CN105309317A - 一种大叶千斤拔的组织培养繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种大叶千斤拔的组织培养繁殖方法，包括如下步骤：(1)外植体的取材与消毒；(2)无菌试管苗的获取；(3)试管苗增殖培养；(4)试管苗壮苗培养；(5)试管苗生根培养；(6)试管苗炼苗移栽。该法以带芽茎段和去叶茎尖作为外植体，通过组织培养繁殖，能够缩短培养周期并快速繁殖出大叶千斤拔优质种苗。培养30d芽繁殖系数可达7.0倍，经过扩繁、壮苗和生根培养，组培苗生根率在92.5～95.5％，移栽基质后成活率在90.3～96.5％，有效解决了大叶千斤拔的规模化育苗问题。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养繁殖技术领域，具体是一种大叶千斤拔的组织培养繁殖方法。
背景技术
大叶千斤拔(M.ghaniamacrophylla(Willd.)O.Kuntze)为豆科植物大叶千斤拔的干燥根。《中华人民共和国药典》(2010版一部)附录中收载其为药材千斤拔的品种来源之一。千斤拔始载于《植物名实图考》，味甘，性涩、平。归肝、肾经。具有补肝肾、祛风湿、强腰膝的作用。用于治疗风湿痹痛、腰腿痛、慢性气管炎、慢性肾炎、小儿疳积、遗精、妇科病、坐骨神经痛、风湿关节炎、子宫脱垂等疾病。亦为傣族、彝族、瑶族习用的民族药。药食两用，民间尤其广东奥北等地常将其做成药膳用以滋补强壮、舒经活络。关于大叶千斤拔的研究，多见于对其药用成分的分析与作用研究，有效成分以黄酮类化合物和多糖为主，具有调节血脂水平，抑制血栓的形成等作用；而大叶千斤拔的醇提取液也被证明有明显的抗炎镇痛的效果。当前市场上，大叶千斤拔被广泛应用于妇科、风湿痹痛等类型的中成药生产，如妇科千金片、千斤拔饮、金鸡胶囊(冲剂)、补血调经片和壮腰健肾丸等中成药。近年来由于千斤拔药材需求大幅增长，对资源开发量大，符合入药标准的大叶千斤拔由于长期遭受大量不合理采挖，资源已日益匮乏，而通过开发组织培养技术，可以加速其繁殖速度获得大量组培苗，为人工种植提供充足种苗，缓解野生资源压力，具有良好的市场应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种大叶千斤拔的组织培养繁殖方法，针对目前大叶千斤拔繁育存在的问题，通过组织培养繁殖，能够缩短培养周期并快速繁殖出大叶千斤拔优质种苗，进行规模化生产种苗，满足市场需求。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种大叶千斤拔的组织培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的取材与消毒：取大叶千斤拔剪切成2-3cm的带芽茎段或l-2cm长的去叶茎尖，作为外植体进行消毒，首先将2-3滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，把外植体放入烧杯轻轻搅拌2min，再用棉花清洗外植体表面污垢，自来水轻微流水冲洗8-10min；移置超净工作台，用75v/v％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗一遍，然后再用添加了1-2滴吐温-20的50ml浓度为0.1v/v％升汞消毒6-8min、无菌水冲洗3-5次，最后放置在消毒好的不锈钢碟子，剪切成1.0-1.5cm长的带芽茎段，获得无菌外植体；
(2)无菌试管苗的获取：将消毒好的外植体置于诱导培养基中进行不定芽诱导发芽得到无菌试管苗，所述诱导培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，30g·L-1蔗糖，0.5mg·L-1的6-苄基腺嘌呤，0.02mg·L-1的吲哚乙酸，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为20-30d；
(3)试管苗增殖培养：将无菌试管苗置于增殖培养基中进行培养获得大量不定芽，所述增殖培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.8-2.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.1-0.5mg·L-1的吲哚乙酸、0.1-0.4mg·L-1的激动素，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为30d；
(4)试管苗壮苗培养：将繁殖后的不定芽置于壮苗培养基中进行壮苗培养得到健壮植株，所述壮苗培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.1-1.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.2-0.5mg·L-1的吲哚乙酸，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为30d；
(5)试管苗生根培养：将健壮植株置于生根培养基中培养得到完整的带根苗，所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.2-0.5mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为25d；
(6)试管苗炼苗移栽：筛选完整的带根苗进行炼苗后移植于基质中培养，再移栽至大田；
步骤(6)中炼苗移栽按以下操作进行：经过步骤(5)获得带根的完整植株，待苗长至5-6cm,根长至2-4cm时，选择生长良好、整齐、健壮的瓶苗，在室温为23-25℃的室内进行炼苗，并在瓶中加水淹没培养基，炼苗5-7d，取出试管苗，洗净根部培养基，移栽到基质中生长40-50d，再移栽至大田。
所述基质为按珍珠岩：蛭石：泥沙＝1：2；1的比例混合。
本发明的突出优点在于：
<1>通过大叶千斤拔不定芽的诱导和繁殖，能保持原始品种的性状，能够在短期内繁殖得到大量性状一致的植株，满足生产需要，并为提供优良性状的大叶千斤拔工厂化育苗提供技术支持。
<2>所用MS和1/2MS固体培养基添加了多种微量元素，添加的6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、激动素和萘乙酸等化学药剂，成本较低廉、浓度适宜，具体作用如下：在诱导培养基中添加6-BA和IAA，能够诱导不定芽萌发；在增殖培养基中添加6-BA、KT和IAA能够促进芽的增殖；在壮苗培养基中添加6-BA和IAA能够促进苗壮和芽的再次增殖；在1/2MS生根培养基中添加NAA可促进苗生根。
<3>培养30d芽繁殖系数可达7.0倍，经过扩繁、壮苗和生根培养，组培苗生根率在92.5～95.5％，移栽基质后成活率在90.3～96.5％，有效解决了大叶千斤拔的规模化育苗问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
实施例1
本发明所述的大叶千斤拔的组织培养繁殖方法的一个实例，包括如下步骤：
(1)外植体的取材与消毒：取大叶千斤拔剪切成2-3cm的带芽茎段及1-2cm的去叶茎尖作为外植体进行消毒；首先将2-3滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，把外植体放入烧杯轻轻搅拌2min，再用棉花清洗外植体表面污垢，自来水轻微流水冲洗8-10min；移置超净工作台，用75v/v％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗一遍，然后再用添加了1-2滴吐温-20的50ml浓度为0.1v/v％升汞消毒6-8min、无菌水冲洗3-5次，最后放置消毒好的不锈钢碟子，剪切成1.0-1.5cm长的带芽茎段，获得无菌外植体。所述无菌水为经高温高压灭菌后的蒸馏水。
(2)无菌试管苗的获取：将消毒好的外植体置于诱导培养基中进行不定芽诱导发芽，培养20d，得到无菌试管苗，培养条件为：温度为23-25℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d；
(3)试管苗增殖培养：将无菌试管苗置于增殖培养基中进行培养，培养30d，获得大量不定芽，不定芽增殖系数为7.0，培养条件为：温度为23-25℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d；
(4)试管苗壮苗培养：将繁殖后的不定芽置于壮苗培养基中进行壮苗培养，培养30d，得到健壮植株，不定芽二次增殖系数为2.8，培养条件为：温度为23-25℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d；
(5)试管苗生根培养：将健壮植株置于MS生根培养基中培养25d，得到完整的带根苗，组培苗生根率在92.5～95.5％，培养条件为：温度为23-25℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d；
(6)试管苗炼苗移栽：经过步骤(5)获得的完整的带根苗，待苗长至5-6cm,根长至2-4cm时，选择生长良好、整齐、健壮的瓶苗，在室温为23-25℃的室内进行炼苗，并在瓶中加入少量自来水淹没培养基，炼苗5-7d，取出试管苗，洗净根部培养基，移栽到基质中生长40-50d，再移栽至大田，成活率为91.3％。所述基质为按珍珠岩：蛭石：泥沙＝1：2；1的比例混合,并且基质疏松透气、排水良好。
其中，各阶段使用的培养基配方如下：
所述诱导培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，30g·L-1蔗糖，0.5mg·L-1的6-苄基腺嘌呤，0.02mg·L-1的吲哚乙酸，培养基pH值为5.8；
所述增殖培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，1.5mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.5mg·L-1的吲哚乙酸、0.1mg·L-1的激动素，培养基pH值为5.8；
所述壮苗培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，1.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.5mg·L-1的吲哚乙酸，培养基pH值为5.8；
所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.2mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8。
实施例2
本发明所述的大叶千斤拔的组织培养繁殖方法的另一个实例，包括如下步骤：
其他条件同实施例1，仅以下内容不同：
步骤(3)中，增殖培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，2.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.5mg·L-1的吲哚乙酸、0.2mg·L-1的激动素，培养基pH值为5.8；不定芽增殖系数为6.3；
步骤(4)中，壮苗培养基以MS为基本培养基，附加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，培养基pH值为5.8，并添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.5mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.2mg·L-1的吲哚乙酸；不定芽二次增殖系数为2.4；
步骤(5)中，生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，1g·L-1活性炭，培养基pH值为5.8，并添加0.3mg·L-1的萘乙酸，生根率为93.7％。
步骤(6)中，成活率为90.3％。
实施例3
本发明所述的大叶千斤拔的组织培养繁殖方法的再一个实例，包括如下步骤：
其他条件同实施例1，仅以下内容不同：
步骤(3)中，增殖培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，1.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.3mg·L-1的吲哚乙酸、0.4mg·L-1的激动素，培养基pH值为5.8；不定芽增殖系数为6.6；
步骤(4)中，壮苗培养基以MS为基本培养基，附加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，培养基pH值为5.8，并添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.8mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.5mg·L-1的吲哚乙酸；不定芽二次增殖系数为2.1；
步骤(5)中，生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，1g·L-1活性炭，培养基pH值为5.8，并添加0.4mg·L-1的萘乙酸，组培苗生根率为95.5％。
步骤(6)中，成活率为94.7％。
实施例4
本发明所述的大叶千斤拔的组织培养繁殖方法的又一个实例，包括如下步骤：
其他条件同实施例1，仅以下内容不同：
步骤(3)中，增殖培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.8mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.1mg·L-1的吲哚乙酸、0.2mg·L-1的激动素，培养基pH值为5.8；不定芽增殖系数为5.9；
步骤(4)中，壮苗培养基以MS为基本培养基，附加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，培养基pH值为5.8，并添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.4mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.2mg·L-1的吲哚乙酸；不定芽二次增殖系数为2.4；
步骤(5)中，生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，1g·L-1活性炭，培养基pH值为5.8，并添加0.5mg·L-1的萘乙酸，组培苗生根率为94.7％。
步骤(6)中，成活率为96.5％。
Claims (3)
1.一种大叶千斤拔的组织培养繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体的取材与消毒：取大叶千斤拔剪切成2-3cm的带芽茎段或l-2cm长的去叶茎尖，作为外植体进行消毒，首先将2-3滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，把外植体放入烧杯轻轻搅拌2min，再用棉花清洗外植体表面污垢，自来水轻微流水冲洗8-10min，移置超净工作台，用75v/v％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗一遍，然后再用添加了1-2滴吐温-20的50ml浓度为0.1v/v％升汞消毒6-8min、无菌水冲洗3-5次，剪切成1.0-1.5cm长的带芽茎段，获得无菌外植体；
(2)无菌试管苗的获取：将消毒好的外植体置于诱导培养基中进行不定芽诱导发芽得到无菌试管苗，所述诱导培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，30g·L-1蔗糖，0.5mg·L-1的6-苄基腺嘌呤，0.02mg·L-1的吲哚乙酸，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为20-30d；
(3)试管苗增殖培养：将无菌试管苗置于增殖培养基中进行培养获得大量不定芽，所述增殖培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.8-2.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.1-0.5mg·L-1的吲哚乙酸、0.1-0.4mg·L-1的激动素，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为30d；
(4)试管苗壮苗培养：将繁殖后的不定芽置于壮苗培养基中进行壮苗培养得到健壮植株，所述壮苗培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.1-1.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.2-0.5mg·L-1的吲哚乙酸，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为30d；
(5)试管苗生根培养：将健壮植株置于生根培养基中培养得到完整的带根苗，所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.2-0.5mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为25d；
(6)试管苗炼苗移栽：筛选完整的带根苗进行炼苗后移植于基质中培养，再移栽至大田。
2.根据权利要求1所述的大叶千斤拔的组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤(6)中所述的炼苗移栽按以下操作进行：经过步骤(5)获得带根的完整植株，待苗长至5-6cm,根长至2-4cm时，选择生长良好、整齐、健壮的瓶苗，在室温为23-25℃的室内进行炼苗，并在瓶中加水淹没培养基，炼苗5-7d，取出试管苗，洗净根部培养基，移栽到基质中生长40-50d，再移栽至大田。
3.根据权利要求2所述的大叶千斤拔的组织培养繁殖方法，其特征在于：所述基质为按珍珠岩：蛭石：泥沙＝1：2；1的比例混合。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170718 Termination date: 20201202 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |