CN114698554B - 满天星的遗传转化体系的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种满天星的遗传转化体系的构建方法。所述构建方法：以满天星茎尖为外植体，经预培养后，用活化的农杆菌对其进行侵染，之后依次进行共培养、第一轮筛选培养、第二轮筛选培养、恢复培养、扩繁培养和生根培养；其中，取满天星幼苗茎尖，去除所有的叶子，抹掉顶端分生组织部分，将茎尖切成2‑3片3‑5mm的组织，即为所述外植体。本发明提供一种利用茎尖为受体建立满天星遗传转化体系的方法，该方法遗传转化效率显著提升，且转化周期短，为满天星规模化快繁及遗传育种奠定基础。
Description
技术领域
本发明实施例涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种满天星的遗传转化体系的构建方法。
背景技术
满天星(Gypsophila paniculata L.)，又名圆锥石头花、丝石竹、霞草等，是石竹科石头花属的多年生草本植物，同时也是石头花属唯一用作切花的物种。满天星因其叶片小而少，花枝多，花量大，花朵小而洁白，成为了世界上用量最大的配花材料之一，同时也是全球十大畅销切花之一。满天星种植范围广泛，除了荷兰和以色列主要生产国，哥伦比亚、厄瓜多尔、中国和秘鲁等国家的产量也日益加大。我国从20世纪90年代开始引入重瓣满天星作为鲜切花品种进行栽培，经过30多年的发展，满天星已经成为云南地区主要栽培鲜切花品种之一。目前，满天星已成为云南花卉产业的主打产品，在云南高原特色花卉产业中占有重要地位。云南省农科院自主培育和推广的满天星‘云星’系列花白色，花型大，植株茎粗壮，叶片宽，无效花枝少，具有较好的观赏及商业性状，近年来满天星‘云星’系列在云南花卉市场的占有率始终保持在70％以上，成品花优质率达80％以上，在同类花卉产品生产中处于领先地位。
满天星的新品种培育主要依赖于传统育种手段，但由于满天星花朵瓣化程度高，存在花粉不育、败育等现象，这严重阻碍了满天星的遗传育种。随着生物技术的不断进步，转基因和基因编辑技术也逐渐应用于花卉育种中。因此，亟待构建满天星的分子设计育种体系，实现满天星花型和花色的新品种培育，其中满天星高效遗传转化方法是该体系构建的核心。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种满天星的遗传转化体系的构建方法。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种满天星的遗传转化体系的构建方法，以满天星茎尖为外植体，经预培养后，用活化的农杆菌对其进行侵染，之后依次进行共培养、第一轮筛选培养、第二轮筛选培养、恢复培养、扩繁培养和生根培养；其中，取满天星幼苗茎尖，去除所有的叶子，抹掉顶端分生组织部分，将茎尖切成2-3片3-5mm的组织，即为所述外植体。
进一步地，所述预培养的培养基的各成分以及各成分的浓度为：MS培养基、2.5±0.1mg/L TDZ、0.1±0.01mg/L NAA、30±5g/L蔗糖、8±2g/L琼脂，pH＝5.2-6.0。
进一步地，所述预培养的条件为：黑暗培养1±0.1d，温度23±2℃。
进一步地，所述活化的方法为：将含有pCAMBIA1301-220.6-PgF3′5′H载体的EHA105农杆菌200μl置于含有50±5mg/L Rif和50±5mg/L Kana的YEB 30±2ml中，28±1℃，150-250rpm培养24±2h，菌液OD值为0.6±0.1。
进一步地，所述侵染的条件为：28±1℃，150-250rpm培养10±1min；
进一步地，所述共培养的培养基的各成分以及各成分的浓度为：MS培养基、2.5±0.1mg/L TDZ、0.1±0.01mg/L NAA、30±1mg/L AS、30±5g/L蔗糖，pH＝5.2-6.0。
进一步地，所述共培养的条件为：黑暗培养5±0.5天，温度23±2℃。
进一步地，所述第一轮筛选培养的培养基的各成分以及各成分的浓度为：MS培养基、2.5±0.1mg/L TDZ、0.1±0.01mg/L NAA、200±10mg/L Cef、10±1mg/L Hyg、30±5g/L蔗糖，pH＝5.2-6.0。
进一步地，所述第一轮筛选培养的条件为：光照强度1200-1800lx，光照培养14±1天，温度23±2℃。
进一步地，所述第二轮筛选培养的培养基的各成分以及各成分的浓度为：MS培养基、1.0±0.01mg/L 6-BA、0.1±0.01mg/L NAA、200±10mg/L Cef、10±1mg/L Hyg、30±5g/L蔗糖，pH＝5.2-6.0。
进一步地，所述第二轮筛选培养的条件为：光照强度1200-1800lx，光照培养14±1天，温度23±2℃。
进一步地，所述恢复培养的培养基的各成分以及各成分的浓度为：MS培养基、1.0±0.1mg/L 6-BA、0.1±0.1mg/L NAA、200±10mg/L Cef、30±5g/L蔗糖，pH＝5.2-6.0。
进一步地，所述恢复培养的条件为：光照强度1200-1800lx，16小时光照/8小时黑暗培养60±5天，温度23±2℃。
进一步地，所述扩繁培养的培养基的各成分以及各成分的浓度为：MS培养基、1.0±0.1mg/L 6-BA、0.1±0.01mg/L NAA、30±5g/L蔗糖、8±2g/L琼脂，pH＝5.2-6.0。
进一步地，所述扩繁培养的条件为：光照强度1200-1800lx，16小时光照/8小时黑暗培养30±2天，温度23±2℃。
进一步地，所述生根培养的培养基的各成分以及各成分的浓度为：MS培养基、0.2±0.01mg/L IAA、0.3±0.01mg/L NAA、30g/L±5蔗糖，pH＝5.2-6.0。
进一步地，所述恢复培养的条件为：光照强度1200-1800lx，16小时光照/8小时黑暗培养14±2天，温度23±2℃。
进一步地，所述满天星品种为满天星‘云星’系列。
本发明实施例具有如下优点：
本发明提供一种利用茎尖为受体建立满天星遗传转化体系的方法，该方法遗传转化效率显著提升，且转化周期短，为满天星规模化快繁及遗传育种奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为潮霉素对植株再生的影响，A.潮霉素浓度为0；B.潮霉素浓度为5mg/L；C.潮霉素浓度为10mg/L；D.潮霉素浓度为15mg/L；E.潮霉素浓度为20mg/L。
图2为满天星遗传转化过程，A：外植体示意图；B：刚接种于培养基上的外植体；C：共培养5天后的外植体；D：一轮筛选获得的再生芽；E：二轮筛选存活的外植体；F：生根苗；G：开花后的转基因植株；H：PCR鉴定代表胶图(P：质粒阳性对照；N：非转基因植株阴性对照；W：水；M：电泳分子量标记；1-12：抗潮霉素再生苗)。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
满天星再生体系建立
1、植物材料与培养条件
实验采用的植物材料为满天星商业品种‘云星4号’，由玉溪云星生物科技有限公司提供。无菌幼苗用繁殖培养基M1(MS+1.0mg/L 6-BA(6-Benzylaminopurine)+0.1mg/LNAA(Naphthalene acetic acid)+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.95)，在23℃±2℃，1500lx光照强度下(16小时光照/8小时黑暗)培养。
2、本研究采用1个月左右的健壮幼苗为材料。取满天星幼苗茎尖，去除所有的叶子，然后抹掉顶端分生组织部分，将茎尖切成2-3片3-5mm的外植体(见图2A)。将外植体接种在以MS为基础的，添加不同浓度的细胞分裂素(6-BA或thidiazuron，TDZ)与0.1mg/L NAA的不定芽诱导培养基上。不同培养基激素浓度组合见表1。以不添加细胞分裂素，仅含0.1mg/L的NAA的MS1培养基被作为对照。所有的培养基都含有30g/L的蔗糖和8g/L的琼脂，并被调整到pH＝5.95。每个处理中包括30个外植体，重复三次。外植体在生长室中按照上述条件进行培养，一个月后收集相关数据。不同激素浓度组合对‘云星4号’不定芽诱导的影响见表2。
表1不同培养基激素浓度组合
表2不同激素浓度组合对‘云星4号’不定芽诱导的影响
结果显示，在‘云星4号’的再生过程中，上述13种不同的植物激素组合的培养基都显示出100％的诱导能力，而不定芽的诱导率和诱导效率则有所不同。在上述试验中，以茎尖作为外植体，不定芽的诱导率高达90％。补充TDZ可以显著增加诱导的不定芽的数量，而6-BA对诱导不定芽的作用不大。进一步观察到，较高浓度(2.5mg/L)的TDZ减少了形成不定芽的外植体的数量，但诱导系数增加到4.14±0.22(表2)。因此，本发明选用MS+2.5mg/LTDZ+0.01mg/L NAA作为进一步研究的优化再生培养基。
实施例2
满天星遗传转化体系建立
1、筛选抗性压试验
将满天星的茎尖接种到含有不同浓度潮霉素(Hyg)的培养基(MS+2.5mg/L TDZ+0.01mg/L NAA)中，潮霉素浓度分别为：0、5、10、15和20mg/L。每种浓度各接种20个茎尖。先置于黑暗培养5天，然后在光照下培养。1个月后统计外植体的成活率和不定芽诱导率，并分析茎尖对抗生素的敏感性，确定最适宜浓度的潮霉素筛选压力培养基。
不定芽存活率＝不定芽存活的数量/外植体产生愈伤的数量
不同浓度潮霉素对满天星生长的影响结果见表3。
表3不同浓度潮霉素对满天星生长的影响
结果显示，随着Hyg浓度的增加，再生芽的存活率下降。当补充10mg/L潮霉素时，存活率下降到25％，当浓度为20mg/L时，没有芽存活。
根据图1，当向培养基中加入10mg/L潮霉素时，再生芽的生长点被漂白，尽管叶片仍然是绿色的，这表明芽的死亡。因此，本发明选择10mg/L作为‘云星4号’遗传转化筛选压。
2、侵染条件对芽再生的影响
本试验选择影响农杆菌介导满天星外植体转化效率的4个转化因子(预培养时间、侵染时间、共培养时间和乙酰丁香酮(AS)浓度)进行研究，采用L9(34)正交试验表进行试验设计。转化因子的水平如表4所示。外植体分化率的结果见表5。
分化率＝外植体分化的个数/外植体数
表4不同因子对农杆菌介导的满天星外植体转化效率的正交设计因素和水平
表5正交试验各组的外植体分化率
注：K1、K2和K3分别代表同一因素不同水平下外植体分化个数的和；k1、k2和k3分别代表同一因素不同水平下外植体分化个数总数的平均值；R代表极差值。
如表5所示，在9组不同遗传转化因子组合中，每组外植体均分化出不定芽。在遗传转化过程中，4个影响因素的最优组合为A1B3C1D3，即预培养1d、共培养5d、农杆菌侵染时间为10min和AS浓度为30mg/L时，诱导不定芽的效果最佳。根据各个因素的极差大小，4个因素对满天星诱导不定芽的影响主次关系为侵染时间＞共培养时间＞外植体预培养时间＞AS浓度，即侵染时间的多少对满天星诱导分化的影响最大，而AS浓度在遗传转化过程中影响最小。
实施例3
农杆菌介导的满天星遗传转化体系构建
在建立离体再生体系和优化了农杆菌转化因子试验的基础上，进行农杆菌转化实验。遗传转化过程总共分为6个阶段，分别为预培养、共培养、第一轮筛选培养、第二轮筛选培养、恢复培养和生根培养阶段。表6是农杆菌遗传转化进程中各阶段所用到的培养基(所有培养基均还包含30g/L蔗糖，pH＝5.5)。
表6遗传转化各阶段的培养基
具体地，本实施例提供的农杆菌介导的满天星遗传转化体系构建方法包括如下步骤：
(1)在超净工作台上用解剖刀将满天星组培苗剥去叶片，抹掉顶端的生长点后切下顶端茎尖作为外植体，切分成2～3个3mm左右的薄层，接种于配制好的预培养基M2上(MS+2.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA)。黑暗培养1天。
(2)取200μl含有pCAMBIA1301-220.6-PgF3′5′H载体的EHA105农杆菌，加入到添加有30ml YEB(含有50mg/L Rif和50mg/L Kana)的锥形瓶中，放在28℃摇床上200rpm培养两天，菌液OD值为0.6。
(3)将黑暗培养1天的外植体放入已活化的菌液中，在摇床上28℃，200rpm培养10min。
(4)倒掉菌液，外植体表面多余的菌液用用滤纸吸干。
(5)接种于共培养基M3(MS+2.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+30mg/L AS)中，黑暗培养5天。
(6)转入第一轮筛选培养基M4(MS+2.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+200mg/L Cef+10mg/L Hyg)中，光照培养2周。
(7)转入第二轮筛选培养基M5(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+200mg/L Cef+10mg/L Hyg)中，光照培养2周。
(8)转入恢复培养基M6(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+200mg/L Cef)中，培养2个月。
(9)转入满天星扩繁培养基M1中，培养1个月。
(10)转入生根培养基M7(MS+0.2mg/L IAA+0.3mg/L NAA)中培养2周。
(11)长出根原基后将底部浸入生根液(1：500)中10秒左右，移入珍珠岩中进行生根培养，期间保持湿润。1个月后再移栽至装有泥炭和珍珠岩基质的穴盘中。
(12)待苗长得比较健壮以后移栽至温室大棚继续培养。
用刚切下的外植体直接进行农杆菌侵染，容易使其死亡，无法进行下一阶段的培养。因此在菌液侵染前需要对外植体进行预培养，新切的外植体需要在黑暗中用预培养基培养1d(图2B)，然后用活化的农杆菌对其进行侵染，侵染时间为10min。侵染完成后放入共培养基中与农杆菌共同黑暗培养5d，然后转入第一轮筛选培养基在光照下培养2周，在此过程中有部分外植体死亡，同时也会有外植体分化出不定芽图(2D)。14d后转入第二轮筛选培养基中培养2周，在此期间不抗潮霉素的非阳性芽死亡，抗性芽可以在筛选培养基中存活(图2E)。二轮筛选存活的抗性苗将生根然后移至温室培养(图2F-G)。
实施例4
转基因植株的鉴定
用CTAB法提取抗潮霉素‘云星4号’再生芽DNA，以未侵染‘云星4号’植株为阴性对照，载体质粒为阳性对照，进行PCR鉴定。PCR扩增所用试剂为全式金的2×PCRSuperMix(+dye)。用两对引物检测满天星幼苗是否为阳性。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。引物为：Hyg-F：GTTTCCACTATCGGCGAGTA；Hyg-R：GAGCCTGACCTATTGCATCTC；PCR产物条带大小：736bp。
PCR反应条件：
为了确定抗性苗的阳性率，取其叶片提取DNA，并进行PCR鉴定。结果表明，281株再生苗中，有38株可以鉴定到目的基因。使用这个遗传转化体系的遗传转化效率为13.5％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (8)
1. 一种满天星的遗传转化体系的构建方法，其特征在于，外植体经预培养后，用活化的农杆菌对其进行侵染，之后依次进行共培养、第一轮筛选培养、第二轮筛选培养、恢复培养、扩繁培养和生根培养；其中，取满天星幼苗茎尖，去除所有的叶子，抹掉顶端分生组织部分，将茎尖切成2-3片3-5 mm的组织，即为所述外植体；
所述预培养的培养基组成成分为：MS + 2.5 mg/L TDZ + 0.1 mg/L NAA，黑暗培养1天；
所述共培养的培养基组成成分为：MS + 2.5 mg/L TDZ + 0.1 mg/L NAA + 30 mg/LAS，黑暗培养5天；
所述第一轮筛选的培养基组成成分为：MS + 2.5 mg/L TDZ + 0.1 mg/L NAA + 200mg/L Cef + 10mg/L Hyg；
所述第二轮筛选的培养基组成成分为：MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA + 200mg/L Cef + 10 mg/L Hyg；
所述恢复培养基的培养基组成成分为：MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA + 200mg/L Cef；
所述扩繁培养的培养基组成成分为：MS+1.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA + 8g/L琼脂；
所述生根培养的培养基组成成分：MS + 0.2 mg/L IAA + 0.3 mg/L NAA；
以上各培养基均还包含30 g/L蔗糖；
所述侵染的时间为10 min；
所述满天星品种为满天星‘云星’系列。
2.根据权利要求1所述的满天星的遗传转化体系的构建方法，其特征在于，所述预培养的条件为：温度23±2℃。
3. 根据权利要求1所述的满天星的遗传转化体系的构建方法，其特征在于，所述活化的方法为：将含有pCAMBIA1301-220.6-PgF3′5′H载体的EHA105农杆菌200 µl置于含有50±5 mg/L Rif和50±5 mg/L Kana的YEB 30±2 ml中，28±1℃，150-250 rpm培养24±2 h，菌液OD值为0.6±0.1；
和/或，所述侵染的条件为：28±1℃，150-250 rpm。
4.根据权利要求1所述的满天星的遗传转化体系的构建方法，其特征在于，所述共培养的条件为：温度23±2℃。
5. 根据权利要求1所述的满天星的遗传转化体系的构建方法，其特征在于，所述第一轮筛选培养的条件为：光照强度1200-1800 lx，光照培养14±1天，温度23±2℃。
6. 根据权利要求1所述的满天星的遗传转化体系的构建方法，其特征在于，所述第二轮筛选培养的条件为：光照强度1200-1800 lx，光照培养14±1天，温度23±2℃。
7. 根据权利要求1所述的满天星的遗传转化体系的构建方法，其特征在于，所述恢复培养的条件为：光照强度1200-1800 lx，16小时光照/8小时黑暗培养60±5天，温度23±2℃。
8. 根据权利要求1所述的满天星的遗传转化体系的构建方法，其特征在于，所述扩繁培养的条件为：光照强度1200-1800 lx，16小时光照/8小时黑暗培养30±2天，温度23±2℃。
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