CN104137778B - 一种白及种子液体悬浮培养原球茎的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白及种子液体悬浮培养原球茎的方法，该方法包括以下步骤：（1）白及种子消毒；（2）悬浮发芽培养：在无菌条件下，用剪刀剪开白及蒴果外壳，将种子抖落在液体发芽培养基中，进行震荡培养30天；（3）悬浮壮苗培养：将经步骤（2）悬浮发芽培养后得到的白及原球茎转接于液体壮苗培养基中，进行震荡培养30-45天。本发明利用液体悬浮培养，能有效获得白及原球茎，操作简单、成本低、且能有效缩短生产周期。

Description

一种白及种子液体悬浮培养原球茎的方法

技术领域

本发明涉及一种白及种子育苗技术，具体涉及一种采用液体悬浮培养方法对白及进行原球茎培养的方法。

背景技术

白及(Bletillastriata（Thunb.）Rchb.f.)为兰科白及属多年生宿根草本植物，肉质肥厚的假鳞茎供药用；总状花序具数朵花，花紫色或淡红色，花型较大，直径约5厘米，形态优美，具有很高的药用价值和观赏价值。

白及在自然状态下主要靠分株繁殖，繁殖系数较低；虽然能产生大量的种子，但是种子不易发芽。由于白及繁殖率低，无法适应规模化种植的需求。目前针对白及繁殖的研究主要集中于种子无菌辅助育苗和组织培养，该技术可以在短时间内得到大量的实生苗，是白及生产上快速有效的途径。

现有对白及组培均选用固体培养基，接种时将白及种子轻轻抖落在培养基的表面，但是由于白及种子呈粉末状，非常细小，操作时难以保证每个种子都能充分接触培养基或者种胚基部接触到培养基，造成生长条件差异，导致出苗不整齐，且转接操作烦琐、工作量巨大。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种操作方便、成本低的白及种子培养原球茎的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种白及种子液体悬浮培养原球茎的方法，该方法包括以下步骤：

（1）白及种子消毒；

（2）悬浮发芽培养：在无菌条件下，用剪刀剪开白及蒴果外壳，将种子抖落在液体发芽培养基中，进行震荡培养；液体发芽培养基采用1/2MS培养基（即采用MS培养基中物质的大量元素浓度减半，其它试剂浓度同MS培养基）；液体发芽培养基中含有NAA0.5-1.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1；培养条件为暗培养，培养温度24-26℃，培养时间为30天；

（3）悬浮壮苗培养：将经步骤（2）悬浮发芽培养后得到的白及原球茎转接于液体壮苗培养基中，进行震荡培养；所述液体壮苗培养基采用1/2MS培养基；液体壮苗培养基中含有NAA1.0mg·L^-1、6-BA1.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1；培养条件为光照培养，光照时间为16h/d，光照强度为2000-2500lx，培养温度为24-26℃，培养时间为30-45天。

其中，步骤（2）中液体发芽培养基中NAA的优选浓度为0.5mg·L^-1。步骤（3）中培养时间优选30天。

步骤（1）中对白及种子消毒采用以下方法：将白及蒴果表面清洗干净，用洗衣粉洗涤5-10min，置流水冲洗干净，再用75%酒精表面消毒5min，无菌水冲洗干净，然后用10%次氯酸钠溶液浸泡消毒白及蒴果，无菌水冲洗5-7遍。

并可将步骤（3）悬浮壮苗培养后得到的白及原球茎转入设施育苗设备中进行炼苗或转接于固体培养基中进行生根培养。

本发明白及种子液体悬浮培养原球茎的具体步骤如下：

1.白及种子消毒：将白及蒴果表面洗干净，用洗衣粉洗涤5~10min，置流水冲洗干净，再用75%酒精表面消毒5min，无菌水冲洗干净，然后用10%次氯酸钠溶液浸泡消毒白及蒴果，无菌水冲洗5~7遍。

2.培养基配制：配制1/2MS+0.5mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖的白及液体发芽培养基和1/2MS+1.0mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖的白及液体壮苗培养基，于高温条件下灭菌冷却后待用。

3.接种：在无菌条件下，用剪刀剪开白及蒴果外壳，将种子抖落在1/2MS+0.5mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖的白及液体发芽培基中。

4.悬浮发芽培养：将接种好的白及液体发芽培养基置于摇床中，震荡培养。培养条件为黑暗培养，培养温度为25±1℃，培养30天。

5.悬浮壮苗培养：将悬浮培养发芽30天后的白及原球茎转接于1/2MS+1.0mg·L^{- 1}NAA+1.0mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖的白及液体壮苗培养基中进行壮苗培养，培养条件为为培养温度为（25±1）℃，光照强度2000~2500lx，光照时间16h·d^-1。震荡培养，培养时间为30-45天。

6.白及种子悬浮壮苗培养结束，可以转入设施育苗设备中进行炼苗或转接于固体培养基中进行生根培养，为白及苗下地作准备。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明采用液体悬浮培养代替原固体培养，能有效保证每个种子都充分接触培养基或种胚基部接触到培养基，出苗整齐，且转接操作简单。本发明利用液体悬浮培养，能有效获得白及原球茎，操作简单、成本低、且能有效缩短生产周期。

附图说明

图1为不同光照条件下白及的发芽情况；

图2为不同培养基对白及发芽的影响。

图1中，a为黑暗条件下白及的发芽情况，b为光照条件下白及的发芽情况；

图2中，1为采用培养基配方1对白及发芽的影响，2为采用培养基配方2对白及发芽的影响，3为采用培养基配方3对白及发芽的影响，4为采用培养基配方4对白及发芽的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验用材料为白及(Bletillastriata（Thunb.）Rchb.f.)的当年成熟蒴果。（由安徽省芜湖市安徽中医药专科学校李林华老师提供，果实采集于安徽芜湖市南陵县丫山）

1.1.2试剂、仪器及设备6-苄氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，简称6-BA）购自上海万疆生物技术有限公司、1-萘乙酸（1-Naphthaleneaceticacid，简称NAA）购自江苏强盛功能化学股份有限公司；ESCO公司OptiMair超净工作台；上海申安医疗器械厂高压灭菌锅；电子天平由上海海康电子仪器厂提供，解剖镜为奥林巴斯CX41-12C02双目显微镜CX41上海泽仕光电科技有限公司；手术刀、滤纸等接种工具均购自南京寿德实验器材有限公司。其它化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1材料处理及接种白芨蒴果表面清洗干净，洗衣粉浸泡洗涤5~10min，流水冲洗干净，75%酒精浸没消毒5min，无菌水冲洗干净，10%次氯酸钠溶液浸泡消毒白及蒴果，无菌水冲洗5~7遍。无菌条件下，无菌剪刀剪开白及蒴果外壳，将种子均匀抖落至液体培养基中。

1.2.2液体培养基的配制以1/2MS液体培养基为基础，添加30g·L^-1蔗糖，调节pH至5.8，激素NAA和6-BA设置3个不同的浓度梯度（0、0.5mg·L^-1、1.0mg·L^-1）。培养基配方见表1。

表1白及发芽及原球茎生成培养基配置表

1.2.3培养条件暗培养培养温度为（25±1）℃，无光照。光培养培养温度为25±1℃，光照强度2000-2500lx，光照时间16h·d^-1。震荡培养。

1.2.4数据测量与统计分析供试检测发芽种子平均取样，解剖镜下拍照、测量并统计数据。长度为原球茎和芽的总长度，粗度为原球茎最粗处。单位为毫米（㎜）。每处理重复7次，并进行统计分析，分析软件为SPSS方差分析软件。

2结果与分析

2.1不同光照条件对白及种子发芽的影响

将白及种子消毒后接种于2号培养基中置于黑暗和光照条件下培养，培养30天，进行取样观察，统计实验数据如下表（表2）。种子发芽情况如图1所示。

表2不同光照条件下白及发芽情况

培养条件	长度（㎜）	粗度（㎜）	长度/粗度	发芽率3 -->
					黑暗条件	0.993±0.202**	0.350±0.053*	2.942±0.797**	98%±2%
光照条件	0.336±0.053*	0.216±0.015*	1.565±0.301*	75%±3%

（**表示极显著P＜0.01,*表示显著P＜0.05）

实验结果显示，暗条件更有利于白及种子发芽，光条件下白及发芽率约80%，比暗条件低20%左右。同时，光照对白及原球茎的形成和早期生长也有明显的抑制作用。光条件下，白及原球茎的长度、粗度均仅为暗条件的30%和60%左右，存在极显著和显著性差异。因此，可以推测，在外源激素和营养充足的条件下，光条件虽然不是白及发芽及早期生长的决定性因子，但对其形成和生长能产生重要影响，黑暗条件可促进白及种子发芽、原球茎形成与生长。

实验同时发现，适量光照会使白及原球茎呈现绿色，应该对其后期生长，特别是在外源激素和外源营养物质供给的环境中具有积极的意义。

2.2不同培养基对白及种子发芽的影响

将白及种子消毒后接种于不同培养基中置于黑暗条件下培养30天，进行取样观察，统计实验数据如下表（表3）。种子发芽情况如图2所示。

表3不同培养基对白及发芽的影响

培养基配方	长度（㎜）	粗度（㎜）	长度/粗度	种子萌发率
					1	1.209±0.072**	0.230±0.018*	5.295±0.667**	85%±5%
2	0.993±0.202**	0.350±0.053**	2.942±0.797	98%±2%
					3	0.297±0.060*	0.179±0.043*	1.792±0.665	30%±2%
4	0.297±0.037*	0.049±0.008**	6.131±1.250**	25%±5%

（**表示极显著P＜0.01,*表示显著P＜0.05）

上表数据显示，不同培养基配方对白及种子萌发率和原球茎形成均有较大影响。配方3和配方4中添加的6-BA明显抑制白及发芽，对白及原球茎生长有较明显的抑制作用。因此在白及种子发芽过程中不宜添加6-BA。配方1和2虽然都能促进白及芽的伸长，但配方1对白及原球茎影响主要表现在促进白及芽的伸长增长，苗出现徒长现象，原球茎增长不明显。而配方2中白及种子发芽率高，原球茎生长速度一致，是较理想的白及种子发芽的配方。因此建议白及种子发芽液体培养基的最佳配方为1/2MS+0.5mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖。NAA浓度范围可以扩大至1.0mg·L^-1，但不宜更高，会发生白及苗徒长。

2.3不同培养基对白及壮苗的影响

将接种于2号培养基中并于黑暗条件下培养30天后的白及原球茎转接于不同培养基中于光照条件下进行培养，培养30天后，取样测定并统计。实验结果如下。

表4不同培养基对白及壮苗的影响

培养基配方	长度（㎜）	粗度（㎜）	增长（㎜）	增粗（㎜）
					1	1.765±0.167**	0.456±0.067*	0.772	0.106
2	1.041±0.075	0.418±0.059	0.048	0.068
					3	1.664±0.167**	0.434±0.038*	0.671	0.084
4	1.696±0.170**	0.512±0.083**	0.703	0.1624 -->
					5	1.218±0.135	0.363±0.072	0.225	0.013
6	1.164±0.083	0.359±0.059	0.171	0.015
					7	1.384±0.174*	0.465±0.055*	0.391	0.115
8	1.415±0.131*	0.406±0.121	0.422	0.056

（**表示极显著P＜0.01,*表示显著P＜0.05）

上表数据显示，NAA浓度为0时，白及原球茎增粗不明显，且苗增粗也不明显；当NAA浓度为0.5mg·L^-1时白及原球茎增粗不明显，但是苗增粗明显。说明低浓度的NAA不能很好地控制白及的生长速度，不能达到壮苗的目的。从上表中能明显看出采用培养基配方4对白及的粗度增加有较明显的促进作用，白及的长度增加也较为明显，能快速生长，达到壮苗的目的。因此白及的壮苗培养基配方以1/2MS+1.0mg·L^-1NAA+1mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖为佳。

综上所述，白及的最佳发芽及原球茎培育条件为将白及种子接种于1/2MS+30g·L^-1蔗糖+0.5mg·L^-1NAA的液体培养基中，培养温度为25±1℃，震荡暗培养30天后，转接入1/2MS+30g·L^-1蔗糖+1.0mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-16-BA的液体培养基中进行壮苗培养，培养条件为培养温度为（25±1）℃，光照强度2000-2500lx，光照时间16h·d^-1。震荡培养。培养时间为30-45天。

Claims (4)

1.一种白及种子液体悬浮培养原球茎的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）白及种子消毒；

（2）悬浮发芽培养：在无菌条件下，用剪刀剪开白及蒴果外壳，将种子抖落在液体发芽培养基中，进行震荡培养；所述液体发芽培养基采用1/2MS+0.5mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖；培养条件为暗培养，培养温度24-26℃，培养时间为30天；

（3）悬浮壮苗培养：将经步骤（2）悬浮发芽培养后得到的白及原球茎转接于液体壮苗培养基中，进行震荡培养；所述液体壮苗培养基采用1/2MS+1.0mg·L^-1NAA+1mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖；培养条件为光照培养，光照时间为16h/d，光照强度为2000-2500lx，培养温度为24-26℃，培养时间为30-45天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中培养时间为30天。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中对白及种子消毒采用以下方法：将白及蒴果表面清洗干净，用洗衣粉洗涤5-10min，置流水冲洗干净，再用75%酒精表面消毒5min，无菌水冲洗干净，然后用10%次氯酸钠溶液浸泡消毒白及蒴果，无菌水冲洗5-7遍。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）悬浮壮苗培养后得到的白及原球茎转入设施育苗设备中进行炼苗或转接于固体培养基中进行生根培养。