CN1332597C - 水稻白叶枯病菌小种划分方法 - Google Patents
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Abstract
利用已知抗病基因的6个近等基因系材料对水稻白叶枯病菌的小种进行划分和鉴别。在水稻孕穗期，以浓度约为3×108cfu/ml的菌悬液对水稻主茎平展剑叶进行剪叶法接种，接种2周和3周后分别测量病斑长度和病叶全叶长度，以3周后调查的病斑长度小于接种叶长的四分之一为抗病(R)，反之大于等于接种叶长的四分之一为感病(S)。根据病原菌分别在水稻品种IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24上的互作结果，对应9个小种R1-R9的互作模式，将白叶枯菌株对应划分为相应的小种。
Description
(一)技术领域
本发明为水稻白叶枯病菌小种划分方法，专用于对水稻白叶枯病菌小种进行划分和鉴别，从而及时准确地掌握水稻白叶枯病菌小种组成和优势小种的分布，以便水稻白叶枯病抗病育种和田间品种的合理布局，同时也有利于对各国小种进行比较和研究。
(二)背景技术
水稻白叶枯病是亚洲和太平洋地区水稻生产上最重要的细菌性病害之一。抗病品种的培育和利用是控制该病害的最经济、有效的措施，但抗病基因的鉴定、抗病品种的培育和筛选以及品种的合理布局等都依赖于对病原菌小种分化的研究。
病原菌致病力分化的研究通常是根据病原菌在含不同已知抗病基因的鉴别品种上反应类型将其区分为不同的小种或致病型(Mew等，1987)。水稻白叶枯病菌致病力分化的研究最早是由日本的久原重松在1958年开始的，但早期所利用的鉴别品种的遗传背景(即含有的抗病基因)并不十分清楚，白叶枯病菌小种或致病型的划分有较大的随意性，鉴别品种的增减会使同一个菌株归于不同的小种或致病型。因而，尽管这些鉴别品种可以较好的将不同致病力的菌株区别开来，但这并不能真正反映病原菌致病力分化的情况(Horino等，1980)。如1969年，Kozaka根据在不同品种上的反应类型，将日本的白叶枯病菌区分为三个群；Ezuka和Horino(1974)在增加了鉴别品种之后进一步分为五个群。欧世璜、苗东华最初将菲律宾的白叶枯病菌分为四个致病群，后来发现了一个具有很好鉴别能力的品种后，又将第一致病群再分为两群，并称之为“生理小种”。
从1985年开始，本实验室和江苏省农科院、广东省农科院、中国农科院等单位在各自研究工作的基础上成立了我国白叶枯病菌致病型研究协作组，根据在IR26、JV14、NG15、Tetep和JG30等五个基本的鉴别品种上的反应将我国的白叶枯病菌分为7个致病型(方中达，许志刚等，1990)。但所用的鉴别品种遗传背景不一致，所含的抗病基因并不完全清楚，对接种时间和叶位也没有严格要求。因而各地区小种的划分不仅随意性大，而且结果也很难与国内其它地区及国外进行比较。接种方法的不科学也可能导致结果缺乏准确性和可靠性。
(三)发明内容
技术问题 本发明在利用遗传背景一致、含不同抗病基因的近等基因系材料对我国水稻白叶枯病菌致病力分化进行研究的基础上，提供水稻白叶枯病菌接种、调查、数据分析和小种划分的标准方法，从而及时准确地掌握水稻白叶枯病菌小种组成和优势小种分布，为水稻白叶枯病抗病育种和田间品种的合理布局提供技术支撑。
技术方案
本发明水稻白叶枯病菌小种划分方法，包括：
1.水稻品种的准备：已知抗病基因的6个近等基因系材料，见表1。将参试水稻品种以规定的次序移栽到每个划定的小区，每个品种栽插1行，单株栽插，株行距为25×20cm，4月中旬浸种育秧，5月中旬移栽。
表1.参试水稻鉴别品种及其所包含的抗性基因
| 水稻品种 | 抗性基因 | 水稻品种 | 抗性基因 |
| IRBB2 | Xa2 | IRBB13 | xa13 |
| IRBB3 | Xa3 | IRBB14 | Xa14 |
| IRBB5 | xa5 | IR24 | 轮回亲本 |
2.参试菌株的准备：取出冻干保存的原始菌株，移植两代后在汕优63上预接种，从中选出有活力的菌株作为参试菌株。接种前两天取出参试菌株，在NA斜面上划线，28度生长48小时后接种。NA培养基配方：牛肉浸膏3g，酵母提取物1g，多聚蛋白胨5g，蔗糖10g，琼脂17g，加水定容至1000mL，调pH至7.0。
3.接种：接种前，以无菌水洗脱菌落，悬浮均匀，调整菌悬液浓度约为3×108cfu/ml。用预先灭菌处理的、型号一致的平口剪刀沾取菌悬液(沾菌悬液时应张开剪刀，以使刀刃上能沾到菌悬液)，选取主茎剑叶平展叶片，剪刀平置，刀尖稍向上，剪去叶失2-3cm，每个水稻品种接种10片叶。接种过程中，每接种一个菌株要换一把处理过的剪刀。
4.病情调查：接种2周和3周后分别测量病斑长度和该叶片的全长，每个菌株测量10张叶片。以3周后调查的病斑长度小于接种叶长的四分之一为抗病(R)，反之大于等于接种叶长的四分之一为感病(S)。
5.小种划分：用含不同抗病基因的水稻近等基因系品种IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24作为鉴别品种，根据病原菌菌株与这些鉴别品种的互作反应，将白叶枯菌株划分为相应的9个小种。对应9个小种R1-R9的互作模式为，R1：抗抗抗抗抗抗；R2：抗抗抗抗抗感；R3：抗抗抗抗感感；R4：抗抗抗感感感；R5：抗抗感感感感；R6：抗感抗抗抗感；R7：抗感感抗抗感；R8：抗感感感感感；R9：感感感感感感。
有益效果 本方法与国内其它同类研究相比优点表现在：
(1)水稻鉴别品种遗传背景一致：由于以前所用的鉴别品种系统所含的抗病基因并不完全清楚，因而各个国家或地区小种的划分不仅随意性大，而且结果也缺乏可比性。利用已知抗病基因的近等基因系(单基因)材料有效地解决了这个问题。
(2)参试菌株的代表性更强：选用了全国23个省或自治区的285个菌株作为参试菌株。其中，1990年以前的菌株108个，2003-2004年采集的菌株177个。小种的划分不仅反映了目前生产上病原菌致病力的分化，也在一定程度上揭示了稻白叶枯病菌菌致病力分化的变异过程。
(3)接种叶位一致：采用孕穗期对平展剑叶进行剪叶接种。根据调查，接种叶片部位不同，病斑扩展速度不同，病斑长度相差较大。接种初期下部叶片的病斑扩展速度要快于上部叶片，后期则相反。
(4)调查数据更准确，可靠：叶位不同，叶片长度也不相同。因此，在测量病斑同时也测量了该叶片的总叶长，并且在接种2周和3周后分别调查病情以期相互验证。
具体实施方式
1.已知抗病基因的24个水稻品种来自中国水稻所，是国际水稻所(IRRI)培育出的一套近等基因系材料，见表2。将参试水稻品种以规定的次序移栽到每个划定的小区，每个品种栽插1行，单株栽插，株行距为25×20cm，4月中旬浸种育秧，5月中旬移栽。
表2.参试水稻品种及其所包含的抗性基因
| 水稻品种 | 抗性基因 | 水稻品种 | 抗性基因 |
| IRBB1IRBB2IRBB3IRBB4IRBB5IRBB7IRBB8IRBB10IRBB11IRBB13IRBB14IRBB21 | Xa1Xa2Xa3Xa4xa5Xa7Xa8Xa10Xa11xa13Xa14Xa21 | IR24IRBB50IRBB51IRBB52IRBB53IRBB54IRBB55IRBB56IRBB57IRBB58IRBB59IRBB60 | 轮回亲本Xa4+xa5Xa4+xa13Xa4+Xa21xa5+xa13xa5+Xa21xa13+Xa21Xa4+xa5+xa13Xa4+xa5+Xa21Xa4+xa13+Xa21xa5+xa13+Xa21Xa4+xa5+xa13+Xa21 |
除了不使用杀菌剂外，种子浸种、催芽，田块的耕作、施加底肥以及田间的管理与常规的水稻种植相同。
2.参试菌株的准备：取出冻干保存的原始菌株，移植两代后在汕优63上预接种，从中选出有活力的285个菌株作为参试菌株，见表3。接种前两天取出参试菌株，在NA斜面上划线，28度生长48小时后接种。NA培养基配方：牛肉浸膏3g，酵母提取物1g，多聚蛋白胨5g，蔗糖10g，琼脂17g，加水定容至1000mL，调pH至7.0。
表3：参试菌株与来源
| 菌株 | 来源 | 菌株 | 来源 | 菌株 | 来源 | 菌株 | 来源 |
| AH2AH3AH4AH5AH6AH7AH8AH9 | 安徽安徽安徽安徽安徽安徽安徽安徽 | HEN11HEN14HeN03-02HeN03-03HeN03-05HeN03-06HeN03-08HeN03-10 | 河南河南河南河南河南河南河南河南 | JL3JL31JL32JL4JL6JL7LYG03-11LYG03-13 | 吉林吉林吉林吉林吉林吉林江苏江苏 | YN31YN6YN08YN09YN34YN38YN41YN42 | 云南云南云南云南云南云南云南云南 |
| AH10AH11AH12AH13BJ84-3OS-44OS77FJ15FJ22FJ21FJ24JSI04-1OS-59OS34FuJGD414GD417296GD32GD03-01GD401GD402GD403GD404GD405GD406GD407GD408GD409GD410GD411GD412GD413GD415GD416OS-37GD38OS109GX325GX56GX23OS54GX277GX49 | 安徽安徽安徽安徽北京北京北京福建福建福建福建福建福建福建福建广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广东广西广西广西广西广西广西 | HeN03-11HeN03-12HeN03-19HeN03-01HeN03-04HeN03-09HeN03-14HeN03-15HeN03-16HeN03-18HeN03-20OS15HLJ85-69HuB8417HuB03-01HuB03-02HuB03-03HuB03-04HuB03-06HuB03-07HuB03-08HuB03-10HuB03-09HuN03-03OS26HuN30HuN35HuN36HuN39HuN40HuN03-0 1HuN03-02HuN31HuN32HuN33HuN34HuN37HuN38OS27HN-7JL1JL33JL14JL18 | 河南河南河南河南河南河南河南河南河南河南河南河南黑龙江湖北湖北湖北湖北湖北湖北湖北湖北湖北湖北湖北湖北湖南湖南湖南湖南湖南湖南湖南湖南湖南湖南湖南湖南湖南湖南湖南吉林吉林吉林吉林 | LYG03-04LYG03-07LYG03-09LYG03-10LyG03-01LYG03-02LYG03-03LYG03-05LYG03-06LYG03-08LYG03-12LYG03-18172OS-172OS-801江宁XOJS127-5KS-2-2OS-57Ks6-64KsI-39#2LN8547295NX-4OS224SC-4ScHy-bScYc-aScYc-bOS166OS-6YN14YN18YN19YN21YN8YN03-02YN03-03YN03-06YN03-08 | 江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江苏江西辽宁宁夏宁夏陕西四川四川四川四川四川天津云南云南云南云南云南云南云南云南云南 | YN03-05YN03-13YN17YN23YN39YN4YN43YN5YN7YN03-11YN03-22YN11YN12YN13YN26YN40YN44YN03-01YN16YN27YN30YN32YN24ZJ05Z173ZJ25ZJ27ZJ16ZJ26ZJ28OS185OS82JS147-4OS181JS158-2OS48ZPY1OS-225OS182JS69KSI-11OS-144S-2LFX325 | 云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南浙江浙江浙江浙江浙江浙江浙江浙江浙江浙江浙江浙江浙江浙江浙江浙江未知未知未知未知未知 |
| GX09GX1GX2OS189OS169G7OS86OS-93OS198G8G1OS-92OS-95GZ10OS-28OS221OS70HaN1OS35HeN03-13 | 广西广西广西广西广西广西广西广西广西广西广西广西贵州贵州贵州海南海南海南海南河南 | JL24JL26JL27JL8JL17JL21JL28JL5JL11JL12JL13JL15JL16JL19JL2JL20JL22JL23JL25JL29 | 吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林吉林 | YN03-09YN03-10YN03-14YN03-15YN03-16YN03-18YN03-23YN03-24YN1YN15YN20YN22YN3YN45YN03-04YN03-07YN03-12YN03-19YN03-20YN03-21 | 云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南云南 | HUN20KW-2OS-167OS-184OS-209OS-218XS926HUN14OS-171SS69XS2OCT-7883-39HUN17OS-228XC4 | 未知未知未知未知未知未知未知未知未知未知未知未知未知未知未知未知未知 |
3.接种：接种前，以无菌水洗脱菌落，悬浮均匀，调整菌悬液浓度约为3×108cfu/ml。用预先灭菌处理的、型号一致的平口剪刀沾取菌悬液(沾菌悬液时应张开剪刀，以使刀刃上能沾到菌悬液)，选取主茎平展剑叶，剪刀平置，刀尖稍向上，剪去叶尖2-3cm，每个水稻品种接种10片叶。接种过程中，每接种一个菌株要换一把处理过的剪刀。
4.病情调查：接种2周和3周后分别测量病斑长度和该叶片的全长，每菌株测量10张叶片。以3周后调查的病斑长度小于接种叶长的四分之一为抗病(R)，反之大于等于接种叶长的四分之一为感病(S)。
5.小种划分：根据病原菌在含不同抗病基因的水稻近等基因系品种上的抗、感反应，筛选出对我国水稻白叶枯病菌致病力分化具有较好鉴别能力(抗感差异明显、稳定)的品种作为鉴别品种。所用的鉴别品种为IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24。根据病原菌菌株与这些鉴别品种的互作反应，将白叶枯病菌株划分为相应的9个小种，各小种与各鉴别品种的互作反应结果及其差异性分析结果见表4。对应9个小种R1-R9的互作模式为，R1：抗抗抗抗抗抗；R2：抗抗抗抗抗感；R3：抗抗抗抗感感；R4：抗抗抗感感感；R5：抗抗感感感感；R6：抗感抗抗抗感；R7：抗感感抗抗感；R8：抗感感感感感；R9：感感感感感感。
表4：水稻白叶枯病菌与水稻鉴别品种之间的互作关系及差异性分析
| 小种 | 水稻鉴别品种 | 毒性频率％ | |||||
| IRBB5 | IRBB13 | IRBB3 | IRBB14 | IRBB2 | IR24 | ||
| R1R2R3R4R5R6R7R8R9 | 0.9xcy(Rz)1.4c(R)1.1c(R)2.5bc(R)2.1bc(R)1.5c(R)1.6c(R)2.5b(R)18.8a(S) | 2.3d(R)4.9cd(R)6c(R)6.6c(R)5.9c(R)12.9b(S)12.5b(S)16.4a(S)12.1b(S) | 3.2c(R)4.6c(R)5c(R)4.4c(R)19a(S)6.3c(R)12.2b(S)16a(S)20.1a(S) | 4.2c(R)1.1d(R)3.6c(R)20b(S)24.6a(S)2.4cd(R)3.1cd(R)24.3a(S)25.5a(S) | 3.7e(R)3.6e(R)12d(S)19.3c(S)24.3b(S)3e(R)2.8e(R)26.2ab(S)27.8a(S) | 4.9d(R)21.2c(S)17.9c(S)22.3c(S)28.3b(S)28.6b(S)31.8ab(S)28.7b(S)35.4a(S) | 10.210.54.910.224.26.011.222.50.4 |
x对应小种在水稻鉴别品种上致病的病斑长度；
y根据FLSD(Fisher’s protected least significant difference)方法进行差异性分析，相同字母代表p＜0.01水平上差异性不显著，不同字母代表了p＜0.01上差异性显著)；
zR＝抗(接种21天后病斑长度小于叶片总长的1/4)，S＝感(接种21天后病斑长度大于或等于叶片总长的1/4).
范例1
云南地区水稻白叶枯病菌小种的划分
1)水稻鉴别品种的准备：已知抗病基因的6个近等基因系材料，见表1。将参试水稻品种以规定的次序移栽到每个划定的小区，每个品种栽插1行，单株栽插，株行距为25×20cm，根据当地常规的种植方法进行浸种、育秧、移栽以及管理。
2)参试菌株的准备：取出冻干保存的原始菌株59个，移植两代后在移植两代后在汕优63上预接种，从中选出有活力的菌株作为参试菌株。接种前两天取出参试菌株，在NA斜面上划线，28度生长48小时后接种。NA培养基配方：牛肉浸膏3g，酵母提取物1g，多聚蛋白胨5g，蔗糖10g，琼脂17g，加水定容至1000mL，调pH至7.0。
3)接种：接种前，以无菌水洗脱菌落，悬浮均匀，调整菌悬液浓度约为3×108cfu/ml。用预先灭菌处理的、型号一致的平口剪刀沾取菌悬液(沾菌悬液时应张开剪刀，以使刀刃上能沾到菌悬液)，选取主茎剑叶平展叶片，剪刀平置，刀尖稍向上，剪去叶尖2-3cm，每个水稻品种接种10片叶。接种过程中，每接种一个菌株要换一把处理过的剪刀。
4)病情调查：接种2周和3周后分别测量病斑长度和该叶片的全长，每个菌株测量10张叶片。以3周后调查的病斑长度小于接种叶长的四分之一为抗病(R)，反之大于等于接种叶长的四分之一为感病(S)。
5)小种划分：用含不同抗病基因的水稻近等基因系品种IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24作为鉴别品种，根据病原菌菌株与这些鉴别品种的互作结果，对应9个小种R1-R9的互作模式，R1：抗抗抗抗抗抗；R2：抗抗抗抗抗感；R3：抗抗抗抗感感；R4：抗抗抗感感感；R5：抗抗感感感感；R6：抗感抗抗抗感；R7：抗感感抗抗感；R8：抗感感感感感；R9：感感感感感感，将白叶枯菌株对应划分为相应的9个小种。R2为优势小种，包含了参试菌株18个，其它R1-R7，R9分别包含了参试菌株5、8、1、4、9、8、5、1个。
范例2
吉林地区水稻白叶枯病菌小种的划分
1)水稻鉴别品种的准备：已知抗病基因的6个近等基因系材料，见表1。将参试水稻品种以规定的次序移栽到每个划定的小区，每个品种栽插1行，单株栽插，株行距为25×20cm，根据当地常规的种植方法进行浸种、育秧、移栽以及管理。
2)参试菌株的准备：取出冻干保存的原始菌株30个，移植两代后在移植两代后在汕优63上预接种，从中选出有活力的菌株作为参试菌株。接种前两天取出参试菌株，在NA斜面上划线，28度生长48小时后接种。NA培养基配方：牛肉浸膏3g，酵母提取物1g，多聚蛋白胨5g，蔗糖10g，琼脂17g，加水定容至1000mL，调pH至7.0。
3)接种：接种前，以无菌水洗脱菌落，悬浮均匀，调整菌悬液浓度约为3×108cfu/ml。用预先灭菌处理的、型号一致的平口剪刀沾取菌悬液(沾菌悬液时应张开剪刀，以使刀刃上能沾到菌悬液)，选取主茎剑叶平展叶片，剪刀平置，刀尖稍向上，剪去叶尖2-3cm，每个水稻品种接种10片叶。接种过程中，每接种一个菌株要换一把处理过的剪刀。
4)病情调查：接种2周和3周后分别测量病斑长度和该叶片的全长，每个菌株测量10张叶片。以3周后调查的病斑长度小于接种叶长的四分之一为抗病(R)，反之大于等于接种叶长的四分之一为感病(S)。
5)小种划分：用含不同抗病基因的水稻近等基因系品种IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24作为鉴别品种，根据病原菌菌株与这些鉴别品种的互作结果，对应9个小种R1-R9的互作模式，R1：抗抗抗抗抗抗；R2：抗抗抗抗抗感；R3：抗抗抗抗感感；R4：抗抗抗感感感；R5：抗抗感感感感；R6：抗感抗抗抗感；R7：抗感感抗抗感；R8：抗感感感感感；R9：感感感感感感，将白叶枯菌株对应划分为相应的4个小种R1、R2、R6、R7。R7为优势小种，包含了参试菌株18个，其它R1、R2、R6分别包含了参试菌株2、6、4个。
Claims (1)
1、水稻白叶枯病菌小种的划分方法，包括：
1)水稻鉴别品种的准备：已知抗病基因的6个近等基因系材料，见表1，将参试水稻品种以规定的次序移栽到每个划定的小区，每个品种栽插1行，单株栽插，株行距为25×20cm，根据当地常规的种植方法进行浸种、育秧、移栽以及管理；
表1.参试水稻鉴别品种及其所包含的抗性基因
2)参试菌株的准备：取出冻干保存的原始菌株，移植两代后在移植两代后在汕优63上预接种，从中选出有活力的菌株作为参试菌株，接种前两天取出参试菌株，在NA斜面上划线，28度生长48小时后接种；NA培养基配方：牛肉浸膏3g，酵母提取物1g，多聚蛋白胨5g，蔗糖10g，琼脂17g，加水定容至1000ml，调pH至7.0；
3)接种：接种前，以无菌水洗脱菌落，悬浮均匀，调整菌悬液浓度为3×108cfu/ml，用预先灭菌处理的、型号一致的平口剪刀沾取菌悬液，沾菌悬液时应张开剪刀，以使刀刃上能沾到菌悬液，选取主茎剑叶平展叶片，剪刀平置，刀尖稍向上，剪去叶尖2-3cm，每个水稻品种接种10片叶；接种过程中，每接种一个菌株要换一把处理过的剪刀；
4)病情调查：接种2周和3周后分别测量病斑长度和该叶片的全长，每个菌株测量10张叶片，以3周后调查的病斑长度小于接种叶长的四分之一为抗病，反之大于等于接种叶长的四分之一为感病；
5)小种划分：用含不同抗病基因的水稻近等基因系品种IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24作为鉴别品种，根据病原菌菌株与这些鉴别品种的互作结果，对应9个小种R1-R9的互作模式，R1：抗抗抗抗抗抗；R2：抗抗抗抗抗感；R3：抗抗抗抗感感；R4：抗抗抗感感感；R5：抗抗感感感感；R6：抗感抗抗抗感；R7：抗感感抗抗感；R8：抗感感感感感；R9：感感感感感感，将白叶枯菌株对应划分为相应的小种。
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2005
- 2005-06-09 CN CNB2005100404487A patent/CN1332597C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| 中国水稻白叶枯病菌致病型的研究 方中达 许志刚 等等，植物病理学报，第20卷第2期 1990 * |
| 水稻白叶枯病菌小种分化的监测 许志刚 刘凤权 等等，中国水稻科学，第18卷第5期 2004 * |
| 水稻白叶枯病菌小种分化的监测 许志刚 刘凤权 等等，中国水稻科学，第18卷第5期 2004;中国水稻白叶枯病菌致病型的研究 方中达 许志刚 等等，植物病理学报，第20卷第2期 1990 * |
Also Published As
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