学技术出版社，P254-256)。国际水稻研究所(IRRI)的科学家曾得到尼瓦拉野生稻(O.nivana)和栽培稻间的杂种，并培育出抗草矮病的系列品种(Kush G S，Disease and insectresistance in rice，1977，Adv Agron，29：265-341)。1990年人们又将药用野生稻(O.officinalis)中抗稻飞虱的特性转移到了栽培稻中(Jena K K et al，Introgression of genes from Oryzaofficinalis wall ex watt to cultivated rice Oryza sativa L.，Theor Appl Genet 80：737-745)。之后，我国学者又将紧穗野生稻(O. eichingeri)中抗稻飞虱的特性转移到了栽培稻中(颜辉煌等，1997，紧穗野生稻的褐飞虱抗性导入栽培稻的研究，遗传学报，24(5)：424-431)。1995年美国和中国科学家联手从长花药野生稻(O.longistaminata)和栽培稻的后代群体中克隆到抗白叶枯病的基因(Song W Y et al，A receptor kinase-like protein encode by the rice disease geneXa-21，Science，1995，1804-1806)。应用细胞融合方法人们在水稻上已得到许多特异材料，它们包括水稻和稗草(Echinochlod oryzicola Vasing)(Terada R et al，Plant regeneration fromsomatic hybrid of rice(Oryza sativa L.)and barnyard grass(Echinochlod oryzicola Vasing)，MolGen Genet，1987，210：39-43)、水稻和大黍(Panicum maximim)(辛化伟等，水稻与大黍不对称体细胞杂交再生植株，植物学报，1997，38：(8)717-724)的后代材料。
本发明所采用的野生稻材料为我国仅存的三个野生稻种之一的疣粒野生稻(O.meyeriana)。该野生稻种的染色体组和栽培稻的染色体组不同。疣粒野生稻对白叶枯病的抗性接近免疫水平，同时对稻飞虱和螟虫具有抗性。至今为止，人们除将疣粒野生稻原生质体再生成植株外(何光存等，疣粒野生稻体细胞超低温保存与原生质体培养体系的确立，中国科学C辑，1998，28(5)：444-449)，尚未有将其和栽培稻细胞融合成功的报道。目前，采用常规的杂交育种法是很难将两者的遗传基础结合起来的。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术的不足，提出一种抗水稻白叶枯病育种材料的选育方法，通过不对称细胞融合得到抗水稻白叶枯病育种材料，以提高抗水稻白叶枯病育种的效率。
一种选育抗水稻白叶枯病育种材料的方法，它包括下列的步骤，
1)分别建立栽培稻和疣粒野生稻的细胞悬浮系，取继代培养3天的悬浮细胞以酶液，所说的酶液配比如下：0.25％(w/v)纤维素酶RS；0.01％(w/v)果胶酶Y-23，；5mM吗林乙基磺酸，；13％(w/v)甘露醇；细胞洗涤液，pH 5.6。用所说的酶液酶解，得到原生质体；
2)用浓度为2-5mol/l的碘乙酰胺处理栽培稻的原生质体10-20分钟，获得钝化栽培稻的原生质体的细胞质，以照射剂量强度为2-5×104拉特的X-射线处理疣粒野生稻的原生质体40-80分钟，获得钝化疣粒野生稻的原生质体的细胞核；
3)将处理过的栽培稻和疣粒野生稻的原生质体在融合仪上进行融合处理，其参数为：直流电流300-400v；波宽5-20μs；脉冲重复2-4；脉冲间隔0.5-1s；交流电流20-50v；
4)将步骤3)获得的材料在含KM8P的低熔点琼质糖中包埋培养一个月，将可见克隆转移到含BA的N6培养基上作分化培养，然后将分化出的幼苗在无激素的MS培养基上进行生根培养，幼苗长至10cm高时移栽到土壤中，从亲本的叶片中提取DNA，将引物和随机扩增多态性(RAPD)差异方法扩增亲本DNA，获得引物在亲本间的多态性，将所获得的杂种植株用栽培稻进行回交得到杂种植株，然后采用抗性基因拟合(RGA)引物PTO对所获抗白叶枯病水稻材料进行指纹分析，或者取步骤4)的植株根尖作染色体制片，并用原位杂交法(FISH)检测所述的栽培稻和疣粒野生稻杂种的染色体，筛选具有染色体杂交信号的栽培稻和疣粒野生稻的材料；将所筛选出的抗白叶枯病杂种阳性植株做抗白叶枯病鉴定；
5)从所述步骤4)中所筛选出的抗白叶枯病杂种阳性植株中剪叶接种水稻白叶枯病菌，鉴定它们是否具有抗水稻白叶枯病的特性，验证所获的高抗白叶枯病的水稻材料。
本发明中所描述的通过不对称融合法将栽培稻和疣粒野生稻原生质体结合在一起，并得到高抗白叶枯病水稻材料OME-1，是前人未曾实现过的。同时，对于栽培稻和疣粒野生稻的细胞融合来讲，将多种分子生物学方法应用于融合杂种的鉴定具有新颖性。高抗白叶枯病水稻材料OME-1的创造必将对抗白叶枯病水稻品种的选育起重要的推动作用。
具体实施方式
实施例1
将继代培养3天后的栽培稻和疣粒野生稻的悬浮细胞以酶液酶解，得到原生质体。用浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mol/L的碘乙酰胺(IOA)对栽培稻的原生质体处理15分钟，钝化栽培稻的原生质体的细胞质。以终止第二次细胞分裂的细胞占培养细胞总数的百分率DIP(％)为细胞钝化指标。结果表明：在0-3mol/I的IOA浓度范围内，随着IOA浓度的提高，DIP(％)会逐步降低。当IOA浓度在2-4mol/l范围时，栽培稻的原生质体的细胞质可以得到钝化。
实施例2
以照射剂量强度为3.5×104拉特的X-射线对疣粒野生稻的原生质体分别进行不同时间的处理(20、30、40、50、60、70、80、90分钟)，以便提供钝化疣粒野生原生质体的细胞核所应使用的X-射线在特定剂量下的处理时间。以在X-射线处理后培养7天时疣粒野生稻原生质体的细胞核的第二次分裂终止的细胞占培养细胞总数的百分率DIP(％)为细胞核钝化指标。结果表明，当剂量强度为3.5×104拉特的X-射线对疣粒野生稻原生质体照射60-80分钟时，DIP(％)为零，即疣粒野生稻原生质体的细胞核可以得到钝化。
实施例3
用浓度为2.5mol/L的碘乙酰胺(IOA)对栽培稻的原生质体处理15分钟，钝化栽培稻的原生质体的细胞质。以照射剂量强度为3.5×104拉特的X-射线对疣粒野生稻的原生质体处理60分钟，钝化疣粒野生稻的原生质体的细胞核。对处理过的栽培稻和疣粒野生稻的原生质体在融合仪上进行融合处理。其参数为：直流电流(VDC)400v；波宽10μs；脉冲重复4；脉冲间隔0.5s。在以上参数固定的情况下，交流电流(VAC)的设置为10、20、30、40、50v，观察双细胞融合率(％)。结果表明：当VAC(v)为40v时，双细胞融合率最高。低于40v时由于电场强度不够，细胞间的吸引力较小，细胞融合率低；过高的VAC则易引起多细胞融合。
实施例4
再生得到的植株经RAPD鉴定后，以阳性植株接种白叶枯病菌株。菌液浓度为2亿/毫升，以剪叶法接种，调查结果如表1。
表1 高抗白叶枯病材料OME-1对不同白叶枯病菌株的反应
水稻材料 白叶枯病菌株 病级
Pxo 86 1
疣粒野生稻 Pxo 99 1
Pxo 79 1
Pxo 86 6
IR24 Pxo 99 6
Pxo 79 6
Pxo 86 1
OME-1 Pxo 99 1
Pxo 79 1
由此可见OME-1的病级和疣粒野生稻的一样，均为1，这说明OME-1 已获得对参试白叶枯病菌株的抗性。
在创造新的抗白叶枯病种质方面，本发明所述的原生质体不对称融合法与常规育种方法相比具有如下优点：
1)能克服栽培稻与野生稻间的生殖隔离，实现它们间遗传物质的交流。
2)能得到核质杂种，并易于实现染色体间的重组。
3)由于配套鉴定技术的应用，从而使育种效率大为提高。
Claims (1)
1、一种选育抗水稻白叶枯病育种材料的方法，其特征在于，
1)分别建立栽培稻和疣粒野生稻的细胞悬浮系，取继代培养3天的悬浮细胞以酶液，所说的酶液配比如下：0.25％(w/v)纤维素酶RS；0.01％(w/v)果胶酶Y-23，；5mM吗林乙基磺酸，；13％(w/v)甘露醇；细胞洗涤液，pH 5.6，用所说的酶液酶解，得到原生质体；
2)用浓度为2-5mol/l的碘乙酰胺处理栽培稻的原生质体10-20分钟，获得钝化栽培稻的原生质体的细胞质，以照射剂量强度为25×104拉特的X-射线处理疣粒野生稻的原生质体40-80分钟，获得钝化疣粒野生稻的原生质体的细胞核；
3)将处理过的栽培稻和疣粒野生稻的原生质体在融合仪上进行融合处理，其参数为：直流电流300-400v；波宽5-20μs；脉冲重复2-4；脉冲间隔0.5-1s；交流电流20-50v；
4)将步骤3)获得的材料在含KM8P的低熔点琼质糖中包埋培养一个月，将可见克隆转移到含BA的N6培养基上作分化培养，然后将分化出的幼苗在无激素的MS培养基上进行生根培养，幼苗长至10cm高时移栽到土壤中，从亲本的叶片中提取DNA，将引物和随机扩增多态性差异方法扩增亲本DNA，获得引物在亲本间的多态性，将所获得的杂种植株用栽培稻进行回交得到杂种植株，然后采用抗性基因拟合引物PTO对所获抗白叶枯病水稻材料进行指纹分析，或者取步骤4)的植株根尖作染色体制片，并用原位杂交法检测所述的栽培稻和疣粒野生稻杂种的染色体，筛选具有染色体杂交信号的栽培稻和疣粒野生稻的材料；将所筛选出的抗白叶枯病杂种阳性植株做抗白叶枯病鉴定；
5)从所述步骤4)中所筛选出的抗白叶枯病杂种阳性植株中剪叶接种水稻白叶枯病菌，鉴定它们是否具有抗水稻白叶枯病的特性，验证所获的高抗白叶枯病的水稻材料。
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