CN1307313C - 一种利用不对称体细胞杂交技术创建小麦渐渗系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种γ-射线和UV诱导的染色体小片段向小麦渐渗的方法，由双亲胚性愈伤组织和悬浮细胞系的诱导及筛选；受体和供体原生质体的游离、UV及γ-射线处理供体原生质体；受体与供体原生质体的融合及培养；异源染色体小片段及DNA片段的鉴定及定位组成。利用本发明的方法可以获得转入不同异源植物染色体小片段和DNA的大量的耐盐、抗病、优质的体细胞杂种新种质、新品系和新品种。所创造的这些新材料可有效地丰富小麦的遗传变异和拓宽小麦的遗传多样性；用于小麦及异源遗传物质的基因功能及表达调控研究；用于小麦基因组进化的遗传学和表观遗传学研究；实现小麦产量和品质的遗传改良。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用不对称体细胞杂交技术创建小麦渐渗系的方法，属于农业生物技术领域和植物细胞工程领域。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.AABBDD，2n＝6x＝42)的遗传育种已取得较大进展，但其种质资源十分狭窄，抗病、抗逆性逐年下降，亟需引入新的抗病、抗逆及优质等基因。小麦近缘属禾草中存在着许多改良小麦所需的目标基因，通过染色体工程和体细胞杂交可以实现优异基因向小麦转移。
在小麦染色体工程育种中，至今已获得较多的臂间易位及异源染色体大片段易位系。这种大片段易位系在引入优良性状的同时往往伴随着不良效应，降低了染色体工程方法在小麦育种中的作用。
外源染色体小片段易位系及其亚显微水平的DNA渐渗系是植物育种学家们长期追求的目标，其主要优点在于：可在最大程度上排除不利基因的干扰，获得稳定遗传的优异小麦新品种；可用于功能基因的定位与克隆；外源小片段和DNA渐渗有利于稳定遗传；其携带的目标基因易于定位和克隆；因而在作物的遗传育种及遗传理论研究中有巨大的价值。但是，迄今为止，关于小麦的小片段易位及其亚显微水平的DNA渐渗系只有极少的例证。采用的方法主要有：利用小麦花粉培养，如胡含等通过对小麦/黑麦单体附加系材料的花粉培养成功地诱导了小片段易位系；利用射线处理而诱导小麦杂种的染色体小片段易位系或渐渗系也有报道，利用染色体工程技术，如任正隆等(1997)发现单体附加在小麦中的黑麦染色体存在着遗传不稳定性，其高频率的破碎会引起小麦染色体的破碎和丢失，进而诱导产生黑麦染色体小片段易位系。利用以上方法虽可诱导小片段易位系或渐渗系的形成，但是从附加系及易位系或渐渗系的产生及鉴定到小片段易位系或渐渗系的获得和鉴定，周期长、难度大、频率低。此外，附加系和易位系或渐渗系的形成受到远缘不亲和性的限制。因此，急需发展获得异源小片段和DNA渐渗系的育种新方法。
体细胞杂交可克服远缘有性不亲和障碍，实现细胞核和细胞质基因的转移。它的主要特点：(1)可以超越常规有性杂交的局限性，使远缘不亲和的植物产生体细胞杂种，以拓宽对野生基因资源的利用；(2)可实现细胞核和细胞质基因的转移，产生多种多样的，有性杂交无法实现的作物新类型；(3)可以转移由多基因控制的性状及同时转移多个有益性状；(4)可以使供体植物的染色质及DNA片段渐渗到受体的染色体上，能够很快稳定及遗传，加速杂种在育种中的利用；(5)转移的基因为亲本自身所携带，因此不存在潜在的安全性问题。因此，通过体细胞杂交产生渐渗系可以实现优异基因的转移，为小麦遗传育种开辟了新途径。
小麦(Triticum aestivum L.)的体细胞杂交曾经是世界性难题。南京农业大学最早报道从小麦与多花黑麦草(陈文品等，1992)；小麦与燕麦(刘宝等，1994)和小麦与裸燕麦(Liu et al.1995)的体细胞杂交获得分裂的杂种细胞团及杂种愈伤组织。华中农业大学1997年从小麦与多花黑麦草的体细胞杂交获偏向多花黑麦草的杂种植株。山东大学八五期间在国际上首次建立小麦体细胞杂交技术；九五期间逐渐完善；至今已在小麦与7种近缘禾草(长穗偃麦草、中间偃麦草、簇毛麦、新麦草、羊草、早熟禾和多花黑麦草)；2种远缘属禾谷类作物(燕麦与玉米)及2种远缘属禾草(青苗碱谷和高羊茅)获小麦杂种再生植株。其中小麦与长穗偃麦草的体细胞杂种后代已遗传到F8代，获得具有高产、优质、耐盐等农艺性状及品质改良的多种株系及新品系，并且转移了供体的目标基因。目前，已选育出一个高产、优质、耐盐的体细胞杂种新品种(定名为山融3号)和含有供体优质亚基的新品系。国际上仅有玉米与小麦(玉米育种)获玉米杂种植株的一例报道(Szarka et al.2002年)。
80年代兴起的不对称体细胞杂交方法，由于利用x-，γ-射线及紫外线照射供体，可使供体染色体削减及断裂，提供了少量异源遗传物质向受体渐渗的可能性。我们在2001年首次报道用γ-射线诱导的小麦不对称体细胞杂交可引起簇毛麦染色体小片段易位和插入(渐渗)；以后又报道了UV可使燕麦染色体小片段存在于小麦染色体组、UV照射的高冰草染色体小片段存在于小麦染色体组，产生了异源染色体小片段渐渗系，现已繁殖到F8代。并且证明该技术引起小麦基因组变异，有利于小麦遗传育种。因此，不对称体细胞杂交为异源染色质整合到受体染色体提供了直接而简便的方法，为向小麦及其它作物引入异源优异基因开辟了新途径。目前，国外将紫外线用于其它植物体细胞杂交转移染色体小片段，将目标性状转入受体已有一些例证(Vlahova et al.1997，Forsberg et al.1998，Yamagishi et al.2002)。小麦体细胞杂交虽然曾经有过研究，但尚未证明该技术引起小麦基因组变异并且在育种中成功利用。
发明内容
针对上述方法所产生的大片段易位不利于小麦育种改良的不足，本发明要解决的问题是，提供一种利用细胞周期的调控和结合射线处理进行的体细胞杂交向小麦渐渗异源染色体小片段及DNA片段的技术，它可在最大程度上排除不利基因的干扰，渐渗的异源染色体小片段及DNA片段有利于小麦稳定遗传，同时有利于新功能基因渐渗到小麦和诱导小麦基因组变异，从而为小麦的遗传育种及遗传理论研究服务。
本发明公开一种利用不对称体细胞杂交技术创建小麦渐渗系的方法，由以下步骤实现：
1)双亲胚性愈伤组织和悬浮细胞系的诱导及筛选，获得培养细胞；2)适宜剂量的γ-射线或UV处理供体原生质体；3)对以上的受体与供体原生质体进行融合及对融合产物进行培养，4)对含有异源染色体小片段及DNA片段的小麦渐渗系进行鉴定及定位，其特征在于：
步骤1)所述双亲胚性愈伤组织和悬浮细胞系的诱导及筛选是指用小麦和与小麦有不同亲缘关系的不同野生和栽培的禾谷类作物的幼胚进行组织培养，从组织培养物中鉴别和筛选快速生长的颗粒型胚性愈伤组织，并且用其建立快速生长的胚性悬浮细胞系，可以产生大量原生质体；步骤2)所述适宜剂量的γ-射线供体原生质体是指培养细胞用于酶解分离原生质体指将小麦和供体培养细胞放入含纤维素酶和果胶酶的溶液中，于25℃下游离4小时；γ-射线处理供体原生质体是用400目不锈钢网过滤并离心收集原生质体；供体原生质体调成1×106/mL的密度，铺在直径1.5cm的玻璃培养皿中成薄层后用UV或γ-射线照射，其中，紫外线照射：照射强度为380μW/cm2或300μW/cm2，照射时间为0.5-1分钟；γ-射线处理：60Co-γ射线辐照，剂量为60Gy；剂量率为1.3Gy/min-3.8Gy/min；步骤3)所述的对以上受体与供体原生质体进行融合及对融合产物进行培养和筛选是指将受体及供体原生质体以1×106/ml的密度按1∶1的体积比混合均匀，用PEG法诱导融合，融合产物在P5培养基中培养，形成的克隆在MB固体继代培养基中及分化培养基中增繁和分化；再生的小苗移栽至土成活并结实，获得杂种后代；步骤4)对含有异源染色体小片段及DNA片段的小麦渐渗系进行鉴定及定位是指利用染色体核型、FISH和GISH及SSR技术相结合，对供体染色体小片段在小麦染色体及基因组中的分布和遗传规律进行定性及定量分析，鉴定小麦渐渗系。
在上述的利用不对称体细胞杂交技术创建小麦渐渗系的方法中，所述受体来源于继代培养5-7天的小麦胚性愈伤组织或3-4天的悬浮细胞培养物中的培养细胞；所述供体是指小麦的近缘植物：高冰草(Elytrigia elongata(Host.)Nevski/Agropyron elongatum(Host.))、中间燕麦草(Elytrigia intermedia (Host.))、新麦草(Psathyrostachys juncea(Fisch.)、簇毛麦(Haynaldia villosa L.)、羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)、多花黑麦草(Loliummultiflorum)及小麦(Triticum asetivum L.)的远缘植物：燕麦(Avena sativa L)、玉米(Zeamays L.)、青苗碱谷(Setaria italica(L.)Beauv)和高羊茅(Festuca arundinacea Schreb)愈伤组织；所述供体来源于继代培养5-7天的胚性愈伤组织及3-4天的悬浮细胞培养细胞。
本发明中，所述酶液配方是：
酶液成分：10mg/ml-15mg/ml Cellulase Onozuka RS或20mg/ml-30mg/ml的Onozuka R-10、1mg/ml-3mg/ml Pectolyase Y-23，5mM MES，0.6M甘露醇，5mM CaCl2，pH5.8。洗液成分：0.6M甘露醇，5mM CaCl2，pH5.8
本发明中，双亲原生质体的融合、培养与筛选的过程是将各供体分别与上述小麦受体以1x106/ml的密度按1∶1的体积比混合均匀，用PEG法诱导融合。融合流程如下：(1)原生质体滴加在直径3.5cm的培养皿，铺成一薄层，静置20分钟。(2)沿薄层边缘滴加PEG溶液，静置15分钟。(3)再加二倍体积的0.275M Ca(NO3)2液，静置10分钟。重复一次。(4)吸掉皿中液体，洗液洗两次每次5-10分钟。(5)用P5液体培养基洗一次。(6)用Parafilm封口，25℃避光保湿培养。再生愈伤组织长至1.5-2mm时挑出，转至继代培养基中继代培养，再转至分化培养基中分化，每天光照12h，光强2000Lux，温度25℃。当小苗长至5cm左右高时，转至壮苗培养基上壮苗。健壮的小苗先栽至纸杯中，成活后再转至大盆土壤中。
其中，PEG溶液的配方：2g葡萄糖，1.5g Ca(NO3)2，40g PEG(6000)溶解在100ml无离子水中，调pH至7.0，抽滤灭菌。
Ca(NO3)2溶液的配方：9g无水Ca(NO3)2+200ml无离子水，调pH至7.0，抽滤灭菌。
本发明中，所述培养基及其配方是：
P5培养基：MS培养基的大量元素+MS培养基的微量元素+B5维生素+500mg/L水解酪蛋白+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+90g/L葡萄糖+975mg/L MES，pH5.6～5.8。
MB固体培养基：MS培养基的大量元素+MS培养基的微量元素+B5维生素+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+30mg/L水解酪蛋白+30mg/L+7g/l蔗糖琼脂粉，pH5.8--6.0。
继代培养基：MB固体培养基附加1mg/L 2，4-D和0.5mg/L玉米素。
分化培养基：MB固体培养基附加0.5mg/L IAA和0.5mg/L玉米素。
壮苗培养基：分化培养基附加含0.5mg/L NAA和1-3mg/L多效唑。
本发明中，杂种愈伤组织及再生植株的鉴定的方法主要为：(1)染色体分析：取双亲以及再生克隆愈伤组织及再生植株根尖4℃低温下24小时，经甲醇：冰乙酸(3∶1)固定4-24小时，压片法制片(李懋学，1996)，检查染色体。(2)同工酶分析：对杂种进行酯酶同工酶、过氧化物同工酶和苹果酸脱氢酶分析。制样及染色方法参考胡能书和万国贤(1985)。(3)RAPD分析：CTAB法提取亲本、再生愈伤组织及再生植株的基因组总DNA(Doyle et al.1990)。选用随机引物，按夏光敏等(1996)报道的方法进行PCR扩增并分析。(4)5S rDNA间隔序列分析：CTAB法分别提取和纯化亲本及再生愈伤组织和植株叶片的基因组总DNA.选用两种引物(20mer和25mer)序列为：PI：5’-GAGAGTAGTACATCGATGGG-3’；PII：5’-GGAGTTCTGACGGGATCCGG-3’(20mer)PIII：5’-GGATGGGTGACCTCCCGGGAAGTCC-3’；PIV：5’-CGCTTAACTGCGGAGTTCTGATGGG-3’(25mer)。按周爱芬等[12]报道的方法进行杂种与亲本的核糖体5S-rDNA间隔序列分析。
本发明中，异源染色体小片段在杂种中的分布、遗传及定位方法为：
荧光原位杂交(FISH和GISH)
1).再生愈伤组织及植株根尖用压片法进行染色体制片[。2).探针的制备：采用Nicktranslation法，用各供体的总基因组DNA(CTAB法提取)或特异重复DNA(从质粒提取)制备探针。3).原位杂交程序参照周爱芬(2001)的方法，略有改动。杂交前，染色体制片在70％甲酰胺中70℃处理2min，再依次用-20℃预冷的70％→95％→100％乙醇，各处理5min。每张片子加杂交液20μL，包括甲酰胺10μL，50％硫酸葡聚糖4μL，20×SSC 2μL，10％ SDS 0.2μL，鲑鱼精DNA(10μL/μl)1μL，探针50ng、封阻中国春DNA8.0-～10μg，混匀，短暂离心，沸水中变性10min，迅速放人冰水中5-10min。每张玻片加18μl杂交液，盖上盖玻片，将玻片移入湿盒中，88℃变性12min，然后放入37℃恒温箱中杂交过夜。室温下2×SSC洗片5min后按试剂盒Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIGDetection的要求进行。4μg/ml PI染色10min，)加抗褪色剂，封片。在OLYMPUS BX60荧光显微镜下观察。激光波长450-490nm，Kodak 400胶片拍照。
SSR分析CTAB法分别提取和纯化亲本及再生愈伤组织和植株叶片的基因组总DNA作模板。采用20μl反应体系：1×PCR buffer，1.5 mM MgCl2，100 μM dNTP，0.2μM引物1，0.2μM引物2，0.5 U r Taq，50ng模板DNA。PCR程序：94℃ 5min；94℃ 1min，50℃(55℃、60℃)80s，72℃ 2min，41个循环；72℃ 7min；扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染、显影和定影后室温干燥，观察，拍照。
RFLP和SSCP cDNA或EST序列设计的引物进行杂种分子标记，按文献报道的方法进行。
本发明中的异源染色体小片段向小麦转移的体细胞杂交技术可以获得大量的耐盐、抗病、优质的体细胞杂种新品系(Xia et al.2003；Feng et al.2004)，因此是小麦遗传改良的一种新方法。利用体细胞杂交技术能将含优异基因的供体染色体小片段转移到小麦中，可有效地丰富小麦的遗传变异和拓宽其遗传多样性，实现小麦的遗传改良。
本发明的有益效果：本发明是利用体细胞杂交实现异源染色体小片段向小麦的渐渗，从而获得染色体小片段易位系，与染色体工程等方法相比，本发明的优势在于：不对称体细胞杂交为异源染色体小片段和DNA片段整合到受体染色体提供了直接而简便的方法，因而在作物的遗传育种及遗传理论研究中有巨大的价值。在应用上，体细胞杂种易位系可产生易于快速稳定的多种抗逆、优质、高产、抗病新品系，可加快育种的进程，获得多种类型的新品种或新品系，可产生巨大的经济效益。
附图说明：
图1小麦与高冰草体细胞杂种F5代的PMC MI染色体构型：(a)I-1-9的环状二价体。(b)II-1-3.→示棒状二价体。
图2小麦与高冰草体细胞杂种F5代GISH结果：(G)II-1-9，6个杂交信号。
图3小麦与高冰草体细胞杂种F5代II-1-3的高冰草染色体小片段异位FISH结合GISH的结果：(e)：II-1-3，5个GISH杂交信号；(f)：II-1-3以B族特异重复序列作探针的FISH杂交信号；(g)：II-1-3以D族特异重复序列作探针的FISH杂交信号。
图4小麦与高冰草体细胞杂种F5代SSR结果(→示与高冰草一致的带.
示与小麦一致的带..#示新带)。
图5小麦与燕麦体细胞杂种No..94的再生植株(A)。
图6小麦与燕麦体细胞杂种再生植株的过氧化物酶(A)、酯酶同工酶(B)、5S-rDNA间隔序列(C)和(D)谱带。T：小麦，A：燕麦，1、3、5、23、52、56、58：IIIB的No.1-1、1-3、1-5、1-23、1-52、1-56、1-58杂种植株，↑：双亲特征带，▲：新带。
图7小麦与燕麦体细胞杂种再生植株的GISH结果(黄绿色为燕麦的染色体小片段)
图8小麦与青苗碱谷体细胞杂种的GISH结果：A：青苗碱谷；B：小麦；C-F：体细胞杂种(黄绿色为青苗碱谷的染色体小片段)。
图9小麦与簇毛麦体细胞杂种的5SrDNA间隔序列和同工酶结果(W为小麦济南177；H为簇毛麦；M为标准分子量；1-1，1-3，1，2，5，11，14，17，20，31为体细胞杂种克隆。→为双亲特异带；
为新带)。
图10小麦与簇毛麦体细胞杂种的GISH结果，A-C：体细胞杂种克隆，→为杂交信号；2D：再生植株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实例1：利用UV诱导的不对称体细胞杂交向小麦转移高冰草染色体小片段
1.体细胞杂种的形成
供试材料为普通小麦济南177(Triticum aestivum L，cv，Jinan 177)、高冰草(Agropyron elongatum(Host)Nevishi.(StStEbEeEx，2n＝10x＝70))。用济南177和高冰草的悬浮细胞系分离，高冰草的原生质体用UV照射(380μW/cm2，30s)，形成的体细胞杂种F5代I-1-9和II-1-3均由本实验室保存。
2.杂种的SSR和RAPD分析
方法如前所述。
3.花粉母细胞制片和GISH分析
在旗叶距下一叶叶耳1～2cm，穗长3～4cm时取材镜检，卡诺II固定液固定花药。花药经蒸馏水前低渗10min，1mol/l HCl 60℃酸解5min，蒸馏水后低渗20～40min，卡宝品红染色，压片法制片(图1)。
GISH和FISH参照以上程序。探针与封阻组合及比例：(1)高冰草总基因组DNA作探针，小麦总基因DNA组作封阻，比例为1∶200～1∶145；(2)B族特异重复序列作探针，乌拉尔图小麦和粗山羊草总基因组DNA作封阻，比例为1∶50(25+25)；(3)D族特异重复序列作探针，乌拉尔图和拟斯卑尔脱总基因组DNA作封阻，比例为1∶50(25+25)；(4)OPF-031296作探针，小麦DNA作封阻，比例为1∶50。
4.杂种染色体特异位点的SSR分析
根据以上GISH和FISH结果，选取小麦2AL、1BL、5BS、1DL、2DL和6DS上的52个引物进行SSR分析。结果表明，其中14个SSR引物对杂种II-1-3和双亲DNA扩增出多态性。杂种与双亲的带型比较可分为以下几种类型：(1)杂种有双亲特征带(P)；(2)杂种只有高冰草的特征带(A)；(3)杂种有高冰草的特征带及新带(A，N)；(4)杂种有济南177的特征带及新带(T，N)；(5)只出现新带(N)；(6)杂种只有小麦的特征带(T)，计算SSR检出位点距着丝点的百分距离及cM距离。
结果：对小麦与高冰草不对称体细胞杂种F5代株系II-1-3和I-1-9的染色体组成及异源染色体存在方式进行分析。花粉母细胞观察统计发现两杂种中分别有84.66％和85.28％的细胞为20-21个二价体，其中环状二价体分别占89.83％和89.57％，表明两杂种的遗传组成基本稳定(图1)。RAPD分析证明两杂种含有双亲的DNA并发生了整合。GISH结果表明高冰草染色体以小片段的方式分布在杂种II-1-3和I-1-9的4～6个染色体上，小片段位于小麦的近着丝粒位置及近端部(图2)。利用对B族和D族染色体特异的高度重复序列pSc119.2和pAs1，E族的重复序列OPF-031296和高冰草总基因组DNA为探针进行FISH和GISH，并结合核型和SSR分析对小麦体细胞杂种株系II-1-3进行高冰草染色体小片段定位。核型比较分析获得杂种与亲本小麦济南177 21对染色体的臂比值和相对长度的基本数据。B、D族特异探针的荧光原位杂交(FISH)分辨出杂种B族和D族及部分A族染色体，其荧光信号的带型与济南177基本一致。进一步用高冰草总基因组DNA及B和D族特异序列对相同的染色体进行sequencial GISH and FISH，并参照核型数据，将高冰草染色体小片段定位在小麦染色体2AL、1BL、5BS、1DL、2DL和6DS的特定位置(图3)。利用E族特异重复序列证明转入的高冰草小片段含有E族染色质。通过SSR的辅助分析验证了GISH/FISH和核型定位的可靠性(图4)。
实例2：燕麦染色体小片段渐渗到小麦体细胞杂种
1.材料与方法
(1)双亲原生质体的来源
分别取小麦(Triticum aestivum L)“济南177”的悬浮系(长期继代已丧失分化能力)(T)、继代两年的胚性愈伤组织(分化频率为75％，再生植株的愈伤组织数/用于分化的愈伤组织数)(T2)及“核生3号”的胚性愈伤组织(继代两年、分化频率约90％)(T3)分离制备原生质体作为受体。
取继代一年半仅具很低分化频率(＜10％)的普通燕麦愈伤组织分离原生质体，方法同小麦。原生质体经纯化后悬浮于洗液(0.6mol/L甘露醇+5mmol/L CaCl2)中，取直径为3.5cm的培养皿放入约0.2ml悬浮液成一薄层用300uW/cm2的紫外线照射1min后作融合供体。
(2)原生质体的融合和培养(同上)
(3)杂种愈伤组织及再生植株的鉴定
同工酶、染色体、RAPD分析、5S-rDNA间隔序列分析和基因组原位杂交分析的方法同上。
2.结果：以小麦品种济南177的悬浮细胞系(长期继代培养已丧失分化能力)来源的原生质体混合同品种胚性愈伤组织(分化能力较强，约70％)制备的原生质体为受体，以经300μW/cm2紫外线照射1min的普通燕麦愈伤组织(分化频率很低，约10％)原生质体作供体，用PEG法诱导融合，获得体细胞杂种再生植株(图5)。RAPD及5S rDNA间隔序列差异分析发现有少量的燕麦核基因存在于杂种中(图6)；染色体荧光原位杂交显示有3-8燕麦染色体小片段易位到小麦染色体(图7)。
实例3：青苗碱谷染色体小片段渐渗到小麦体细胞杂种
方法和步骤同实施例2。
材料和方法如前说述。
结果：青苗碱谷染色体小片段转入小麦(图8)。
实例4：小麦与簇毛麦体细胞杂种中的染色体片段渐渗
簇毛麦用60Co-γ射线辐照.剂量分别为60Gy，剂量率为3.8Gy/min，其余方法和步骤同实施例2。
结果：簇毛麦染色体小片段转入小麦(图9；图10)。
Claims (2)
1.一种利用不对称体细胞杂交技术创建小麦渐渗系的方法，由以下步骤实现：
1)双亲胚性愈伤组织和悬浮细胞系的诱导及筛选，获得培养细胞；2)适宜剂量的γ-射线处理供体原生质体；3)对以上的受体与供体原生质体进行融合及对融合产物进行培养；4)对含有异源染色体小片段及DNA片段的小麦渐渗系进行鉴定及定位，其特征在于：
步骤1)所述双亲胚性愈伤组织和悬浮细胞系的诱导及筛选是指用小麦和与小麦有不同亲缘关系的不同野生和栽培的禾谷类作物的幼胚进行组织培养，从组织培养物中鉴别和筛选快速生长的颗粒型胚性愈伤组织，并且用其建立快速生长的胚性悬浮细胞系，可以产生大量原生质体；步骤2)所述适宜剂量的γ-射线处理供体原生质体是指培养细胞用于酶解分离原生质体指将小麦和供体培养细胞放入含纤维素酶和果胶酶的溶液中，于25℃下游离4小时；γ-射线处理供体原生质体是用400目不锈钢网过滤并离心收集原生质体；供体原生质体调成1×106/mL的密度，铺在直径1.5cm的玻璃培养皿中成薄层后用60Co-γ-射线照射，剂量为60Gy；剂量率为3.8Gy/min；步骤3)所述的对以上受体与供体原生质体进行融合及对融合产物进行培养和筛选，是指将受体及供体原生质体以1×106/ml的密度按1∶1的体积比混合均匀，用PEG法诱导融合，融合产物在P5培养基中培养和再生；当小苗长至5cm高时，转至壮苗培养基上壮苗；移栽至土成活并结实，获得杂种后代；步骤4)对杂种及后代的异源染色体小片段及DNA片段的鉴定及定位是指利用染色体核型、FISH和GISH及SSR技术相结合，对供体染色体小片段在小麦染色体及基因组中的分布和遗传规律进行定性及定量分析，鉴定小麦渐渗系。
2.如权利要求1所述的利用不对称体细胞杂交技术创建小麦渐渗系的方法，其特征在于：所述受体来源于继代培养5-7天的小麦胚性愈伤组织或3-4天的悬浮细胞培养物中的培养细胞，所述供体是指小麦的近缘植物：高冰草、中间燕麦草、新麦草、簇毛麦、羊草、多花黑麦草及小麦的远缘植物：燕麦、玉米、青苗碱谷、高羊茅；所述供体来源于继代培养5-7天的胚性愈伤组织及3-4天的悬浮细胞培养细胞。
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| CNB2004100757747A Expired - Fee Related CN1307313C (zh) | 2004-12-30 | 2004-12-30 | 一种利用不对称体细胞杂交技术创建小麦渐渗系的方法 |
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| CN (1) | CN1307313C (zh) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101139582B (zh) * | 2007-08-10 | 2010-08-18 | 中山大学 | 利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法 |
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| CN102907316B (zh) * | 2012-10-31 | 2016-02-17 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 高效诱导小麦-冰草异源染色体易位的方法 |
| CN103352023B (zh) * | 2013-07-08 | 2014-10-29 | 浙江大学 | 大麦原生质体制备及peg介导转化方法 |
Citations (1)
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| CN1498529A (zh) * | 2002-11-11 | 2004-05-26 | 严成其 | 体细胞杂交创造水稻新种质的方法 |
-
2004
- 2004-12-30 CN CNB2004100757747A patent/CN1307313C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN1498529A (zh) * | 2002-11-11 | 2004-05-26 | 严成其 | 体细胞杂交创造水稻新种质的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 60CO-γ射线对簇毛麦愈伤组织细胞的分裂及染色体的影响 周爱芬等，生物工程学报12(增刊)，第12卷 1996 * |
| 60CO-γ射线对簇毛麦愈伤组织细胞的分裂及染色体的影响 周爱芬等，生物工程学报12(增刊)，第12卷 1996;利用不对称体细胞杂交向小麦转移高冰草染色体小片段 王晶等，中国科学C辑生命科学，第34卷第2期 2004;小麦与新麦草及高冰草属间不对称体细胞杂交的植株再生 夏光敏等，科学通报，第41卷第15期 1996 * |
| 利用不对称体细胞杂交向小麦转移高冰草染色体小片段 王晶等，中国科学C辑生命科学，第34卷第2期 2004 * |
| 小麦与新麦草及高冰草属间不对称体细胞杂交的植株再生 夏光敏等，科学通报，第41卷第15期 1996 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101139582B (zh) * | 2007-08-10 | 2010-08-18 | 中山大学 | 利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法 |
Also Published As
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