CN103695537A - 一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法 - Google Patents

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巩振辉
田士林
李莉
贺玉梅
王军娥
张震
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Abstract

本发明公开了一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法，利用病毒诱导基因沉默技术与辣椒离体果实果色变化相结合的方法对辣椒果实果色发育相关基因和辣椒果色发育无关基因进行功能鉴定，主要包括：构建基因沉默表达载体，经农杆菌GV3101介导侵染辣椒离体果实并观察果色表型的变化。产生沉默效果的离体辣椒果实表现出明显地橙色或黄色症状，说明被检测基因与辣椒果实果色发育相关；相反，果实的果皮颜色转色正常，或果皮颜色没有出现明显变化的，则说明被鉴定基因与辣椒果实果色发育无关，或是无功能基因。该方法为快速验证大量与辣椒果实果色发育相关基因功能提供了方便，可极大地加快辣椒果实品质分子育种进程。

Description

一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法
技术领域
本发明属于植物分子育种领域，具体涉及一种利用病毒诱导的基因沉默技术鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法。
背景技术
辣椒（Capsicum annuum L.）属于茄科（Solanaceae）辣椒属（Capsicum），一年或多年生草本植物，原产于中南美洲热带亚热带地区，现在世界各地普遍栽培，也是我国种植面积最大的蔬菜作物之一。
随着基因组时代和转录组时代的到来，大量的基因功能需要快速鉴定，而传统转基因技术操作复杂、周期长、转化率不高，严重制约着基因功能的鉴定。为此，本发明采用VIGS技术，利用离体辣椒果实，实现对辣椒果实果色发育相关基因的快速鉴定，该方法不影响辣椒植株的其它性状的研究，是一种较为理想的快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法。
辣椒果实中含有叶绿素、类胡萝卜素、花青苷及类黄酮等多种色素，其中类胡萝卜素与辣椒果实颜色关系紧密，类胡萝卜素各组分相对含量的差异造成了辣椒果实颜色多样性。辣椒果色的形成与众多色素合成相关酶基因有关，但是，面对大量的果色相关的基因，如何鉴定基因功能成为一个亟待解决的问题。随着分子生物学技术的快速发展，很多与辣椒果实果色发育相关的基因被克隆出来（Guzman I，Hambly S，Romero J，Bosland P，O’ConnellM.Variability of carotenoid biosynthesis in orange coloured Capsicum spp[J].Plant Sci，（2010）179，49–59.），并采用传统的遗传转化方法对其功能分析。然而，这种常规遗传转化技术存在着许多的局限性，其主要表现在于操作程序复杂、周期长、转化条件要求苛刻、转化效率低且受辣椒品种影响，甚至对某些生物体具有致死效应，严重地制约着分子育种的进程。因此，需要寻找一种快速高效的基因功能鉴定方法。
病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）是从研究病毒和寄主之间的相互作用发展而来。在这个系统中，带有目的基因片段的病毒载体被传递到植物细胞，植物细胞识别入侵病毒的威胁并且利用保护性防卫机制来摧毁病毒和病毒载体上所携带的任何外源基因，从而影响植物本身目的基因的转录过程，导致目的基因mRNA发生特异性降解。即指携带与植物内源功能基因同源序列的病毒在侵染植物之后，能够使植物发生基因沉默从而出现表型突变，可以通过植物表型上的变化来反映该基因的功能。
Fu等（2005）通过VIGS技术对生长在植株上的番茄果实注射携带目的基因片段的烟草脆裂病毒（TRV）获得成功，检验了控制番茄果实的乙烯基因的功能，同时他也对离体番茄果实采用真空渗透法进行VIGS实验，但真空渗透法浸染效率低，且大部分果实在浸染后烂掉，他们认为真空渗透不适合研究与果实成熟相关基因的功能。Jia（2011）和Sun（2013）利用VIGS技术研究果实相关基因的方法也都集中在植株上生长的活体果实，但活体注射最大的缺陷是病毒会浸染植株的其它部位，不利于对植株的其它性状的研究。本发明克服了真空浸透浸染及活体注射的不足，实现了在离体辣椒果实上快速鉴定与辣椒果实果色发育相关基因功能的目的。
病毒诱导的基因沉默是近年来发展起来的一种快速鉴定植物基因功能的方法，它能最大限度地克服传统方法的局限性，具有操作简单、周期短、沉默效率高，且可以在不同遗传背景下生效等优点。因此，适用于大规模的基因功能筛选。
以下是相关参考文献：
1、Wang HM，Yin WC，Wang CK，and To KY.Isolation of functional RNAfrom different tissues of tomato suitable for developmental profiling bymicroarray analysis[J].Bot Stud，2009，（50）:115～125。
2、Wang JE，Liu KK，Li DW，Zhang YL,Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPOD gene of pepper is involved in defense responses tophytophtora capsici Infection as well as abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.2013，（14）：3158～3177。
3、AndréC.Velásquez,Suma Chakravarthy,Gregory B.Martin.Virus-induced Gene Silencing(VIGS)in Nicotiana benthamiana and Tomato[J].Journal of Visualized Experiments，2009，（28）：e1292，DOI:10.3791/1292。
4、刘珂珂，辣椒对疫病的抗性及其机理研究[D].西北农林科技大学博士学位论文（导师：巩振辉），2009，p32。
5、Guzman I，Hamby S，Romero J，Bosland P W，O’Connell M A.Variability of carotenoid biosynthesis in orange colored Capsicum spp[J].PlantSci，2010，（179）：49～59。
6、Fu D Q，Zhu B Z，Liang Z H，Jiang W B，LuoY B.Virus-induced genesilencing in tomato fruit[J].The Plant Journal，2005，（43）：299～308。
7、Jia H F，Chai Y M，Li C L，Qin L，Shen Y Y.Cloning andCharacterization of the H Subunit of a Magnesium Chelatase Gene（PpCHLH）in Peach[J].J Plant Growth Regul，2011，（30）：445～455。
8、Sun J H，Luo J J，Tian L，Li C L，Xing Y，Shen Y Y.New Evidencefor the Role of Ethylene in Strawberry Fruit Ripening[J].J Plant Growth Regul，2013，（32）：461～470。
发明内容
针对上述现有技术中关于辣椒果实果色发育相关基因功能鉴定中存在的问题，本发明的目的在于，提供一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法。
为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因的方法，其特征在于，该方法利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒离体果实果色变化相结合的方法，对辣椒果实果色发育相关基因的功能分析，具体步骤如下：
1）辣椒材料的准备：
选择籽粒饱满的成熟辣椒种子，55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4d种子露白，播于穴盘中，当植株长出8～10片真叶时，移栽塑料大棚进行自然生长，待辣椒花后35天果实处于绿熟期时，采摘果龄一致的果实，带回实验室用于病毒诱导的基因沉默注射；
2）病毒注射后辣椒离体果实的培养：
将注射后的辣椒果实放入人工气候箱，18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养15d左右，观察辣椒离体果实果色表型变化；
3）重组病毒载体的构建：
（1）辣椒果实总RNA的提取与cDNA第一链合成：
采用Trizol法提取辣椒果实总RNA，按TaKaRa公司的反转录试剂盒操作说明进行cDNA第一链合成；
（2）目的基因片段的克隆：
用于基因沉默表达载体构建的基因片段大小要求在150-500bp之间；根据GenBank公布的或已克隆的与辣椒果实果色发育相关基因，以及与果色发育无关基因序列，设计合适的引物序列；以步骤（1）合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒回收目的基因；利用T4DNA连接酶将回收产物连接到克隆载体pMD19-T上，16℃过夜，然后转化到大肠杆菌DH5a中，菌落PCR检测初步确定连接成功后，进行测序，确认克隆基因片段序列与目的基因序列一致时，即可用于构建基因沉默表达载体；
（3）重组载体构建：
选择病毒载体为烟草脆裂病毒载体pTRV1和pTRV2；选择合适的酶切位点对病毒载体pTRV2和步骤（2）经过测序验证含有目的基因序列的克隆载体进行双酶切，37℃过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒回收，利用T4DNA连接酶将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16℃过夜，转化DH5a，用菌落PCR和酶切方法检测出目的基因片段，证明目的基因已经成功转入病毒载体中；
（4）转化农杆菌：
利用冻融法将pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤（3）构建好的重组病毒载体分别导入农杆菌菌株GV3101中，经PCR检测确定为目的基因，保存菌液以备用；
4）农杆菌菌液注射：
（1）农杆菌菌液准备：
将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体的农杆菌菌液按已知的方法进行活化；
（2）注射接种：在注射前将所需镊子、不锈钢果盘、果盘内底部所衬滤纸进行高压灭菌，烘干后转入超净工作台，紫外灯照射30min备用；
果实注射前处理：将离体辣椒果实果面用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2-3次，室内晾干。然后将清洗过的辣椒果实的果柄在事先熔好的石蜡(将盛有固体石蜡的烧杯放置于75℃烘箱中约20min，固体石蜡即可熔化成液体)中快速蘸一下封住果柄顶端伤口，转入超净工作台中。
消毒及注射：将待注射的果实在75%酒精中快速浸蘸30秒后取出，再用无菌水清洗2-3次，然后在靠近辣椒果实的果柄基部先用注射器（一次性使用无菌注射器：规格0.6×25，容量1ml）针头扎个小洞，针头刺入深度约为果柄直径的1/2处（注意不要扎穿果柄，否则将会漏液，影响注射效果），然后用去掉针头的注射器在果柄针孔处注射菌液（注射量：约0.5ml），可见整个果柄出现水渍状；
将注射接种后的离体辣椒果实放入衬有灭菌滤纸的不锈钢果盘中，果实摆放整齐，用保鲜膜封好果盘后置于人工气候箱中。18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养，观察并记录辣椒离体果实果色的表型变化；
5）基因沉默效果检测：
（1）沉默表型观察：
辣椒果实农杆菌注射接种8d～15d就会出现不同程度的病毒症状，证明病毒载体已经成功导入植株体内；
（2）鉴定辣椒果实待检测基因功能：
鉴定方法是，与正常对照相比，注射携带目的基因病毒载体的果实果色呈现橙色或黄色，说明被检测基因与辣椒果色发育相关；相反，果实颜色正常转红或与对照相比果皮红色没有明显差异的，则说明被检定基因与辣椒果色发育无关，或是无功能基因。
本发明的快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法，具有操作简单、无需进行植物遗传转化，在不影响辣椒植株的其它性状研究情况下，实现对辣椒果实果色发育相关基因的快速鉴定，且可以在不同遗传背景下进行鉴定等优点，是一种快速、有效鉴定植物基因功能的方法。
附图说明
图1为辣椒果色CaLCYB基因沉默的表型图片。其中，左图为：pTRV-00（空载体，不含目的基因）（果色为红色）；右图为：pTRV-LCYB（重组载体，携带目的基因）（果色为黄色）。
图2为辣椒果色CaCRTZ基因沉默的表型图片。其中，左图为：pTRV-00（空载体，不含目的基因）（果色为红色）；右图为：pTRV-CRTZ（重组载体，携带目的基因）（果色为黄色）。
图3为辣椒疫病CaPOD基因沉默的表型图片（该基因与果实果色发育无关）。其中，左图为：pTRV-00（空载体，不含目的基因）（果色为红色）；右图为：pTRV-POD（重组载体，携带目的基因）（果色为红色）。
图4为辣椒果色CaPSY基因沉默的表型图片。其中，左图为：pTRV-00（空载体，不含目的基因）（果色为红色）；右图为：pTRV-PSY（重组载体，携带目的基因）（果色为橙黄色）。
图5为辣椒果色CaCCS基因沉默的表型图片。其中，左图为：pTRV-00（空载体，不含目的基因）（果色为红色）；右图为：pTRV-CCS（重组载体，携带目的基因）（果色为黄色）。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
按照本发明的技术方案，发明人给出以下具体的应用实施例，需要说明的是，以下实施例仅是说明性的，本发明并不限于这些实施例。
应用实施例1：
本实施例利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒离体果实果色变化相结合的方法，进行辣椒果实果色发育相关基因的功能分析，具体步骤如下：
1）辣椒材料的准备：
供试材料为成熟果色红色辣椒品种R15。
选择籽粒饱满的辣椒种子，55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4d种子露白，播于穴盘中，当植株长出8-10片真叶时，移栽塑料大棚进行自然生长，待辣椒花后35天果实处于绿熟期时，采摘果龄一致的果实，带回实验室用于病毒诱导的基因沉默注射；
2）病毒注射后辣椒离体果实的培养：
将注射后的辣椒果实放入人工气候箱，18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养（15d左右），观察辣椒离体果实果色表型变化；
3）重组病毒载体的构建：
（1）辣椒果实总RNA的提取与cDNA第一链合成：
采用Trizol法（Wang HM，Yin WC，Wang CK，and To KY.Isolation offunctional RNA from different tissues of tomato suitable for developmentalprofiling by microarray analysis[J].Bot Stud，（2009）50，115～125）提取辣椒果实总RNA，按TaKaRa公司的反转录试剂盒（TaKaRa code:DRR037A,
Figure BDA0000425915370000081
RT reagent kit Perfect Real Time，200reactions）操作说明进行cDNA第一链合成。
（2）目的基因片段的克隆：
用于基因沉默表达载体构建的基因片段大小要求在150-500bp之间；根据GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）公布的辣椒果色相关基因CaLCYB序列（GenBank:X86221.1）设计合成一对带有Bam HI和Kpn I双酶切位点的引物序列Ⅰ：其中：
正向引物：5’-CGCGGATCCCATTGCCCTTTAATCATTTATT-3’；
反向引物：5’-CGGGGTACCTTCACAGAGCTAAAGGCACTAAC-3；
片段大小为320bp；以步骤（1）合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒（天根大量琼脂糖凝胶回收试剂盒DP210）回收目的基因；利用T4DNA连接酶（TaKaRa Code：D2011A，25000units）将回收产物连接到克隆载体pMD19-T（TaKaRa Code：6013，1.0μg）上，16℃过夜，然后转化到大肠杆菌DH5a中（Wang JE，Liu KK，Li DW，Zhang YL，Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPODgene of pepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infectionas well as abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.（2013）14，3158～3177），菌落PCR检测初步确定连接成功后，进行测序，确认克隆基因片段序列与目的基因序列一致时，即可用于构建基因沉默表达载体。
（3）重组载体构建：
用于本实施例的病毒载体为烟草脆裂病毒载体pTRV1和pTRV2。选用Kpn I和Bam HI内切酶对病毒载体pTRV2和经步骤（2）验证过的T-LCYB进行双酶切，37℃过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒（TaKaRa公司）回收。利用T4DNA连接酶(TaKaRa Code：D2011A,25000units)将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16℃过夜。转化DH5a（Wang JE，Liu KK，Li DW,Zhang YL，Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPODgene of pepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infectionas well as abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.(2013)14，3158～3177），用菌落PCR和双酶切方法检测出320bp大小的目的基因片段，证明重组病毒载体pTRV-LCYB已经构建成功，可用于下一步农杆菌侵染。
（4）转化农杆菌：
利用冻融法将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体pTRV-LCTB分别导入农杆菌菌株GV3101中（Wang JE，Liu KK，Li DW，Zhang YL，Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPOD gene ofpepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infection as wellas abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.（2013）14，3158～3177），PCR检测确定扩增出320bp的目的条带，保存菌液以备用。
4）农杆菌菌液注射：
（1）农杆菌菌液准备：
将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体的农杆菌菌液按已知的方法进行活化；具体参考（AndréC.Velásquez，SumaChakravarthy，Gregory B.Martin.Virus-induced Gene Silencing（VIGS）inNicotiana benthamiana and Tomato[J].Journal of VisualizedExperiments，.2009，（28）：e1292，DOI：10.3791/1292）的方法。
（2）注射接种：在注射前将所需镊子、不锈钢果盘、果盘内底部所衬滤纸进行高压灭菌（灭菌条件：121℃，21min），烘干后转入超净工作台，紫外灯（20w）照射30min备用。
果实注射前处理：将离体辣椒果实果面用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2-3次，室内晾干。然后将清洗过的辣椒果实的果柄在事先熔好的石蜡(将盛有固体石蜡的烧杯放置于75℃烘箱中约20min，固体石蜡即可熔化成液体)中快速蘸一下封住果柄顶端伤口，转入超净工作台中。
消毒及注射：将待注射的果实在75%酒精中快速浸蘸30秒后取出，再用无菌水清洗2-3次，然后在靠近辣椒果实的果柄基部先用注射器（一次性使用无菌注射器：规格：0.6×25，容量1ml）针头扎个小洞，针头刺入深度约为果柄直径的1/2处（注意不要扎穿果柄，否则将会漏液，影响注射效果），然后用去掉针头的注射器在果柄针孔处注射菌液（注射量：约0.5ml），可见整个果柄出现水渍状。
将注射接种后的离体辣椒果实放入衬有灭菌滤纸的不锈钢果盘中，果实摆放整齐，用保鲜膜封好果盘后置于人工气候箱中。18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养，观察并记录辣椒离体果实果色的表型变化。
5）基因沉默效果检测：
（1）沉默表型观察：
辣椒果实农杆菌注射接种8d～15d就会出现不同程度的病毒症状，证明病毒载体已经成功导入植株体内。
（2）鉴定辣椒果实待检测基因功能：
鉴定方法是，与正常对照（空载体，不含目的基因，同样环境条件下处理的离体果实）相比，注射携带目的基因病毒载体的果实果色呈现黄色（图1），这一结果说明CaLCYB基因与辣椒果实果色发育相关。这一研究结果与前人研究结论CaLCYB是辣椒果实果色发育相关基因一致（Guzman I，Hamby S，Romero J，Bosland P W，O’Connell M A.Variability of carotenoidbiosynthesis in orange colored Capsicum spp[J].Plant Sci，（2010）179，49～59）。
应用实施例2：
本实施例利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒果实果色变化相结合的方法，进行辣椒果实果色发育相关基因的功能分析，具体如下：
1）辣椒材料的准备：
供试材料为成熟果色红色辣椒品种R15。选择籽粒饱满的辣椒种子，55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4d种子露白，播于穴盘中，当植株长出8～10片真叶时，移栽塑料大棚进行自然生长，待辣椒花后35天果实处于绿熟期时，采摘果龄一致的果实，带回实验室用于病毒诱导的基因沉默注射。
2）病毒注射后辣椒离体果实的培养：
将注射后的辣椒果实放入人工气候箱，18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养（15d左右），观察辣椒离体果实果色表型变化。
3）重组病毒载体的构建：
（1）辣椒果实总RNA的提取与cDNA第一链合成：
采用Trizol法（Wang HM，Yin WC，Wang CK，and To KY.Isolation offunctional RNA from different tissues of tomato suitable for developmentalprofiling by microarray analysis[J].Bot Stud，（2009）50，115-125）提取辣椒果实总RNA，按TaKaRa公司的反转录试剂盒（TaKaRa code：DRR037A,
Figure BDA0000425915370000121
RT reagent kit Perfect Real Time，200reactions）操作说明进行cDNA第一链合成。
（2）目的基因片段的克隆：
用于基因沉默表达载体构建的基因片段大小要求在150-500bp之间；根据GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）公布的辣椒果色相关基因CaCRTZ序列（GenBank:Y09225.1）设计合成一对带有Bam HI和Kpn I双酶切位点的引物序列Ⅱ，其中：
正向引物：5’-CGCGGATCCTCCTTCACCGTACCGTACA-3’；
反向引物：5’-CGGGGTACCTAATAAACTGAAATAACCGCCAT-3’；
片段大小为416bp；以步骤（1）合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒（天根大量琼脂糖凝胶回收试剂盒DP210）回收目的基因；利用T4DNA连接酶（TaKaRa Code:D2011A,25000units）将回收产物连接到克隆载体pMD19-T（TaKaRa Code:6013，1.0μg）上，16℃过夜，然后转化到大肠杆菌DH5a中（Wang JE，Liu KK，Li DW，Zhang YL，Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPOD gene ofpepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infection as wellas abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.（2013）14，3158～3177），菌落PCR检测初步确定连接成功后，进行测序，确认克隆基因片段序列与目的基因序列一致时，即可用于构建基因沉默表达载体；
（3）重组载体构建：
用于本实施例的病毒载体为烟草脆裂病毒载体pTRV1和pTRV2。选用Kpn I和Bam HI内切酶对病毒载体pTRV2和经步骤（2）验证过的T-CRTZ进行双酶切，37℃过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒（TaKaRa公司）回收。利用T4DNA连接酶（TaKaRa Code:D2011A,25000units）将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16℃过夜。转化DH5a（Wang JE，Liu KK，Li DW，Zhang YL，Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPODgene of pepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infectionas well as abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.（2013）14，3158～3177），用菌落PCR和双酶切方法检测出416bp大小的目的基因片段，证明重组病毒载体pTRV-CRTZ已经构建成功，可用于下一步农杆菌侵染。
（4）转化农杆菌：
利用冻融法将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体pTRV-CRTZ分别导入农杆菌菌株GV3101中（Wang JE，Liu KK，Li DW，Zhang YL，Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPOD gene ofpepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infection as wellas abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.（2013）14，3158～3177），PCR检测确定扩增出416bp的目的条带，保存菌液以备用。
4）农杆菌菌液注射：
（1）农杆菌菌液准备：
将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体的农杆菌菌液按已知的方法进行活化；具体参考（AndréC.Velásquez,SumaChakravarthy，Gregory B.Martin.Virus-induced Gene Silencing（VIGS）inNicotiana benthamiana and Tomato[J].Journal of Visualized Experiments，2009，（28）：e1292，DOI：10.3791/1292）的方法。
（2）注射接种：在注射前将所需镊子、不锈钢果盘、果盘内底部所衬滤纸进行高压灭菌（灭菌条件：121℃，21min），烘干后转入超净工作台，紫外灯（20w）照射30min备用。
果实注射前处理：将离体辣椒果实果面用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2-3次，室内晾干。然后将清洗过的辣椒果实的果柄在事先熔好的石蜡(将盛有固体石蜡的烧杯放置于75℃烘箱中约20min，固体石蜡即可熔化成液体)中快速蘸一下封住果柄顶端伤口，转入超净工作台中。
消毒及注射：将待注射的果实在75%酒精中快速浸蘸30秒后取出，再用无菌水清洗2-3次，然后在靠近辣椒果实的果柄基部先用注射器（一次性使用无菌注射器：规格：0.6×25，容量1ml）针头扎个小洞，针头刺入深度约为果柄直径的1/2处（注意不要扎穿果柄，否则将会漏液，影响注射效果），然后用去掉针头的注射器在果柄针孔处注射菌液（注射量：约0.5ml），可见整个果柄出现水渍状；
将注射接种后的离体辣椒果实放入衬有灭菌滤纸的不锈钢果盘中，果实摆放整齐，用保鲜膜封好果盘后置于人工气候箱中，18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养，观察并记录辣椒离体果实果色的表型变化；
5）基因沉默效果检测：
（1）沉默表型观察：
辣椒果实农杆菌注射接种8d-15d就会出现不同程度的病毒症状，证明病毒载体已经成功导入植株体内；
（2）鉴定辣椒果实待检测基因功能：
鉴定方法是，与正常对照（空载体，不含目的基因，同样环境条件下处理的离体果实）相比，注射携带目的基因病毒载体的果实果色呈现黄色（图2），这一结果说明CaCRTZ基因与辣椒果实果色发育相关。这一研究结果与前人研究结论CaCRTZ是辣椒果色发育相关基因一致（Guzman I,Hamby S,Romero J，Bosland P W，O’Connell M A.Variability of carotenoid biosynthesisin orange colored Capsicum spp[J].Plant Sci，（2010）179，49～59）。
应用实施例3：
本实施例利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒果实果色变化相结合的方法，进行与辣椒果实果色发育无关基因的表型验证，具体如下：
1）辣椒材料的准备：
供试材料为成熟果色红色辣椒品种R15。
选择籽粒饱满的辣椒种子，55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4d种子露白，播于穴盘中，当植株长出8～10片真叶时，移栽塑料大棚进行自然生长，待辣椒花后35天果实处于绿熟期时，采摘果龄一致的果实，带回实验室用于病毒诱导的基因沉默注射；
2）病毒注射后辣椒离体果实的培养：
将注射后的辣椒果实放入人工气候箱，18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养（15d左右），观察辣椒离体果实果色表型变化；
3）重组病毒载体的构建：
（1）辣椒果实总RNA的提取与cDNA第一链合成：
采用Trizol法（Wang HM，Yin WC，Wang CK,and To KY.Isolation offunctional RNA from different tissues of tomato suitable for developmentalprofiling by microarray analysis[J].Bot Stud，（2009）50，115～125）提取辣椒果实总RNA，按TaKaRa公司的反转录试剂盒（TaKaRa code：DRR037A，RT reagent kit Perfect Real Time，200reactions）操作说明进行cDNA第一链合成。
（2）目的基因片段的克隆：
用于基因沉默表达载体构建的基因片段大小要求在150～500bp之间；根据申请人课题组克隆的辣椒过氧化物酶（CaPOD）基因序列（NCBI GenBank登录号：FJ596178）（刘珂珂，辣椒对疫病的抗性及其机理研究[D].2009），设计合成一对带有Xba I和Bam HI双酶切位点的引物序列Ⅲ，其中：
正向引物：5’-GGGTCTAGAGTGCTCAACACACACTTTATTCTTCTC-3’；
反向引物：5’-GGG GGATCCCCAAGAATGACAACAGAGTCCCTA-3’；
片段大小为480bp；以步骤（1）合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒（天根大量琼脂糖凝胶回收试剂盒DP210）回收目的基因；利用T4DNA连接酶（TaKaRa Code:D2011A,25000units）将回收产物连接到克隆载体pMD19-T（TaKaRa Code:6013,1.0μg）上，16℃过夜，然后转化到大肠杆菌DH5a中（Wang JE，Liu KK,LiDW，Zhang YL，Zhao Q,He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPODgene of pepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infectionas well as abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.（2013）14，3158-3177），菌落PCR检测初步确定连接成功后，进行测序，确认克隆基因片段序列与目的基因序列一致时，即可用于构建基因沉默表达载体；
（3）重组载体构建：
用于本实施例的病毒载体为烟草脆裂病毒载体pTRV1和pTRV2。选用Xba I和Bam HI内切酶对病毒载体pTRV2和经步骤（2）验证过的T-POD进行双酶切，37℃过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒（TaKaRa公司）回收。利用T4DNA连接酶（TaKaRa Code:D2011A，25000units）将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16℃过夜。转化DH5a（Wang JE，Liu KK，Li DW，Zhang YL，Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPODgene of pepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infectionas well as abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.(2013)14，3158-3177），用菌落PCR和双酶切方法检测出480bp大小的目的基因片段，证明重组病毒载体pTRV-POD已经构建成功，可用于下一步农杆菌侵染。
（4）转化农杆菌：
利用冻融法将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体pTRV-POD分别导入农杆菌菌株GV3101中（Wang JE，Liu KK,，Li DW，Zhang YL，Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPOD gene ofpepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infection as wellas abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.(2013)14，3158-3177），PCR检测确定扩增出480bp的目的条带，保存菌液以备用。
4）农杆菌菌液注射：
（1）农杆菌菌液准备：
将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体的农杆菌菌液按已知的方法进行活化；具体参考（AndréC.Velásquez，SumaChakravarthy，Gregory B.Martin.Virus-induced Gene Silencing（VIGS）inNicotiana benthamiana and Tomato[J].Journal of VisualizedExperiments，.2009，(28)：e1292，DOI:10.3791/1292）的方法。
（2）注射接种：在注射前将所需镊子、不锈钢果盘、果盘内底部所衬滤纸进行高压灭菌（灭菌条件：121℃，21min）,烘干后转入超净工作台，紫外灯（20w）照射30min备用。
果实注射前处理：将离体辣椒果实果面用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2-3次，室内晾干。然后将清洗过的辣椒果实的果柄在事先熔好的石蜡(将盛有固体石蜡的烧杯放置于75℃烘箱中约20min，固体石蜡即可熔化成液体)中快速蘸一下封住果柄顶端伤口，转入超净工作台中。
消毒及注射：将待注射的果实在75%酒精中快速浸蘸30秒后取出，再用无菌水清洗2-3次，然后在靠近辣椒果实的果柄基部先用注射器（一次性使用无菌注射器：规格0.6×25，容量1ml）针头扎个小洞，针头刺入深度约为果柄直径的1/2处（注意不要扎穿果柄，否则将会漏液，影响注射效果），然后用去掉针头的注射器在果柄针孔处注射菌液（注射量：约0.5ml），可见整个果柄出现水渍状；
将注射接种后的离体辣椒果实放入衬有灭菌滤纸的不锈钢果盘中，果实摆放整齐，用保鲜膜封好果盘后置于人工气候箱中。18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养，观察并记录辣椒离体果实果色的表型变化；
5）基因沉默效果检测：
（1）沉默表型观察：
辣椒果实农杆菌注射接种8d～15d就会出现不同程度的病毒症状，证明病毒载体已经成功导入植株体内；
（2）鉴定辣椒果实待检测基因功能：
鉴定方法是，与正常对照（空载体，不含目的基因，同样环境条件下处理的离体果实）相比，注射携带目的基因病毒载体的果实果色与正常对照基本一致（图3），这一结果说明CaPOD基因与辣椒果实果色发育无关。
应用实施例4：
本实施例利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒果实果色变化相结合的方法，进行辣椒果实果色发育相关基因的功能分析，具体如下：
1）辣椒材料的准备：
供试材料为成熟果色红色辣椒品种R15。
选择籽粒饱满的辣椒种子，55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4d种子露白，播于穴盘中，当植株长出8-10片真叶时，移栽塑料大棚进行自然生长，待辣椒花后35天果实处于绿熟期时，采摘果龄一致的果实，带回实验室用于病毒诱导的基因沉默注射；
2）病毒注射后辣椒离体果实的培养：
将注射后的辣椒果实放入人工气候箱，18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养（15d左右），观察辣椒离体果实果色表型变化；
3）重组病毒载体的构建：
（1）辣椒果实总RNA的提取与cDNA第一链合成：
采用Trizol法（Wang HM,Yin WC,Wang CK,and To KY.Isolation offunctional RNA from different tissues of tomato suitable for developmentalprofiling by microarray analysis[J].Bot Stud,(2009)50,115-125）提取辣椒果实总RNA，按TaKaRa公司的反转录试剂盒（TaKaRa code:DRR037A,
Figure BDA0000425915370000191
RT reagent kit Perfect Real Time,200reactions）操作说明进行cDNA第一链合成；
（2）目的基因片段的克隆：
用于基因沉默表达载体构建的基因片段大小要求在150-500bp之间；根据GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）公布的辣椒果色相关基因CaPSY序列（GenBank:X68017.1）设计合成一对带有Bam HI和Kpn I双酶切位点的引物序列Ⅳ，其中：
正向引物：5’-CGCGGATCCTGCCTTGTTATGGGTTGTTT-3’；
反向引物：5’-CGGGGTACCCCTTCTTCACATCTAACTCATCG-3’；
片段大小为347bp；以步骤（1）合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒（天根大量琼脂糖凝胶回收试剂盒DP210）回收目的基因；利用T4DNA连接酶（TaKaRa Code:D2011A,25000units）将回收产物连接到克隆载体pMD19-T（TaKaRa Code:6013,1.0μg）上，16℃过夜，然后转化到大肠杆菌DH5a中（Wang JE，Liu KK，Li DW，ZhangYL，Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPOD gene of pepperis involved in defense responses to phytophtora capsici Infection as well asabiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.(2013)14，3158-3177），菌落PCR检测初步确定连接成功后，进行测序，确认克隆基因片段序列与目的基因序列一致时，即可用于构建基因沉默表达载体；
（3）重组载体构建：
用于本实施例的病毒载体为烟草脆裂病毒载体pTRV1和pTRV2。选用Kpn I和Bam HI内切酶对病毒载体pTRV2和经步骤（2）验证过的T-PSY进行双酶切，37℃过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒（TaKaRa公司）回收。利用T4DNA连接酶（TaKaRa Code:D2011A，25000units）将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16℃过夜。转化DH5a（Wang JE,Liu KK,LiDW,Zhang YL,Zhao Q,He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPODgene of pepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infectionas well as abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.(2013)14，3158-3177），用菌落PCR和双酶切方法检测出347bp大小的目的基因片段，证明重组病毒载体pTRV-PSY已经构建成功，可用于下一步农杆菌侵染。
（4）转化农杆菌：
利用冻融法将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体pTRV-PSY分别导入农杆菌菌株GV3101中（Wang JE，Liu KK，Li DW，Zhang YL，Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPOD gene ofpepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infection as wellas abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.(2013)14，3158-3177），PCR检测确定扩增出347bp的目的条带，保存菌液以备用。
4）农杆菌菌液注射：
（1）农杆菌菌液准备：
将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体的农杆菌菌液按已知的方法进行活化；具体参考（AndréC.Velásquez,SumaChakravarthy,Gregory B.Martin.Virus-induced Gene Silencing(VIGS)inNicotiana benthamiana and Tomato[J].Journal of Visualized Experiments，2009，（28）：e1292，DOI:10.3791/1292）的方法。
（2）注射接种：在注射前将所需镊子、不锈钢果盘、果盘内底部所衬滤纸进行高压灭菌（灭菌条件：121℃，21min），烘干后转入超净工作台，紫外灯（20w）照射30min备用。
果实注射前处理：将离体辣椒果实果面用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2-3次，室内晾干。然后将清洗过的辣椒果实的果柄在事先熔好的石蜡(将盛有固体石蜡的烧杯放置于75℃烘箱中约20min，固体石蜡即可熔化成液体)中快速蘸一下封住果柄顶端伤口，转入超净工作台中。
消毒及注射：将待注射的果实在75%酒精中快速浸蘸30秒后取出，再用无菌水清洗2-3次，然后在靠近辣椒果实的果柄基部先用注射器（一次性使用无菌注射器：规格：0.6×25，容量1ml）针头扎个小洞，针头刺入深度约为果柄直径的1/2处（注意不要扎穿果柄，否则将会漏液，影响注射效果），然后用去掉针头的注射器在果柄针孔处注射菌液（注射量：约0.5ml），可见整个果柄出现水渍状；
将注射接种后的离体辣椒果实放入衬有灭菌滤纸的不锈钢果盘中，果实摆放整齐，用保鲜膜封好果盘后置于人工气候箱中。18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养，观察并记录辣椒离体果实果色的表型变化；
5）基因沉默效果检测：
（1）沉默表型观察：
辣椒果实农杆菌注射接种8d～15d就会出现不同程度的病毒症状，证明病毒载体已经成功导入植株体内；
（2）鉴定辣椒果实待检测基因功能：
鉴定方法是，与正常对照（空载体，不含目的基因，同样环境条件下处理的离体果实）相比，注射携带目的基因病毒载体的果实果色呈现橙黄色（图4），这一结果说明CaPSY基因与辣椒果实果色发育相关。这一研究结果与前人研究结论CaPSY是辣椒果色发育相关基因一致（Guzman I，Hamby S，Romero J，Bosland P W，O’Connell M A.Variability of carotenoid biosynthesisin orange colored Capsicum spp[J].Plant Sci，（2010）179，49–59）。
应用实施例5：
本实施例利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒果实果色变化相结合的方法，进行辣椒果实果色发育相关基因的功能分析，具体如下：
1）辣椒材料的准备：
供试材料为成熟果色红色辣椒品种R15。
选择籽粒饱满的辣椒种子，55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4d种子露白，播于穴盘中，当植株长出8-10片真叶时，移栽塑料大棚进行自然生长，待辣椒花后35天果实处于绿熟期时，采摘果龄一致的果实，带回实验室用于病毒诱导的基因沉默注射；
2）病毒注射后辣椒离体果实的培养：
将注射后的辣椒果实放入人工气候箱，18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养（15d左右），观察辣椒离体果实果色表型变化；
3）重组病毒载体的构建：
（1）辣椒果实总RNA的提取与cDNA第一链合成：
采用Trizol法（Wang HM，Yin WC，Wang CK，and To KY.Isolation offunctional RNA from different tissues of tomato suitable for developmentalprofiling by microarray analysis[J].Bot Stud，（2009）50，115-125）提取辣椒果实总RNA，按TaKaRa公司的反转录试剂盒（TaKaRa code:DRR037A，RT reagent kit Perfect Real Time，200reactions）操作说明进行cDNA第一链合成；
（2）目的基因片段的克隆：
用于基因沉默表达载体构建的基因片段大小要求在150-500bp之间；根据GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）公布的辣椒果色相关基因CaCCS序列（GenBank:X76165.1）设计合成一对带有Bam HI和Kpn I双酶切位点的引物序列Ⅴ，其中：
正向引物：5’-CGCGGATCCCCTTTTCCATCTCCTTTACTT-3’；
反向引物：5’-CGGGGTACCCTGTCCAAATACTTAGTCTTGTGAT-3’；
片段大小为458bp；以步骤（1）合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒（天根大量琼脂糖凝胶回收试剂盒DP210）回收目的基因；利用T4DNA连接酶（TaKaRa Code:D2011A，25000units）将回收产物连接到克隆载体pMD19-T（TaKaRa Code:6013，1.0μg）上，16℃过夜，然后转化到大肠杆菌DH5a中（Wang JE，Liu KK，Li DW，Zhang YL，Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPOD gene ofpepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infection as wellas abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.（2013）14，3158-3177），菌落PCR检测初步确定连接成功后，进行测序，确认克隆基因片段序列与目的基因序列一致时，即可用于构建基因沉默表达载体；
（3）重组载体构建：
用于本实施例的病毒载体为烟草脆裂病毒载体pTRV1和pTRV2。选用Kpn I和Bam HI内切酶对病毒载体pTRV2和经步骤（2）验证过的T-CCS进行双酶切，37℃过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒（TaKaRa公司）回收。利用T4DNA连接酶（TaKaRa Code:D2011A,25000units）将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16℃过夜。转化DH5a（Wang JE，Liu KK，Li DW，Zhang YL，Zhao Q，He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPODgene of pepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infectionas well as abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.(2013)14，3158-3177），用菌落PCR和双酶切方法检测出458bp大小的目的基因片段，证明重组病毒载体pTRV-CCS已经构建成功，可用于下一步农杆菌侵染。
（4）转化农杆菌：
利用冻融法将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体pTRV-CCS分别导入农杆菌菌株GV3101中（Wang JE，Liu KK，Li DW，Zhang YL，Zhao Q,He YM and Gong ZH.A novel peroxidase CaPOD gene ofpepper is involved in defense responses to phytophtora capsici Infection as wellas abiotic stress tolerance.Int.J.Mol.Sci.（2013）14，3158-3177），PCR检测确定扩增出458bp的目的条带，保存菌液以备用。
4）农杆菌菌液注射：
（1）农杆菌菌液准备：
将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体的农杆菌菌液按已知的方法进行活化；具体参考（AndréC.Velásquez,SumaChakravarthy,Gregory B.Martin.Virus-induced Gene Silencing(VIGS)inNicotiana benthamiana and Tomato[J].Journal of VisualizedExperiments,.2009，（28）：e1292，DOI:10.3791/1292）的方法。
（2）注射接种：在注射前将所需镊子、不锈钢果盘、果盘内底部所衬滤纸进行高压灭菌（灭菌条件：121℃，21min）,烘干后转入超净工作台，紫外灯（20w）照射30min备用。
果实注射前处理：将离体辣椒果实果面用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2-3次，室内晾干。然后将清洗过的辣椒果实的果柄在事先熔好的石蜡（将盛有固体石蜡的烧杯放置于75℃烘箱中约20min，固体石蜡即可熔化成液体）中快速蘸一下封住果柄顶端伤口，转入超净工作台中。
消毒及注射：将待注射的果实在75%酒精中快速浸蘸30秒后取出，再用无菌水清洗2-3次，然后在靠近辣椒果实的果柄基部先用注射器（一次性使用无菌注射器：规格0.6×25，容量1ml）针头扎个小洞，针头刺入深度约为果柄直径的1/2处（注意不要扎穿果柄，否则将会漏液，影响注射效果），然后用去掉针头的注射器在果柄针孔处注射菌液（注射量：约0.5ml），可见整个果柄出现水渍状；
将注射接种后的离体辣椒果实放入衬有灭菌滤纸的不锈钢果盘中，果实摆放整齐，用保鲜膜封好果盘后置于人工气候箱中。18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养，观察并记录辣椒离体果实果色的表型变化；
5）基因沉默效果检测：
（1）沉默表型观察：
辣椒果实农杆菌注射接种8d-15d就会出现不同程度的病毒症状，证明病毒载体已经成功导入植株体内；A
（2）鉴定辣椒果实待检测基因功能：
鉴定方法是，与正常对照（空载体，不含目的基因，同样环境条件下处理的离体果实）相比，注射携带目的基因病毒载体的果实果色呈现黄色（图5），这一结果说明CaCCS基因与辣椒果实果色发育相关。这一研究结果与前人研究结论CaCCS是辣椒果色发育相关基因一致（Guzman I，Hamby S，Romero J，Bosland P W，O’Connell M A.Variability of carotenoid biosynthesisin orange colored Capsicum spp[J].Plant Sci，(2010)179，49–59）。

Claims (1)

1.一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因的方法，其特征在于，该方法利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒离体果实果色变化相结合的方法，对辣椒果实果色发育相关基因的功能分析，具体步骤如下：
1）辣椒材料的准备：
选择籽粒饱满的成熟辣椒种子，55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4d种子露白，播于穴盘中，当植株长出8～10片真叶时，移栽塑料大棚进行自然生长，待辣椒花后35天果实处于绿熟期时，采摘果龄一致的果实，带回实验室用于病毒诱导的基因沉默注射；
2）病毒注射后辣椒离体果实的培养：
将注射后的辣椒果实放入人工气候箱，18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养15d，观察辣椒离体果实果色表型变化；
3）重组病毒载体的构建：
（1）辣椒果实总RNA的提取与cDNA第一链合成：
采用Trizol法提取辣椒果实总RNA，按TaKaRa公司的反转录试剂盒操作说明进行cDNA第一链合成；
（2）目的基因片段的克隆：
用于基因沉默表达载体构建的基因片段大小要求在150-500bp之间；根据GenBank公布的或已克隆的与辣椒果实果色发育相关基因，以及与辣椒果实果色发育无关基因序列，设计合适的引物序列；
以步骤（1）合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒回收目的基因；利用T4DNA连接酶将回收产物连接到克隆载体pMD19-T上，16℃过夜，然后转化到大肠杆菌DH5a中，菌落PCR检测初步确定连接成功后，进行测序，确认克隆基因片段序列与目的基因序列一致时，即用于构建基因沉默表达载体；
（3）重组载体构建：
选择病毒载体为烟草脆裂病毒载体pTRV1和pTRV2；选择合适的酶切位点对病毒载体pTRV2和步骤（2）经过测序验证含有目的基因序列的克隆载体进行双酶切，37℃过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒回收，利用T4DNA连接酶将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16℃过夜，转化感受态DH5a，用菌落PCR和酶切方法检测出目的基因片段，证明目的基因已经成功转入病毒载体中；
（4）转化农杆菌：
利用冻融法将pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤（3）构建好的重组病毒载体分别导入农杆菌菌株GV3101中，经PCR检测确定为目的基因，保存菌液以备用；
4）农杆菌菌液注射：
（1）农杆菌菌液准备：
将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3）构建好的病毒载体的农杆菌菌液按已知的方法进行活化；
（2）注射接种：在注射前将所需镊子、不锈钢果盘、果盘内底部所衬滤纸进行高压灭菌，烘干后转入超净工作台，紫外灯照射30min备用；
果实注射前处理：将离体辣椒果实果面用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2-3次，室内晾干。然后将清洗过的辣椒果实的果柄在事先熔好的石蜡中快速蘸一下封住果柄顶端伤口，转入超净工作台中。
消毒及注射：将待注射的果实在75%酒精中快速浸蘸30秒后取出，再用无菌水清洗2-3次，然后在靠近辣椒果实的果柄基部先用注射器针头扎个小洞，针头刺入深度约为果柄直径的1/2处，然后用去掉针头的注射器在果柄针孔处注射菌液0.5ml，可见整个果柄出现水渍状；
将注射接种后的离体辣椒果实放入衬有灭菌滤纸的不锈钢果盘中，果实摆放整齐，用保鲜膜封好果盘后置于人工气候箱中；18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx，条件下进行培养，观察并记录辣椒离体果实果色的表型变化；
5）基因沉默效果检测：
（1）沉默表型观察：
辣椒果实农杆菌注射接种8d～15d就会出现不同程度的病毒症状，证明病毒载体已经成功导入植株体内；
（2）鉴定辣椒果实待检测基因功能：
鉴定方法：与正常对照相比，注射携带目的基因病毒载体的果实果色呈现橙色或黄色，说明被检测基因与辣椒果实果色发育相关；相反，果实颜色正常转红或与对照相比果皮红色没有明显差异的，则说明被检测基因与辣椒果实果色发育无关，或是无功能基因。
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