CN102450217A

CN102450217A - 一种快速获得植物纯合同源多倍体的方法

Info

Publication number: CN102450217A
Application number: CN2010105271228A
Authority: CN
Inventors: 刘剑锋; 程云清; 刘春明; 王占武
Original assignee: Jilin Normal University
Current assignee: Jilin Normal University
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2012-05-16

Abstract

本发明涉及一种快速获得植物纯合同源多倍体的方法，该方法步骤是在原生质体加倍前对原生质体进行直径测量，根据所测得的细胞直径预测融合加倍原生质体的直径变化范围；原生质体融合；对融合加倍后的原生质体进行低融点、低密度琼脂包埋，以预测的加倍原生质体的直径为标准，通过倒置显微镜活体标记目标倍性的原生质体；通过培养标记后的融合原生质体获得目标多倍体再生植株。由于采用上述方法获得多倍体性状稳定，而且从理论上可完全排除混倍体和嵌合体的存在，也为植物多倍体育种研究提供了新的技术途径。

Description

一种快速获得植物纯合同源多倍体的方法

技术领域

本发明属于植物生产技术领域，具体地讲，是涉及一种快速获得植物纯合同源多倍体的方法。本发明为直接获得纯合同源多倍体材料提供了新的方法，也为植物多倍体育种研究提供了新的技术途径。

背景技术

细胞融合是指在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个多倍体细胞的过程。人工诱导的细胞融合在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于这种技术不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。诱导细胞融合的方法有三种：生物方法(病毒)、化学方法(聚乙二醇PEG)、物理方法(电激和激光)，但是，通过这些技术获得的多为嵌合体，性状不稳定，常需多年的反复纯化才能获得具实际应用价值的纯合体，严重制约了多倍体在生产中的应用。

发明内容

本发明的目的是要提供一种快速获得植物纯合同源多倍体的方法，采用此方法获得多倍体性状稳定，而且从理论上可完全排除混倍体和嵌合体的存在。

本发明的目的是这样实现的：

该方法步骤是在原生质体加倍前对原生质体进行直径测量，根据所测得的细胞直径预测融合加倍原生质体的直径变化范围；原生质体融合；对融合加倍后的原生质体进行低融点、低密度琼脂包埋，以预测的加倍原生质体的直径为标准，通过倒置显微镜活体标记目标倍性的原生质体；通过培养标记后的融合原生质体获得目标多倍体再生植株。

所述的步骤a原生质体融合前对原生质体进行直径测量是通过苏木精染色后显微测定原生质体直径的变化范围，并根据公式预测融合加倍后原生质体直径的变化范围。

所述的步骤c低密度琼脂包埋及活体标记是融合后原生质体与等体积的37℃、1％(w/v)低融点琼脂相混合，使其分散相良好，具体混合步骤为将原生质体与等量的琼脂混合物滴入预热至37℃的培养皿中(直径60mm)，水平快速来回晃动培养皿使之平铺于底部，选择分散相好的单个原生质体，根据估算的体积在培养皿底部表面对两个细胞融合后的产物进行标记；然后向培养皿中加入0.5ml MS液体培养基，置于27℃、黑暗条件下进行培养。

所述的步骤d原生质体培养与植株再生，当单个克隆的大小长至1～2mm时，挑出转入MS培养基中获得单细胞无性系，当多细胞团进一步增大，形成肉眼可见的小愈伤组织时，进行切分形成10个左右的姊妹系。愈伤组织转入诱芽培养基和生根培养基更进一步形成完整的植株。

用染色体计数和流式细胞仪对再生植株的倍性确认，提取加倍后植株叶片各个细胞核DNA，用EPICS XL流式细胞仪测定叶片细胞的DNA含量，并通过染色体计数结果对细胞的倍性进行更进一步的确认。

所采用的活体标记技术也可用于嵌合体的分离培养获得纯合的同源多倍体材料。

由于采用上述方法获得多倍体性状稳定，而且从理论上可完全排除混倍体和嵌合体的存在，也为植物多倍体育种研究提供了新的技术途径。

具体实施方式

在本发明中，首先对分离出的原生质体进行直径测量，预测融合加倍后原生质体的直径变化范围。在此基础上，对原生质体进行融合诱导，然后对融合后的原生质体进行低融点、低密度琼脂包埋培养，以预测的融合原生质体直径为标准，通过倒置显微镜活体标记融合加倍后的原生质体，培养获得单细胞起源的纯合再生植株。通过染色体计数、流式细胞仪对再生植株的倍性进行确认。本发明为直接获得同源多倍体新材料提供了新的技术途径。

该方法具体步骤如下：

a.原生质体融合前对原生质体进行直径测量：刚分裂时细胞和中期细胞的直径分别用R_D和R_M来表示，那么，刚分裂时细胞的体积(V_D)为中期细胞体积(V_M)的一半，因此，2(4/3)(R_D/2)³＝(4/3)π(R_M/2)³，推算得出R_D＝0.7937R_M。二倍体细胞(2G细胞)的直径范围为：R_D≤R_2G＜R_M，四倍体细胞(4G细胞)的直径与R_M大致相等。因为中期细胞与间期细胞因染色体凝缩状态存在明显差异，通过苏木精染色后显微测定确定R_M的变化范围，根据公式R_D＝0.7937R_M直接计算R_D的变化范围。

b.原生质体融合，用倒置显微镜观察融合发生的过程，拍照记录并统计两个原生质体融合发生的比例。融合方法可采用PEG-6000介导融合，电击仪进行诱导融合等。

c.融合后原生质体调节至一定的密度(密度范围是5×10³～5×10⁵个·ml^-1)使其与等量体积的37℃、1％(w/v)低融点琼脂相混合后分散相良好。具体混合步骤为将原生质体与等量的琼脂混合物滴入预热至37℃的培养皿中(直径60mm)，水平快速来回晃动培养皿使之平铺于底部，选择分散相好的单个原生质体，根据估算的体积在培养皿底部表面对两个细胞融合后的产物进行标记。然后向培养皿中加入0.5mL MS液体培养基，置于27℃、黑暗条件下进行培养。

d.原生质体培养与植株再生：当单个克隆的大小长至1～2mm时，挑出转入MS培养基中获得单细胞无性系，MS培养基含40g·L^-1蔗糖，7g·L^-1琼脂。随机选择一个起源于两个原生质体的融合产物的单细胞无性系。当多细胞团进一步增大，形成肉眼可见的小愈伤组织时，进行切分形成10个左右的姊妹系，愈伤组织转入诱芽和生根培养基中更进一步诱导成完整的多倍体植株。

e.倍性流式分析与染色体计数：提取叶片细胞核DNA，用流式细胞仪测定叶片细胞的DNA含量，并通过染色体计数结果对细胞的倍性进行更进一步的确认。

另外，所采用的活体标记技术也可用于嵌合体的分离和纯合体的培养。

以下，将通过实施例对本发明作说明。

实施例1：

PEG介导高山红景天原生质体融合获同源四倍体研究

材料与方法：

供试高山红景天Rh.sachalinensis来自吉林省长白山岳桦林，由通化师范学院制药与食品科学系于俊林教授鉴定。播种获得幼苗后，取叶片进行愈伤组织的诱导。愈伤组织无性系保存于MS培养基中，培养基含40g·L^-1的蔗糖，7g·L^-1琼脂，每个月继代1次。在原生质体分离纯化前，愈伤组织转入液体MS培养基中，培养基含50g·L^-1的蔗糖，1.5mg·L^-1谷氨酰胺，培养的摇瓶转速为120r·min^-1。细胞悬浮液每两周继代1次，继代3次后用于原生质的分离。并测量原生质体的直径变化范围，分别用最大、最小原生质体直径来代表4G与2G原生质体的直径，检验测量结果与公式R_D＝0.7937R_M吻合程度，比较细胞体积与原生质体体积的差异，并计算两个原生质体融合后直径的变化范围。

以分离的高山红景天愈伤组织原生质体为材料，进行40％PEG6000介导的原生质体融合，融合后原生质体的密度分别调节至5×10³，1×10⁴，5×10⁴，1×10⁵，5×10⁵个·mL^-1，使其与等量体积的37℃、1％(w/v)低融点琼脂相混合制作平板。根据估算的体积在分散相良好的培养皿底部表面对两个细胞融合后的产物进行标记。然后向培养皿中加入0.5mL MS液体培养基，置于27℃黑暗条件下进行愈伤诱导。诱导出的愈伤组织再经过芽诱导培养基和生根培养基培养获得完整的多倍体植株。

结果与讨论：

对细胞、细胞融合前原生质体直径进行了测量。经苏木精染色后，中期细胞的R_M为22.1μm，根据公式R_D＝0.7937R_M，计算得R_D＝17.5μm，而实际测得的细胞最小直径平均为17.7μm，与公式预测值的R_D结果大致吻合。对刚分离出的原生质体直径进行拍照与测量，用最大、最小直径分别替代R_M与R_D，结果表明其最大、最小直径分别为21.3，16.7μm，其结果与公式R_D＝0.7937R_M也大致相符。原生质与细胞相比较，其R_M与R_D值相对小一些，这应与细胞在载玻片上压片后测量时细胞受压变形有关。

原生质体的最大、最小值分别为21.3，16.7μm，那么，两个原生质体融合后产物的最小体积为V_min＝2×(4/3)π(16.7/2)³，最大体积为V_max＝2×(4/3)(21.3/2)³，考虑到原生质体在溶液中为球体，因此，可计算出两个原生质体融合后产物最小与最大直径分别应为：21.0与26.8μm。对挑出的细胞克隆细胞大小进行了检测，结果如表表明：二倍体的2G、4G细胞直径分别为17.4，22.3μm；四倍体的2G、4G细胞直径分别为28.2，34.9μm。四倍体细胞的直径明显大于二倍体。其中，二倍体细胞直径与表1的结果相近。然而，四倍体细胞的直径与表1中所预测的结果则有较大的差异，这表明原生质体融合后产生的四倍体经细胞壁再生与细胞分裂后，其实际细胞体积并非是简单的二倍体细胞体积的相加。染色体计数的结果表示，高山红景天二倍体细胞染色体数目为26，四倍体细胞染色体数目为52。

实施例2

原生质体活体标记技术分离高山红景天嵌合体获得纯合的多倍体植株材料与方法：供试初始材料为长白山野生高山红景天(Rhodiolasachalinensis)种子，由通化师范学院制药与食品科学系于俊林教授鉴定。取种子约10.0g，用500mg/L GA₃中浸泡30min，然后转入垫双层灭菌滤纸、直径7cm的培养皿中，加入2～3ml无菌水润湿滤纸，盖上培养皿盖，置25℃培养箱中进行暗培养，3d后约10％种子刚露白。干燥滤纸吸除种子附着水分，转入质量浓度为0.05％，0.1％，0.2％和0.3％的秋水仙素溶液中进行处理，处理时间为24h，48h和72h。以不加秋水仙素的处理作为对照。共计13个处理，每个处理3次重复，每次重复用种子1000粒。统计萌发率、死亡率、诱变率、气孔直径、气孔密度并对染色体进行计数：播种前用自来水反复浸洗种子多次以去除残余秋水仙素。种子播于盛7.0kg过筛细土的塑料桶中，用透光塑料薄膜扎紧塑料桶上口保湿，置光照强度为1000～2000lx，每天光照约10h的温室中进行培养。播种2周后计算萌发率和死亡率，萌发率＝幼苗数×100％/播种种子数，死亡率＝播种后2个月后存活幼苗数×100％/播种2周时存活幼苗数。播种后第3周去除塑料膜，播种2个月后，诱变再生苗长至2～4片叶，测定气孔大小和密度，气孔密度(个/mm²)＝气孔个数(个)/面积(mm²)；诱变率＝气孔变异植株数×100％/气孔检测植株数。

四倍体无性系建立：以未加倍与加倍处理的植株叶片为材料，进行原生质体分离与纯化，纯化后的原生质体调节至5×10⁴，使其与等量体积的37℃、1％(w/v)低融点琼脂相混合后分散相良好。根据估算的体积在培养皿底部表面对两个细胞融合后的产物进行标记。然后向培养皿中加入0.5mL MS液体培养基，置于27℃、黑暗条件下进行愈伤诱导。诱导出的愈伤组织再经过芽诱导培养基和生根培养基培养获得完整的多倍体植株。

结果与讨论：

未经秋水仙素浸泡的高山红景天种子播种后萌发率为63.4％。经不同浓度的秋水仙素处理后，萌发率出现不同程度的下降，差异显著性分析结果表明，经秋水仙素处理后种子萌发率均显著低于对照(P＜0.05)。在相同秋水仙素浓度下，随着处理时间的延长，种子萌发率下降，不同处理时间相比较差异也均达到显著水平(P＜0.05)。

秋水仙素处理提高了高山红景天幼苗的死亡率，主要表现为：秋水仙素处理过的种子常能萌发，但生根数目少，根系不发达，随着培养时间的延长，植株易黄化死亡。在相同浓度条件下，随处理时间的延长，

死亡率显著上升(P＜0.05)；在相同处理时间条件下，随着秋水仙素浓度的增加，死亡率也显著上升(P＜0.05)。萌发率与死亡率的相关性分析结果表明，两者呈显著负相关(P＜0.05)，相关系数为-0.89。

气孔大小与密度被认为是鉴定多倍体的一个较为可靠的指标。因此，萌发的高山红景天经2个月培养后，进行了气孔特征的比较，结果表明，高山红景天对照叶片气孔最小值为22.60μm，最大值为27.10μm，平均值为25.43μm，平均气孔密度为26.8个/mm²；经加倍后植株气孔特征发生了明显的变化，叶片气孔最小值为27.59μm，最大值为38.54μm，平均值为33.65μm，平均气孔密度为19.7个/mm²。秋水仙处理高山红景天种子后，萌发幼芽存在较多形态变异，表现为叶片宽大，根茎粗壮。将气孔显著增大，气孔密度变小的植株定义为倍性变异植株。在相同的秋水仙素浓度下，随着处理时间的延长，诱变率明显上升，不同处理时间相比较差异多达到显著水平(P＜0.05)；对12个秋水仙浸泡处理的种子萌发率与诱变率进行了相关分析，萌发率与诱变率间呈显著负相关(P＜0.05)，相关系数为-0.88，死亡率与诱变率呈显著正相关(P＜0.05)，相关系数为0.73。

通过气孔大小与密度检测初步判定植株的倍性后，进行了原生质体的分离，活体标记和诱导培养，观察到的细胞染色体数目有：2n＝26，2n＝48，2n＝4x＝52。因此，在秋水仙素处理种子获得的幼苗中，有普通的二倍体植株，有非整倍体，也有同源四倍体，进行四倍体材料的纯化是很有必要的。通过对秋水仙加倍处理的材料进行原生质体分离和活体标记培养，获得了纯合的四倍体材料，通过流式细胞检测与染色体计数，鉴定为纯合四倍体。

Claims

1.一种快速获得植物纯合同源多倍体的方法，其特征在于：按以下步骤进行：

a.原生质体加倍前对原生质体进行直径测量，根据所测得的细胞直径预测融合加倍原生质体的直径变化范围；

b.原生质体融合；

c.对融合加倍后的原生质体进行低融点、低密度琼脂包埋，以预测的加倍原生质体的直径为标准，通过倒置显微镜活体标记目标倍性的原生质体；

d.通过培养标记后的融合原生质体获得目标多倍体再生植株。

2.根据权利要求1所述的一种快速获得植物纯合同源多倍体的方法其特征在于：所述的步骤a原生质体融合前对原生质体进行直径测量是通过苏木精染色后显微测定原生质体直径的变化范围，并根据公式预测融合加倍后原生质体直径的变化范围。

3.根据权利要求1所述的一种快速获得植物纯合同源多倍体的方法其特征在于：所述的步骤c低密度琼脂包埋及活体标记是融合后原生质体与等体积的37℃、1％(w/v)低融点琼脂相混合，使其分散相良好，具体混合步骤为将原生质体与等量的琼脂混合物滴入预热至37℃的直径为60mm培养皿中，水平快速来回晃动培养皿使之平铺于底部，选择分散相好的单个原生质体，根据估算的体积在培养皿底部表面对两个细胞融合后的产物进行标记；然后向培养皿中加入0.5ml MS液体培养基，置于27℃、黑暗条件下进行培养。

4.根据权利要求1所述的一种快速获得植物纯合同源多倍体的方法其特征在于：所述的步骤d原生质体培养与植株再生，当单个克隆的大小长至1～2mm时，挑出转入MS培养基中获得单细胞无性系，当多细胞团进一步增大，形成肉眼可见的小愈伤组织时，进行切分形成10个左右的姊妹系，愈伤组织转入诱芽培养基和生根培养基更进一步形成完整的植株。

5.根据权利要求1所述的一种快速获得植物纯合同源多倍体的方法其特征在于：用染色体计数和流式细胞仪对再生植株的倍性确认，提取加倍后植株叶片各个细胞核DNA，用EPICS XL流式细胞仪测定叶片细胞的DNA含量，并通过染色体计数结果对细胞的倍性进行更进一步的确认。

6.根据权利要求1所述的一种快速获得植物纯合同源多倍体的方法其特征在于：所采用的活体标记技术也可用于嵌合体的分离培养获得纯合的同源多倍体材料。