CN102138525B - 一种波棱瓜植物的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种药用植物波棱瓜的组织培养方法，该方法采用外植体消毒后，接种于添加了蔗糖和铁盐的MS培养基中进行芽诱导，随后进行芽的增殖，在添加了IBA和IAA培养基的1/2浓度的MS培养基中进行生根诱导，生根率达90％以上。本发明缩短了波棱瓜植物的育苗周期，以有选择性的进行波棱瓜雌株植物的定向性大规模工厂化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种波棱瓜植物的快速繁殖技术，具体来说是一种波棱瓜植物的组织培养方法，特别是波棱瓜雌株植物的组织培养方法。
背景技术
波棱瓜(Herpetospermum peduculosum)为葫芦科、波棱瓜属一年生攀延草本植物。主要分布在西藏波密、林芝、错那、聂拉木等地，尼泊尔、印度也有分布。其种子入药，具有清热解毒，柔肝之功效，主要用于治黄疸型传染性肝炎，消化不良等，是常用藏药材之一，用于二十多种藏成药中，需求量很大。该植物主要生长在海拔1500～3500米的路旁、山坡、灌丛、林缘，虽然分布范围较广，但在分布区植株密度低。随着藏医药的蓬勃发展，使波棱瓜野生资源已濒临灭绝。特别地，在人工栽培中常用种子播种法，但是种子发芽率较低，由于波棱瓜是雌雄异株植物，至今从其种子上无法辨认雌、雄株，在常规播种过程中雌株比例一般只占30％，因此，产量很低，成为波棱瓜人工栽培的瓶颈问题，严重制约着规模化栽培。通过组织培养方法来快速繁殖该药用植物具有非常重要的意义。本发明以濒危藏药材波棱瓜植物，优选雌株植物的茎段为外植体进行再生植株的研究，已培养出大量的波棱瓜植物组培苗并进行了炼苗、移栽、采收，为提高波棱瓜产量开辟了一条行之有效的途径。
植物组织培养技术是快速育苗的有效方法，已在园艺、林木以及多种药材等领域得到了广泛的应用。应用组织培养方法快速繁殖优质药用波棱瓜植物，是解决波棱瓜植物供求矛盾、提高波棱瓜雌株植物的比例和波棱瓜质量的快速而有效的途径。然而，植物的种类不同、品种不同，甚至同一品种所选用的外植体不同，组织培养所需的培养基成分、培养条件和栽培管理条件等也存在很大的差异。
发明内容
本发明的目的是建立药用波棱瓜植物，特别是波棱瓜雌株植物的组织培养方法，规模化生产优质波棱瓜植物、特别是波棱瓜雌株植物的种苗。该方法简单实用，高效迅速，适宜规模化生产。
本发明经过多重筛选实验优化培养繁育条件，提出了适宜药用波棱瓜植物，特别是波棱瓜雌株植物的组织培养快速繁殖的方法。本发明选择优质波棱瓜植物的茎段为外植体；筛选了芽快速增殖的培养基组成成分；筛选了壮苗培养的条件；筛选了生根培养培养基的组成；筛选并建立了试管苗移栽及田间管理条件和措施。
本发明的波棱瓜植物的组织培养方法，具体步骤包括：
(1)外植体的消毒：取带腋芽的波棱瓜植物的幼茎为外植体，将该外植体先用肥皂水进行清洗，再用流水反复冲洗，再放入75％的酒精中浸5秒后，用无菌水冲洗3遍，然后用0.1％升汞进行消毒，最后用无菌水清洗三遍以上待用；
特别地，在针对波棱瓜雌株植物的组织培养中，所述外植体是通过将波棱瓜种子通过在温室内播种、移栽，待开花可识别波棱瓜雌、雄株时，剪取带腋芽的波棱瓜雌株植物的茎段来获得的；所述波棱瓜种子采自西藏林芝地区八一镇，西藏药业药材栽培基地。
(2)芽的诱导：将经上述处理的茎段切成单芽茎段，分别接种于添加了蔗糖和铁盐的MS培养基中，在22±2℃、12-14小时/天光照下培养7-15天；
培养基配方为：MS培养基+0.5mg/L 6BA+40g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.1g/L肌醇+铁盐25ml/L，PH5.8；
铁盐配置方法说明：通常使用的铁盐为FeSO4.7H2O，取5.57克的FeSO4.7H2O，7.45克的Na2-EDTA，分别加热溶解，然后进行混合，定容至1000mL；
在该添加了特定用量的蔗糖和铁盐的MS培养基中，外植体的腋芽均能正常萌发，且能降低叶片与茎段均出现的白化现象。
(3)芽的增殖：将上述经诱导的芽接种于分化培养基中，在22±2℃、12-14小时/天光照下培养20-25天；
培养基配方为：MS培养基+1.0mg/L 6-BA+40g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.1g/L肌醇+铁盐25ml/L，PH5.8；
结果表明，在培养20-25天后，仅添加6-BA而不添加NAA使得芽的增殖系数大于5.0。
(4)生根诱导：选取健壮的、1cm-3cm高的丛生无根苗，将其切分为单芽，转至生根培养基中诱导生根，得到完整试管植株；生根培养基配方为：1/2浓度的MS培养基+0.5-1.0mg/L IBA+1.0-1.5mg/L IAA。优选的生根培养基配方为：1/2浓度的MS培养基+1.0mg/L IBA+1.0mg/L IAA。波棱瓜雌株植物的无根苗在该培养基中生根整齐，苗健壮，生根率达98％以上。
随后对波棱瓜植物，尤其是雌株植物的有根苗进行炼苗和移栽，本发明所涉及的炼苗和移栽采用本领域的常规方法，即将带有3-4条根且健壮的植株揭开封口膜炼苗3-5天，然后洗干净培养基，移入装有草炭土和河沙(体积比为1∶1-3∶1)或草炭土和珍珠岩(体积比为1∶1-3∶1)混合基质的营养钵中，置于温室，移栽时应注意保护试管苗的根尖，炼苗21天后进行田间移栽。移栽初期要注意遮荫与水分的补充，移栽苗的成活率达87-90％。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点和效果：
(1)缩短了波棱瓜植物的育苗周期。传统的波棱瓜植物育苗周期长，难以满足大规模生产的需求，本发明可以大大缩短波棱瓜植物的育苗周期；
(2)可以有选择性的进行波棱瓜雌株植物的定向性大规模工厂化生产，在人工栽培过程中控制波棱瓜雌、雄株的最佳比例，解决波棱瓜在栽培过程中以往的瓶颈问题。
(3)以茎段作为外植体，通过芽的繁殖进行快速繁殖，保证了遗传的稳定性，并且取材容易。
(4)具有普遍的适用性，本发明基于对波棱瓜主要的种植地西藏各地种植的波棱瓜栽培类型的快速繁殖研究，均能进行试管快速繁殖，有助于今后筛选得到的波棱瓜优质品种或类型的快速繁殖与推广。
具体实施方式
实施例1：波棱瓜植物的组织培养试验
(1)外植体的消毒：取带腋芽的波棱瓜植物的幼茎为外植体，将该外植体先用肥皂水进行清洗，再用流水反复冲洗，再放入75％的酒精中浸5秒后，用无菌水冲洗3遍，然后用0.1％升汞进行消毒，最后用无菌水清洗三遍以上待用；
(2)芽的诱导：将经上述处理的外植体切成单芽茎段，分别接种到添加了蔗糖和铁盐的MS培养基中，在22±2℃、12-14小时/天光照下培养7-15天；
培养基配方为：MS培养基+0.5mg/L 6BA，40g/L蔗糖，6g/L琼脂，0.1g/L肌醇，铁盐25ml/L，pH 5.8。
在该添加了特定用量的蔗糖和铁盐的MS培养基中，外植体的腋芽均能正常萌发，且能降低叶片与茎段均出现的白化现象。
(3)芽的增殖：将上述经诱导的芽接种于分化培养基中，在22±2℃、12-14小时/天光照下培养25天；
培养基配方为：MS培养基+1.0mg/L 6-BA，40g/L蔗糖，6g/L琼脂，0.1g/L肌醇，铁盐25ml/L，pH 5.8。
结果表明，在培养25天后，仅添加6-BA而不添加NAA使得芽的增殖系数大于为5.0。
(4)生根诱导：选取健壮的、1cm-3cm高的丛生无根苗，将其切分为单芽，转至生根培养基中诱导生根，得到完整试管植株；生根培养基配方为：1/2浓度的MS培养基+1.0mg/L IBA+1.0mg/L IAA。(
波棱瓜植物的无根苗在该培养基中生根整齐，苗健壮，生根率达98％。
随后对波棱瓜植物的有根苗进行炼苗和移栽，本发明所涉及的炼苗和移栽采用本领域的常规方法，将带有3-4条根且健壮的组培苗揭开封口膜炼苗3-5天后取出洗净，移入装有草炭土和河沙(体积比为1∶1-3∶1)或草炭土和珍珠岩(体积比为1∶1-3∶1)混合基质的营养钵中，置于温室，浇足水，要保持70％的湿度，移栽时应注意保护试管苗的根尖，炼苗21天后进行田间移栽。移栽初期要注意遮荫与水分的补充，移栽苗的成活率为90％。
实施例2：波棱瓜雌株植物的组织培养试验
(1)外植体的消毒：通过将波棱瓜种子通过在温室内播种、移栽，待开花可识别波棱瓜雌、雄株时，剪取带腋芽的波棱瓜雌株植物的茎段来获得波棱瓜雌株植物的外植体，所述波棱瓜种子采自西藏林芝地区八一镇，西藏药业药材栽培基地。将该外植体先用肥皂水进行清洗，再用流水反复冲洗，再放入75％的酒精中浸5秒后，用无菌水冲洗3遍，然后用0.1％升汞进行消毒，最后用无菌水清洗三遍以上待用；
其余步骤同上述实施例1。
在该实施例中：在该添加了特定用量的蔗糖和铁盐的MS培养基中，外植体的腋芽均能正常萌发，且能降低叶片与茎段均出现的白化现象；在芽的诱导步骤，在培养25天后，仅添加6-BA而不添加NAA使得芽的增殖系数大于为5.0；波棱瓜植物的无根苗在生根培养基中生根整齐，苗健壮，生根率达98％；移栽苗的成活率为90％。
实施例3：波棱瓜雌株植物的组织培养的芽诱导阶段基础培养基的筛选试验
试验方法：试验步骤(1)和(2)同上述实施例2，在步骤2中，选择N6培养基替换MS作为基础培养基。
表1MS培养基与N6培养基对芽的诱导作用比较表
结果表明：在芽的诱导阶段，采用MS培养基相比N6培养基具有更好的效果。
实施例4：波棱瓜雌株植物的组织培养的芽诱导阶段基础培养基优化筛选试验
试验方法：试验步骤(1)和(2)同上述实施例2，在步骤2中，在作为MS的基础培养基中加入如下表2所示浓度的蔗糖和铁盐。
表2培养基中不同配比的蔗糖与铁盐对波棱瓜雌株的影响
结果表明：随着蔗糖和铁盐浓度逐步升高在一定范围内叶片与茎段有返青现象，白化现象得到明显的改善。以附加40g/L蔗糖、25ml/L铁盐浓度的培养基为宜，白化率为0。
实施例5：波棱瓜雌株植物的组织培养的芽增殖阶段培养基优化筛选试验
试验方法：试验步骤(1)、(2)和(3)同上述实施例2，在步骤(3)中，在MS培养基中加入如下表3示浓度的6-BA和NAA。
表3不同激素配比对波棱瓜雌株分化芽的影响
结果表明，含有6-BA和NAA两种不同激素在不同浓度配比组合下，随着6-BA浓度逐步升高在一定范围波棱瓜雌株分化芽有明显增加作用，但6-BA和NAA总的激素浓度超过1.5mg/L时，叶片微卷曲。而随着NAA浓度逐步升高在一定范围波棱瓜雌株分化芽有增加作用但不明显，且NAA和6-BA总的激素浓度超过1.5mg/L时，叶片生长依然正常，这表明6-BA起着决定性的作用。分化培养基添加6-BA1.0mg/L为宜，芽的增殖系数为5.0。
实施例6：波棱瓜雌株植物的组织培养的生根诱导阶段培养基筛选试验
试验方法：试验步骤(1)、(2)、(3)和(4)同上述实施例2，在步骤(4)中选用如下表4所示的培养基。
表4不同浓度培养基对波棱瓜雌株生根的影响
结果表明：在添加IBA1.0mg/L、IAA1.0mg/L 1/2浓度的MS生根培养基中，生根时间及整齐度为最优。生根率可达到98％左右。
本发明的研究方法通过具体的实验进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变生长激素、营养成分、实验条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。
Claims (3)
1.一种波棱瓜植物的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒：取带腋芽的波棱瓜植物的幼茎为外植体，将该外植体先用肥皂水进行清洗，再用流水反复冲洗，再放入75％的酒精中浸5秒后，用无菌水冲洗3遍，然后用0.1％升汞进行消毒，最后用无菌水清洗三遍以上待用；
(2)芽的诱导：将经上述处理的茎段切成单芽茎段，分别接种于添加了蔗糖和铁盐的MS培养基中，在22±2℃、12-14小时/天光照下培养7-15天；培养基配方为：MS培养基+0.5mg/L 6-BA+40g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.1g/L肌醇+铁盐25ml/L，pH5.8；
(3)芽的增殖：将上述经诱导的芽接种于分化培养基中，在22±2℃、12-14小时/天光照下培养20-25天；培养基配方为：MS培养基+1.0mg/L 6-BA+40g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.1g/L肌醇+铁盐25ml/L，pH5.8；
(4)生根诱导：选取健壮的、1cm-3cm高的丛生无根苗，将其切分为单芽，转至生根培养基中诱导生根，得到完整试管植株；生根培养基配方为：1/2浓度的MS培养基+0.5-1.0mg/L IBA+1.0-1.5mg/L IAA，波棱瓜雌株植物的无根苗在该培养基中生根整齐，苗健壮，生根率达90％以上。
2.根据权利要求1所述的波棱瓜植物的组织培养方法，其特征在于，当用于波棱瓜雌株植物的组织培养时，其外植体是通过将波棱瓜种子通过在温室内播种、移栽，待开花可识别波棱瓜雌、雄株时，剪取带腋芽的波棱瓜雌株植物的茎段来获得的。
3.根据权利要求1或2的波棱瓜植物的组织培养方法，其特征在于，步骤(4)的生根培养基配方为：1/2浓度的MS培养基+1.0mg/L IBA+1.0mg/L IAA。
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