CN115011634B - 利用植原体效应因子sjp1和sjp2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物细胞工程和分子生物学技术领域，具体涉及利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法。利用酸枣叶片诱导的愈伤组织遗传转化体系，与对照组相比，效应因子SJP1和SJP2可显著增加愈伤组织不定芽诱导率和出芽系数；同时借助荧光标记辅助筛选，在转化早期不破坏样本的情况下即可鉴定阳性植株。该方法方便快捷、省时省力且大大提高木本植物转基因外植体的再生效率，这些效应因子为改良植物遗传转化体系提供了重要的基因资源。
Description
技术领域
本发明涉及植物细胞工程和分子生物学技术领域，具体涉及利用植原体效应因子SJP1和 SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法。
背景技术
枣(Ziziphus jujuba Mill.)是原产我国的、具有重要经济价值的古老果树之一，广泛种植于山沙碱旱地区。生产上，大多数枣种质存在不同程度的胚败育现象，严重制约了枣种质创新。遗传转化可以在不改变原有种质优良性状的基础上，利用现代生物技术手段对不符合产业需求的性状进行定向改良，但转基因愈伤过低的再生效率是限制遗传转化技术成功应用的瓶颈。因此，提高愈伤组织再生效率是促进遗传转化技术顺利应用于枣种质创新的有效途径之一。植原体侵染诱发的枣疯病(jujube witches’broom)虽然是枣产业上的毁灭性病害，但病株表现出的丛枝性状表明，可以将促进枣侧芽不断萌发形成丛枝的效应因子应用于枣愈伤组织不定芽的诱导，以提高转基因愈伤再生效率，同时也为其它植物遗传转化的顺利开展提供借鉴。
鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。
发明内容
本发明的目的在于解决如何基于酸枣愈伤组织为受体的遗传转化体系，促进枣愈伤组织不定芽发生、提高转基因愈伤再生效率的问题，提供了利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法。
为了实现上述目的，本发明公开了利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法，包括以下步骤：
S1：农杆菌培养与浸染液制备
以酸枣叶片诱导的愈伤组织作为遗传转化材料，分别将携带SJP1-GFP和SJP2-GFP重组质粒的农杆菌菌液接种于液体LB培养基，暗培养菌液直至OD600为0.6～0.8；将OD600为0.6～0.8的农杆菌菌液常温下离心，弃上清，用液体MS重悬，得到浸染液；35S::GFP作为对照组；
S2：愈伤组织浸染
将步骤S1中得到的浸染液与酸枣愈伤组织放于28℃恒温振荡培养箱，转速120rpm，共培养30min后获得浸染后的愈伤组织；
S3：共培养
将步骤S2中浸染后的愈伤组织沥干表面侵染液，放于1/2MS共培养基上，暗培养2～3 天；
S4：脱菌
用含有头孢噻肟钠的无菌水清洗步骤S3所得的酸枣愈伤组织；
S5：抑菌培养
将步骤S4中清洗后得到的酸枣愈伤组织，放于半固体1/2MS抑菌培养基上，暗培养30 天；
S6：筛选培养
将步骤S5中得到的酸枣愈伤组织放于半固体1/2MS筛选培养基上，经3～5代，每代4 周的筛选培养，得到35::SJP1-GFP、35::SJP2-GFP和35::GFP转基因愈伤；
S7：SJP1与SJP2转基因枣愈伤组织出芽
将步骤S6获得SJP1与SJP2转基因枣愈伤，放于半固体1/3MS出芽培养基上，培养30天，使SJP1和SJP2转基因枣愈伤组织诱导出不定芽；35S::GFP作为对照组；
S8：SJP1与SJP2转基因枣不定芽继代
将步骤S7中出芽愈伤组织放于半固体1/2MS芽继代培养基上，每3～4周继代一次不定芽；
S9：SJP1与SJP2转基因枣不定芽诱导生根
将步骤S8所得的枣愈伤芽放于半固体1/2MS生根培养基上，每3～4周继代一次；
S10：SJP1与SJP2转基因枣株系鉴定
利用RT-PCR方法及GFP荧光报告系统对SJP1与SJP2转基因枣株系进行检测，根据是否有报告基因目的条带及绿色荧光，确定目的基因是否插入枣基因组及蛋白表达情况。
所述步骤S1中农杆菌为GV3101，其携带的质粒载体分别为pCAMBIA2300-SJP1-GFP、 pCAMBIA2300-SJP2-GFP和pCAMBIA2300-GFP绿色荧光表达载体，农杆菌菌液的接种量为 0.25～0.5％，所述液体LB培养基包括50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平，暗培养的条件为恒温摇床、28℃、120rpm，液体MS中加入有200μmol/L的乙酰丁香酮。
所述步骤S3中1/2MS共培养基包括0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.4mg/L噻苯隆、10g/L 蔗糖，7g/L琼脂、pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
所述步骤S4中头孢噻肟钠的无菌水中头孢噻肟钠的浓度为250mg/L，清洗次数为3～4 次，每次时间为7～8min。
所述步骤S5中1/2MS抑菌培养基包括0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.4mg/L噻苯隆、 250mg/L头孢霉素、10g/L蔗糖、7g/L琼脂、pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
所述步骤S6中1/2MS筛选培养基包括0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.4mg/L噻苯隆、 40mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素、10g/L蔗糖、7g/L琼脂、pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
所述步骤S7中半固体1/3MS愈伤诱导出芽培养基包括0.25mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、 0.2mg/L噻苯隆、40mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素、10g/L蔗糖、7g/L琼脂、pH5.8～6.0 的半固体1/3MS培养基。
所述步骤S8中半固体1/2MS芽继代培养基包括1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L吲哚丁酸、40mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素、10g/L蔗糖、7g/L琼脂、pH5.8～6.0的半固体1/2MS 培养基。
所述步骤S9半固体1/2M生根培养基包括1.0mg/L吲哚丁酸、40mg/L卡那霉素、250mg/L 头孢霉素、10g/L蔗糖、7g/L琼脂、pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
所述步骤S3、S5、S6、S7、S8、S9中的培养条件为：温度23～25℃，光周期12～14h/d，光照强度2500～2800lx。
与现有技术比较本发明的有益效果在于：本发明利用酸枣叶片诱导的愈伤组织遗传转化体系，发现植原体效应因子SJP1和SJP2可显著增加愈伤组织不定芽诱导率和出芽系数，提高木本植物转基因效率。枣愈伤组织来源广泛，同时借助荧光标记辅助筛选，方便快捷、省时省力且转化效率高。这些效应因子不仅为改良不定芽发生困难的木本植物遗传转化体系提供重要的基因资源，也为解析植原体致病机制提供宝贵的材料；
本发明从枣疯病病株首次分离出两个SAP11类效应因子SJP1和SJP2(SecretedJWB protein 1and 2)；通过构建35S:SJP1-GFP和35S:SJP2-GFP植物过表达载体，利用农杆菌介导的酸枣叶片愈伤组织转化体系，获得SJP1和SJP2转基因枣植株。与空载对照相比，效应因子SJP1/2显著提高愈伤组织形成不定芽的数量和出芽系数。这些效应因子不仅可以提高枣转基因效率，还可以用来分子改良不定芽发生困难的其他果树、蔬菜和花卉等，无论在生产还是科研均具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为效应因子SJP1/2植物过表达载体示意图；
图2为利用农杆菌介导法将效应因子SJP1/2遗传转化至枣愈伤；
图3为效应因子SJP1/2转基因枣愈伤RT-PCR鉴定；
图4为效应因子SJP1/2转基因枣愈伤不定芽诱导；
图5为效应因子SJP1/2转基因枣不定芽荧光观察；
图6为效应因子SJP1/2转基因枣愈伤不定芽诱导率；
图7为效应因子SJP1/2转基因枣愈伤组织出芽系数；
图8为效应因子SJP1/2转基因枣不定根诱导；
具体实施方式
以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
本实施例以来源于酸枣实生苗叶片诱导的愈伤组织为受体，建立促进其再生植株的遗传转化方法。
实施例1
本实施例为效应因子SJP1促进转基因枣愈伤形成不定芽
1、农杆菌培养与浸染液制备
将携带表达载体35S::SJP1-GFP的农杆菌菌液GV3101接种于40mL液体LB培养基，置恒温摇床以28℃、200rpm的条件暗培养菌液，使OD600值为0.6～0.8。放于离心机以28℃、5000rpm的转速，离心5min，去上清，收集菌体，再以等体积的液体MS重悬液，重悬菌体，得到浸染液，液体MS重悬液是液体MS中加入200μM乙酰丁香酮。所述农杆菌菌液GV3101 的接种量为0.25～0.5％；所述液体LB(蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L，pH 7.3～7.5)含50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平。
所述农杆菌GV3101携带的表达载体为pCAMBIA2300-SJP1-GFP，其质粒图谱如图1所示。所述表达载体以卡那霉素抗性kanamycin resistance基因作为筛选标记基因，携带GFP绿色荧光报告基因
2、愈伤浸染、共培养与脱菌
将所述浸染液与酸枣愈伤于恒温摇床以28℃、120rpm的条件黑暗共培养30min，得到浸染后的酸枣愈伤。
将上述所得浸染后的酸枣愈伤放于滤纸上沥干浸染液后置于半固体1/2MS共培养基，黑暗条件下共培养2～3天，所述半固体1/2MS共培养基是指含0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
将上述所得共培养后的酸枣愈伤用含有250mg/L头孢噻肟钠的无菌水清洗7～8min，重复3～4次。
培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。MS基本培养基配方如下所示：
(1)大量元素20×，包括母液I(KNO3 38g/L，NH4NO3 33g/L，MgSO4·7H2O 7.4g/L)；母液II(KH2PO4 3.4g/L)；母液III(CaCl2 6.64g/L)。
(2)微量1000×(MnSO4·H2O 16.9g/L，ZnSO4·7H2O 8.6g/L，H3BO3 6.2g/L，KI0.83g/L， Na2MoO4·2H2O 0.25g/L，CuSO4·5H2O 0.025g/L，CoCl2·6H2O 0.025g/L)。
(3)铁盐200×(乙二胺四乙酸二钠7.46g/L，FeSO4·7H2O 5.56g/L)。
(4)有机元素200×(肌醇20g/L，甘氨酸0.4g/L，烟酸VB3 0.1g/L，盐酸吡哆醇VB60.1g/L，盐酸硫胺素VB1 0.02g/L)。
(5)上述半固体MS培养基还包括10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH值5.8～6.0。
3、抑菌及筛选培养
将上述所得酸枣愈伤置于半固体1/2MS抑菌培养基，抑菌暗培养30天。
所述半固体1/2MS抑菌培养基是指含0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及250mg/L头孢霉素和10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。将抑菌培养后的SJP1转基因愈伤置于半固体1/2MS筛选培养基，继代SJP1转基因愈伤时要尽可能夹碎，创造伤口，将每一块SJP1转基因愈伤转接至新的筛选培养基，这样历经第一次筛选培养后独立的SJP1转基因愈伤块称做一个株系。所述半固体1/2MS筛选培养基是指含0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及40mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素以及10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基；所述愈伤经3～5代、每代3～4周的筛选培养后，得到SJP1转基因愈伤(如图2)。
4、SJP1转基因愈伤RT-PCR检测
利用RT-PCR方法检测SJP1转基因愈伤报告基因的表达状况；首先采集SJP1转基因愈伤块，液氮研磨后提取RNA，经反转录后得到SJP1转基因愈伤的cDNA；以RT-SJP1-F：TCAAATGTTATCAAACCCAG，RT-SJP1-R：TTTCTTGAGTTTTGGTTTCT为引物，SJP1转基因愈伤的cDNA为模板，进行PCR扩增反应。2×Fast Taq PCR体系为25μL，具体包括： ddH2O 10μL，2×Fast Taq 12μL，Primer R 1μL，Primer L 1μL，模板1μL；反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸15s；35个循环；72℃终延伸10min， 8℃终止反应，4℃保存；扩增产物在1％琼脂糖/Gel Red胶上进行检测。根据是否有报告基因 SJP1条带(71bp)，确定目的基因的整合状况。
图3为经RT-PCR检测的SJP1抗性愈伤不同株系的电泳图，均检测出目标条带，表明报告基因已整合到转基因酸枣愈伤的基因组中。
5、SJP1转基因愈伤诱导不定芽及荧光观察
分别取5块上述鉴定为PCR阳性的SJP1转基因愈伤放于1瓶含有1/3MS出芽培养基，共计10瓶，培养30天诱导不定芽形成(如图4)。
对SJP1转基因不定芽进行荧光观察(如图5)，于LUYOR-3415RG Hand-Held Lamp双荧光蛋白观测灯下，用黄色滤光镜观测，发出绿色荧光的为SJP1转基因不定芽。对SJP1转基因不定芽进行出芽率和出芽系数进行统计，结果表明50块SJP1转基因愈伤中16块诱导出具有绿色荧光的不定芽，占32％(如图6)；其中每块愈伤诱导出一个、二个和三个不定芽的分别有9块、5块和2块(如图7)。
所述1/3MS出芽培养基是指含有0.25mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.2mg/L噻苯隆，40mg/L 卡那霉素，250mg/L头孢霉素，10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/3MS培养基。
6、SJP1转基因不定芽继代：
将上述SJP1转基因不定芽放于1/2MS芽继代培养基，培养30天。
所述1/2MS芽继代培养基是指含有1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L吲哚丁酸，40mg/L 卡那霉素，250mg/L头孢霉素，10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
7、SJP1转基因不定芽诱导生根
将上述SJP1转基因不定芽放于1/2MS生根培养基，继代2～3代，每代培养30～40天(如图8)。
所述1/2MS芽生根培养基是指含有1.0mg/L吲哚丁酸，40mg/L卡那霉素，250mg/L头孢霉素，10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
实施例2
本实施例为效应因子SJP2促进转基因枣愈伤形成不定芽
1、农杆菌培养与浸染液制备
将携带表达载体35S::SJP2-GFP的农杆菌菌液GV3101接种于40mL液体LB培养基，置恒温摇床以28℃、200rpm的条件暗培养菌液，使OD600值为0.6～0.8。放于离心机以28℃、5000rpm的转速，离心5min，去上清，收集菌体，再以等体积的液体MS重悬液，重悬菌体，得到浸染液，液体MS重悬液是液体MS中加入200μM乙酰丁香酮。所述农杆菌菌液GV3101 的接种量为0.25～0.5％；所述液体LB(蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L，pH 7.3～7.5)含50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平。
所述农杆菌GV3101携带的表达载体为pCAMBIA2300-SJP2-GFP，其质粒图谱如图1所示。所述表达载体以卡那霉素抗性kanamycin resistance基因作为筛选标记基因，携带GFP绿色荧光报告基因
2、愈伤浸染、共培养与脱菌
将所述浸染液与酸枣愈伤于恒温摇床以28℃、120rpm的条件黑暗共培养30min，得到浸染后的酸枣愈伤。
将上述所得浸染后的酸枣愈伤放于滤纸上沥干浸染液后置于半固体1/2MS共培养基，黑暗条件下共培养2～3天，所述半固体1/2MS共培养基是指含0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和 0.4mg/L噻苯隆以及10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
将上述所得共培养后的酸枣愈伤用含有250mg/L头孢噻肟钠的无菌水清洗7～8min，重复3～4次。
培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。MS基本培养基配方如下所示：
(1)大量元素20×，包括母液I(KNO3 38g/L，NH4NO3 33g/L，MgSO4·7H2O 7.4g/L)；母液II(KH2PO4 3.4g/L)；母液III(CaCl2 6.64g/L)。
(2)微量1000×(MnSO4·H2O 16.9g/L，ZnSO4·7H2O 8.6g/L，H3BO3 6.2g/L，KI0.83g/L， Na2MoO4·2H2O 0.25g/L，CuSO4·5H2O 0.025g/L，CoCl2·6H2O 0.025g/L)。
(3)铁盐200×(乙二胺四乙酸二钠7.46g/L，FeSO4·7H2O 5.56g/L)。
(4)有机元素200×(肌醇20g/L，甘氨酸0.4g/L，烟酸VB3 0.1g/L，盐酸吡哆醇VB60.1g/L，盐酸硫胺素VB1 0.02g/L)。
(5)上述半固体MS培养基还包括10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH值5.8～6.0。
3、抑菌及筛选培养
将上述所得酸枣愈伤置于半固体1/2MS抑菌培养基，抑菌暗培养30天。
所述半固体1/2MS抑菌培养基是指含0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及 250mg/L头孢霉素和10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。将抑菌培养后的SJP2转基因愈伤置于半固体1/2MS筛选培养基，继代SJP2转基因愈伤时要尽可能夹碎，创造伤口，将每一块SJP2转基因愈伤转接至新的筛选培养基，这样历经第一次筛选培养后独立的SJP2转基因愈伤块称做一个株系。所述半固体1/2MS筛选培养基是指含0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及40mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素以及10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基；所述愈伤经3～5代、每代3～4周的筛选培养后，得到SJP2转基因愈伤(如图2)。
4、SJP2转基因愈伤RT-PCR检测
利用RT-PCR方法检测SJP2转基因愈伤报告基因的表达状况；首先采集SJP2转基因愈伤块，液氮研磨后提取RNA，经反转录后得到SJP2转基因愈伤的cDNA；以RT-SJP2-F：AAAAGATATAATTTCATCCAAGGAAGAAGC，RT-SJP2-R： CCTTTTTCTTGAGTTTTAGTTTCTTTAATTTTTTC为引物，SJP2转基因愈伤的cDNA为模板，进行PCR扩增反应。2×Fast Taq PCR体系为25μL，具体包括：ddH2O 10μL，2×Fast Taq 12μL，Primer R 1μL，Primer L 1μL，模板1μL；反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30 s；55℃退火30s；72℃延伸15s；35个循环；72℃终延伸10min，8℃终止反应，4℃保存；扩增产物在1％琼脂糖/Gel Red胶上进行检测。；根据是否有报告基因SJP2条带(183bp)，确定目的基因的整合状况。
图3为经RT-PCR检测的SJP2抗性愈伤不同株系的电泳图，均检测出目标条带，表明报告基因已整合到转基因酸枣愈伤的基因组中。
5、SJP2转基因愈伤诱导不定芽及荧光观察
分别取50块上述鉴定为PCR阳性的SJP2转基因愈伤放于1瓶含有1/3MS出芽培养基，共计10瓶，培养30天诱导不定芽形成(如图4)。
对SJP2转基因不定芽进行荧光观察(如图5)，于LUYOR-3415RG Hand-Held Lamp双荧光蛋白观测灯下，用黄色滤光镜观测，发出绿色荧光的为SJP2转基因不定芽。对SJP2转基因不定芽进行出芽率和出芽系数进行统计，结果表明50块SJP2转基因愈伤中25块诱导出具有绿色荧光的不定芽，占50％(如图6)；其中每块愈伤诱导出一个、二个和三个不定芽的分别有15块、7块和3块(如图7)。
所述1/3MS出芽培养基是指含有0.25mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.2mg/L噻苯隆，40mg/L 卡那霉素，250mg/L头孢霉素，10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/3MS培养基。
6、SJP2转基因不定芽继代：
将上述SJP2转基因不定芽放于1/2MS芽继代培养基，培养30天。所述1/2MS芽继代培养基是指含有1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L吲哚丁酸，40mg/L卡那霉素，250mg/L头孢霉素，10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
7、SJP2转基因不定芽诱导生根
将上述SJP2转基因不定芽放于1/2MS生根培养基，继代2～3代，每代培养30～40天(如图8)。
所述1/2MS芽生根培养基是指含有1.0mg/L吲哚丁酸，40mg/L卡那霉素，250mg/L头孢霉素，10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
实施例3
本实施例为对照组35S::GFP诱导不定芽
发明人前期建立酸枣愈伤组织转化体系，已获得35S::GFP转基因愈伤组织。本发明在此基础上进行不定芽诱导。
35S::GFP转基因愈伤诱导不定芽及荧光观察
将上述鉴定PCR阳性的35S::GFP转基因愈伤组织进行荧光观察(如图5)，于LUYOR-3415RG Hand-Held Lamp双荧光蛋白观测灯下，用黄色滤光镜观测，发出绿色荧光的为35S::GFP转基因愈伤组织。分别取5块上述鉴定为GFP荧光阳性的35S::GFP转基因愈伤放于1瓶含有1/3MS出芽培养基，共计10瓶，培养30天诱导不定芽形成(如图4)。
对GFP转基因愈伤进行不定芽出芽率和出芽系数进行统计，结果表明50块GFP转基因愈伤均无不定芽形成(如图6和图7)。
所述1/3MS出芽培养基是指含有0.25mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.2mg/L噻苯隆，40mg/L 卡那霉素，250mg/L头孢霉素，10g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体1/3MS培养基。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：农杆菌培养与浸染液制备
以酸枣叶片诱导的愈伤组织作为遗传转化材料，分别将携带SJP1-GFP和SJP2-GFP重组质粒的农杆菌菌液接种于液体LB培养基，暗培养菌液直至OD600为0.6～0.8；将OD600为0.6～0.8的农杆菌菌液常温下离心，弃上清，用液体MS重悬，得到浸染液；
S2：愈伤组织浸染
将步骤S1中得到的浸染液与酸枣愈伤组织放于28℃恒温振荡培养箱，转速120rpm，共培养30分钟后获得浸染后的愈伤组织；
S3：共培养
将步骤S2中浸染后的愈伤组织沥干表面侵染液，放于1/2MS共培养基上，暗培养2～3天；
S4：脱菌
用含有头孢噻肟钠的无菌水清洗步骤S3所得的酸枣愈伤组织；
S5：抑菌培养
将步骤S4中清洗后得到的酸枣愈伤组织，放于半固体1/2MS抑菌培养基上，暗培养30天；
S6：筛选培养
将步骤S5中得到的酸枣愈伤组织放于半固体1/2MS筛选培养基上，经3～5代，每代4周的筛选培养，得到35::SJP1-GFP、35::SJP2-GFP和35::GFP转基因愈伤；
S7：SJP1与SJP2转基因枣愈伤组织出芽
将步骤S6获得SJP1与SJP2转基因枣愈伤，放于半固体1/3MS出芽培养基上，培养30天，使SJP1和SJP2转基因枣愈伤组织诱导出不定芽；
S8：SJP1与SJP2转基因枣不定芽继代
将步骤S7中出芽愈伤组织放于半固体1/2MS芽继代培养基上，每3～4周继代一次不定芽；
S9：SJP1与SJP2转基因枣不定芽诱导生根
将步骤S8所得的枣愈伤芽放于半固体1/2MS生根培养基上，每3～4周继代一次；
S10：SJP1与SJP2转基因枣株系鉴定
利用RT-PCR方法及GFP荧光报告系统对SJP1与SJP2转基因枣株系进行检测，根据是否有报告基因目的条带及绿色荧光，确定目的基因是否插入枣基因组及蛋白表达情况。
2.如权利要求1所述的利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤S1中农杆菌为GV3101，其携带的质粒载体分别为pCAMBIA2300-SJP1-GFP、pCAMBIA2300-SJP2-GFP和pCAMBIA2300-GFP绿色荧光表达载体，农杆菌菌液的接种量为0.25～0.5％，所述液体LB培养基包括50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平，暗培养的条件为恒温摇床、28℃、200rpm，液体MS中加入有200μmol/L的乙酰丁香酮。
3.如权利要求1所述的利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤S3中1/2MS共培养基包括0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.4mg/L噻苯隆、10g/L蔗糖，7g/L琼脂、pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
4.如权利要求1所述的利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤S4中头孢噻肟钠无菌水中头孢噻肟钠的浓度为250mg/L，清洗次数为3～4次，每次时间为7～8min。
5.如权利要求1所述的利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤S5中1/2MS抑菌培养基包括0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.4mg/L噻苯隆、250mg/L头孢霉素、10g/L蔗糖、7g/L琼脂、pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
6.如权利要求1所述的利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤S6中1/2MS筛选培养基包括0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.4mg/L噻苯隆、40mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素、10g/L蔗糖、7g/L琼脂、pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
7.如权利要求1所述的利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤S7中半固体1/3MS愈伤诱导出芽培养基包括0.25mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.2mg/L噻苯隆、40mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素、10g/L蔗糖、7g/L琼脂、pH5.8～6.0的半固体1/3MS培养基。
8.如权利要求1所述的利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤S8中半固体1/2MS芽继代培养基包括1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L吲哚丁酸、40mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素、10g/L蔗糖、7g/L琼脂、pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
9.如权利要求1所述的利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤S9半固体1/2M生根培养基包括1.0mg/L吲哚丁酸、40mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素、10g/L蔗糖、7g/L琼脂、pH5.8～6.0的半固体1/2MS培养基。
10.如权利要求1所述的利用植原体效应因子SJP1和SJP2促进酸枣愈伤组织形成不定芽的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤S3、S5、S6、S7、S8、S9中的培养条件为：温度23～25℃，光周期12～14h/d，光照强度2500～2800lx。
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| 枣疯病植原体致病效应因子的鉴定及Zaofeng6诱导丛枝发生机制;陈鹏;《中国知网博士电子期刊》(第4期);第1-70页 * |
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