KR100533448B1

KR100533448B1 - 민들레의 아그로박테리움-매개 형질전환 방법

Info

Publication number: KR100533448B1
Application number: KR10-2003-0055920A
Authority: KR
Inventors: 류병태; 이효연
Original assignee: 금호석유화학 주식회사
Priority date: 2003-08-13
Filing date: 2003-08-13
Publication date: 2005-12-05
Also published as: KR20030071702A

Abstract

민들레 식물의 아그로박테리움-매개 형질전환 및 재생 방법이 개시된다. 본 발명은 재생된, 가임 민들레 식물, 그로부터 생성된 형질전환 종자 및 하위 세대를 포함한다.

Description

민들레의 아그로박테리움-매개 형질전환 방법{Methods for Agrobacterium-mediated transformation of dandelion}

본 발명은 식물을 유전적으로 형질전환하는 방법, 더욱 특별하게는 민들레의 아그로박테리움-매개 형질전환 방법에 관한 것이다.

타락사컴속(Taraxacum) 식물은 그들의 담즙분비촉진성(choleretic), 이뇨촉진성 및 항암 작용으로 인해 약초로 사용되어 왔다(Ho et al. (1998) "Desacetylmatricarin, an anti-allergic component from Taraxacum platycarpum" Planta Medica, 64:577-578; Yun et al. (2002) "Anticoagulant from Taraxacum platycarpum" Biosci. Biotechnol. Biochem., 66:1859-1864). 식물의 뿌리로부터 구아이아놀리드 데스아세틸마트리카린(guaianolide desacetylmatricarin), 게르마크라놀리드스 타락시닉 애시드 β-글루코피라노실 에스테르(germacranolides taraxinic acid β-glucopyranosyl ester), 손쿠시드(sonchuside) A를 포함한 일부 의약적 화합물이 분리되었다(Ho et al 1998, Zielinska and Kisiel 2000). 최근 2개의 새로운 구아이아놀리드 글루코시드, 데스아세틸마트리카린 8-O-β-글루코피라노시드 및 11β-하이드록시류코딘 11-O-β-글루코피라노시드도 분리되었다(Michalska and Kisiel 2003). 민들리 뿌리로부터 분리된 트리테르페노이즈 타락사스테롤(triterpenoids taraxasterol) 및 타락세롤(taraxerol)은 효과적인 항-종양-증진 활성을 나타내었다.

또한 민들레는 라텍스(latex) 내의 천연 고무와 같은 유용한 2차 대사산물을 생성한다. 2차 대사산물 생합성 경로의 대사 공학은 최근 10년간 많은 생물공학적 관심 대상이 되었다. 식물 내로의 외부 유전자의 도입 방법의 발달은 식물 2차 화합물의 대사 공학 분야에 유의적인 진보를 이끌었고 의약 및 농업 분야에 깊은 충격을 주었다.

Both et al.(1974, New Phytol. 73:453-460)은 타락사컴 오피시날레(Taraxacum officinale)의 뿌리 분절(segment)로부터 새로은 슈트(shooot)를 재생하였다.

Bowes et al.(1970, Protoplasma 71:197-202)은 타락사컴 오피시날레 조직 배양 내에서의 기관형성(organogenesis)을 관찰하였다.

Yeo et al.(2001, Korean J. Plant Biotechology 16:480-485)은 형질전환 효율성이 2∼3%인 이원(binary) 벡터 pBI121을 잠복시킨 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 LBA4404를 이용한 민들레(타락사컴 몬골리컴(Taraxacum mogloicum))의 형질전환을 기술하였다.

Lee et al.(2002, Korean J. Plant Biotechology 29:111-115)은 타락사컴 플라티카르펌(Taraxacum platycarpum)의 시들링(seedling) 외식편으로부터의 우생적 슈트 형성시 옥신 및 시토키닌의 효과를 조사하였다.

원하는 특징을 식물 내로 조작하는 것을 증진시키기 위해 효과적인 민들레 형질전환 및 재생 방법의 필요성이 존재한다.

본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 형질전환 민들레 식물 제조방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 아세토시린곤, 글루코스 및 베타인을 함유한 동시-배양 배지 내에서 아그로박테리움 튜메파시엔스와 민들레 외식편을 접촉시키는 것으로 구성된 형질전환 민들레 외식편 제조방법을 제공한다.

본 발명은 형질전환 민들레 식물 제조방법에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서 본 발명은 아세토시린곤, 글루코스 및 베타인을 함유한 동시-배양 배지 내에서 아그로박테리움 튜메파시엔스와 민들레 외식편을 접촉시키는 것으로 구성된 형질전환 민들레 외식편 제조방법을 기술한다.

아그로박테리움 튜메파시엔스는 일반적으로 아그로박테리움 튜메파시엔스에 내생적인 핵산 서열, 민들레에 내생적인 핵산 서열 또는 다른 생물체로부터의 핵산 서열을 포함한다. 대안적으로 아그로박테리움 튜메파시엔스는 민들레에 외생적인, 아그로박테리움 튜메파시엔스에 외생적인 또는 민들레와 아그로박테리움 튜메파시엔스에 모두 외생적인 핵산 서열을 포함한다. 핵산 서열은 선택가능한 마커로 구성된다. 선택가능한 마커는 일반적으로 아그로박테리움 튜메파시엔스 또는 민들레에 사용하기 적당한 어떠한 선택가능한 마커도 가능하고 바람직하게는 NPTⅡ, HPT 또는 EPSPS이다.

바람직하게는 동시-배양 배지는 아세토시린곤을 포함한다. 아세토시린곤 농도는 일반적으로 약 0.01∼1.0 mM, 바람직하게는 약 0.05∼0.5 mM, 더욱 바람직하게는 약 0.1∼0.2 mM이다. 동시-배양 배지는 바람직하게는 글루코스 및 베타인을 포함한다. 글루코스의 농도는 일반적으로 약 1∼3% (w/v)이다. 베타인의 농도는 일반적으로 약 50∼100 mg/l이다.

상기 방법은 하이그로마이신 선택 전에 슈트 유도시 형질전환된 민들레 외식편을 인큐베이트하기 위한 인큐베이션 단계로 더욱 구성된다. 인큐베이션 기간은 약 2∼12일, 바람직하게는 약 5∼9일, 더욱 바람직하게는 약 7일이다.

슈트 유도 배지는 바람직하게는 말토스를 포함한다. 말토스 농도는 일반적으로 약 0.1∼0.5% (w/v), 바람직하게는 약 0.5∼0.3% (w/v)이다. 외식편은 일반적으로 민들레 조직으로부터 준비되고 바람직하게는 미세번식(micropropagate)된 민들레 배양 또는 화분-생장된 민들레 잎으로부터 준비된다.

대안적인 실시태양에서 본 발명은 선택 배지 내에서 형질전환된 민들레 외식편을 배양하는 것으로 구성된 형질전환 민들레 슈트 제조방법을 기술한다. 선택 배지는 옥신, 시토키닌, 항생제 또는 식물 선택제를 포함한다.

선택 배지는 바람직하게는 말토스를 포함한다. 말토스 농도는 일반적으로 약 0.1∼5% (w/v)이고, 바람직하게는 약 1∼3% (w/v)이다.

본 발명은 루팅(rooting) 배지 내에서 형질전환된 민들레 슈트를 배양하는 것으로 구성된 형질전환 민들레 식물의 제조방법을 더욱 포함한다.

본 발명은 상기 기술된 방법에 의해 생성된 민들레 식물을 더욱 포함한다.

본 발명 특징 및 세목은 하기의 발명의 상세한 설명에 의해 더욱 충분히 인식될 것이다.

정의

하기 정의는 본 발명의 상세한 설명의 이해를 돕기 위해 제공된다.

"향축의"는 확장된 잎 또는 꽃잎의 상부 표면을 나타낸다.

"옥신"은 세포의 증식보다는 신장에 의해 식물 세포 및 조직 내의 생장을 증진시키는 식물 호르몬류를 나타낸다.

"캘러스"는 시험관 내에서의 식물 세포 또는 조직의 증식 덩어리를 나타낸다.

"시토키닌"은 주요 기능이 세포 분열(시토키네시스(cytokinesis)) 및 조직 분화의 조절인 식물 호르몬류를 나타낸다.

"외식편"은 식물 세포 배양을 시작하기 위해 식물로부터 제거된 조직 조각 또는 기관을 나타낸다.

"낮은 광 조건"은 0 .mu.Einsteins/m²/sec 내지 약 40 .mu.Einsteins/m²/sec의 광 강도를 나타낸다.

"핵산"은 디옥시뉴클레익 애시드(DNA) 및 리보뉴클레익 애시드(RNA)를 나타낸다.

"형질전환"은 수령 숙주 또는 숙주들 내로의 핵산의 도입을 나타낸다.

"숙주" 또는 "숙주들"은 전체 식물, 묘목 또는 식물 세포, 원형질체, 캘러스, 뿌리, 괴경, 프로파글(propagule), 종자, 시들링(seedling), 화분 및 식물 조직과 같은 식물 부분을 나타낸다.

"형질전환"은 새로운 핵산 서열이 첨가된 생물체를 나타낸다.

본 발명은 형질전환 민들레 식물의 형질전환 및 제조 방법을 포함한다.

적당한 DNA 서열은 민들레 식물 세포 내로의 도입을 위해 선택된다. 민들레 식물 세포 내로의 도입에 유용한 유전자로서 유전자의 종류가 제한적일 필요는 없다. 그러나 바람직한 예로서 고무-생합성 관련 유전자(고무 중합효소, 시스-프레닐트랜스퍼라제(cis-prenyltransferase), 이소펜테닐 피로포스페이트 신타제(isopentenyl pyrophosphate synthase)); 의약 단백질(알부민)이 예시될 수 있다.

일반적으로 서열은 목적 유전자, 유전자의 전사를 지시하는 기능의 프로모터 및 형질전환된 식물 세포의 확인을 촉진시키는 선택가능한 마커를 포함한다. 선택가능한 마커의 예는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 및 EPSPS 유전자를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

선택가능한 마커의 발현은 선택적인 약제에 대한 저항성을 부여한다. 선택적인 약제를 포함한 배지 상에서의 식물 세포의 생장은 형질전환 및 비-형질전환 식물 세포의 표현형적 분화를 가능하게 한다. 선택가능한 마커가 없는 세포는 선택적인 약제의 존재시 생장할 수 없다.

외식편은 미세번식 배지 내에서 생장된 민들레 배양 또는 화분-생장된 민들레 잎으로부터 수득된다. 외식편은 예비배양 플레이트 상에 놓이고 형질전환에 앞서 혼합된 백색광과 적색광(1 : 1) 하에 놓인다.

잎 외식편과 DNA 플라스미드를 잠복시킨 아그로박테리움 튜메파시엔스 박테리아의 액체 배양의 동시-배양이 약 15∼30분간 수행된다. 박테리아 배양은 제거되고, 외식편은 간단히 건조되고 암조건에서 저장되거나 아그로박테리움 튜메파시엔스와의 동시-배양을 지속시키기 위해 약 2일간 약 22℃에서 낮은 광조건에 놓인다.

외식편은 약 7일간 약 22℃에서 슈트 유도 배지로 이동된다. 표본은 슈트 유도 배지 내에서 인큐베이션 동안 혼합된 백색광과 적색광(1 : 1) 하에 놓인다.

표본은 약 1%의 말토스 및 적당한 선택적인 약제를 함유한 선택 배지 상으로 옮겨지고 약 3주간 배양된다. 2차 배양은 약 3주마다 수행되었다. 형질전환된 외식편은 녹색 슈트 및 녹색 캘러스를 생성하였다. 녹색 슈트 및 캘러스를 포함한 외식편은 더한 처리를 위해 선택된다.

슈트는 약 3∼4주간 루팅 배지 상에서 루트(root)되었다. 슈트는 민들레 식물로 생장하기 위해 토양으로 화분에 심어졌다.

(실시예)

실험 프로토콜

하기 프로토콜은 형질전환 민들레 식물의 제조에 관련된 조건, 성분 및 방법을 명기하기 위해 포함되었다. 당업자는 조성물, 농도, 시간 및 단계의 변화가 본 발명의 범위와 정신에서 벗어남이 없이 이루어짐을 인식할 수 있다. 대안적인 조성물 또는 방법이 유용할 때 이들은 다른 문자 즉, 배지 A, 배지 B, 방법 A, 방법 B에 의해 표시된다.

민들레 형질전환 프로토콜

모주(stock plant) 제조 A

민들레 종자는 병 안의 약 70% (부피/부피, v/v)의 에탄올 내에서 30초 동안 표면-멸균되었다. 에탄올이 제거되고 종자는 약 15분간 느린 교반으로 약 1% (v/v)의 표백제 내에 적셔졌다. 표백제를 따라 내고 잎은 증류수로 3∼4회 완전히 세척되었다. 종자는 발아되었고 시들링 배지를 포함한 멸균 병 내에서 시험관 내 배양되었다(표 1). 1개월-령 이상의 시들링이 잎 및 뿌리 외식편을 위한 모주로서 사용된다.

시들링 배지

구성성분	농도
MS 염/비타민(DUCHEFA M 0222)	4.4 g/L
슈크로스	30 g/L
피타겔(Phytagel)	0.2% (w/v)

모주 제조 B

또한 모주는 비닐하우스 내에서 토양 혼합물(토탄 : 질석 : 퍼라이트(perite) = 1 : 1 : 1)을 포함한 화분에서 생장되었다. 잎 또는 뿌리는 멸균 병 내에서 물로 세척함으로서 표면 세척되었다. 이후 잎 또는 뿌리는 병 안에서 약 70% (v/v)의 에탄올로 30초 동안 잠시 적셔진다. 에탄올이 제거되고 종자는 약 15분간 느린 교반으로 약 1% (v/v)의 표백제 내에 적셔졌다. 표백제를 따라 내고 잎은 증류수로 3∼4회 완전히 세척되었다.

외식편 제조/예비-인큐베이션

모주의 잎과 뿌리는 멸균수의 작은 물방울이 있는 페트리 플레이트 내에 놓인다. 잎의 외식편(ca. 지름 0.5 cm) 및 뿌리의 외식편(ca. 지름 0.5 cm)이 민들레 식물로부터 절제되었다. 플레이트 당 약 15∼20개 외식편이 예비-인큐베이션 배지 상에 향축의 표면이 아래로 위치된다(표 2). 플레이트는 약 22℃에서 6일간 혼합된 백색광과 적색광 하에서 인큐베이트된다.

예비-인큐베이션 배지

구성성분	농도
MS 염/비타민(DUCHEFA M 0222)	4.4 g/L
α-나프탈렌 아세트산	0.1 mg/L
6-벤질아데닌	2.0 mg/L
아세토시린곤	0.1 mM
베타인	50 mg/L
글루코스	20 g/L
슈크로스	30 g/L
피타겔	0.2% (w/v)
pH 5.2로 적정됨

아그로박테리움 제조

아그로박테리움은 660 나노미터에서의 광학밀도(optical density)가 약 0.8에 도달할 때까지 리팜피신(rifampicin) 및 카나마이신(LB-KR로 표시, 표 3)을 함유한 50 ml의 배지의 동결된 스탁(stock)으로부터 오버나이트로 배양된다. 오버나이트 배양은 원심분리되고 펠렛은 50 ml의 유도 용액 내에서 현탁된다(표 4). 현탁된 배양액은 28℃에서 1시간 동안 인큐베이트된다. 이러한 아그로박테리움 배양액이 접종물로서 사용된다.

LB-KR 배지

구성성분	농도
염화나트륨	10 g/L
트립톤	10 g/L
효모 추출물	5 g/L
디프코 박토(Difco bacto) 한천	15 g/L

유도 용액

구성성분	농도
MS 염/비타민(DUCHEFA M 0222)	2.2 g/L
MES	0.5 mg/L
아세토시린곤	0.1 mM
베타인	50 mg/L
글루코스	20 g/L
슈크로스	30 g/L
pH 5.2로 적정됨

접종/동시-배양

6일간의 예비-배양 기간 후 잎 또는 뿌리 외식편이 약 15∼30분간 아그로박테리움 현탁액으로 튜브 내에서 인큐베이트된다. 충분한 아그로박테리움 현탁액이 외식편을 감싸기 위해 첨가된다. 조직은 멸균 와트만 여과지(와트만은 Whatman International, Ltd., Hillsboro, Oreg.의 상표임) 상에 블럿(blot)되고 예비-배양 배지를 함유한 동시-배양 플레이트 상에 놓인다(표 2). 이후 플레이트는 약 22℃에서 약 2일간 암조건에서 인큐베이트된다.

하이그로마이신 선택 전 슈트 유도

약 2일간의 동시-배양 기간 후 외식편은 세척 용액(표 5)으로 세척되고, 간단히 건조되고, 슈트 유도 배지(표 6)로 이동된다. 외식편은 약 22∼25℃에서 약 7일간 이들 플레이트 상에서 인큐베이트된다.

세척 용액

구성성분	농도
MS 염/비타민(DUCHEFA M 0222)	2.2 g/L
아스코르브산	0.25 g/L
슈크로스	15 g/L
세포탁심(cefotaxim)	250 mg/L
pH 5.8로 적정됨

슈트 유도 배지

구성성분	농도
MS 염/비타민(DUCHEFA M 0222)	4.4 g/L
α-나프탈렌 아세트산	0.1 mg/L
6-벤질아데닌	2.0 mg/L
말토스	10 g/L
슈크로스	30 g/L
세포탁심	250 mg/L
피타겔	0.2% (w/v)
pH 5.8로 적정됨

선택 방법

7일후 잎은 선택 배지(표 7)로 이동된다. 외식편은 약 22℃, 혼합된 백색광 및 적색광(1 : 1) 내에서 배양된다. 외식편은 2주마다 신선한 배지로 2차배양된다. 슈트는 뿌리 유도 배지(표 8) 상에서 루트된다. 루팅 단계는 4∼5주가 걸린다. 재생된 식물은 토탄, 질석 및 퍼라이트(1 : 1 : 1)의 혼합물을 포함한 3-인치 화분내로 심어진다. 뒤이어 몇 개의 구멍이 3일 동안 공기흐름을 가능하게 하기 위해 플라스틱 덮개 커버 상에 형성되었다. 덮개는 6일 후 부분적으로 개방되고 식물은 추가적인 10∼15일 동안 반-개방된 커버 하에 유지된다. 이후 식물은 토탄, 질석 및 퍼라이트(1 : 1 : 1)의 혼합물을 포함한 6-인치 화분내로 이식된다. 비닐하우스 온도는 약 20∼25℃의 범위이다.

선택 배지

구성성분	농도
MS 염/비타민(DUCHEFA M 0222)	4.4 g/L
α-나프탈렌 아세트산	0.1 mg/L
6-벤질아데닌	2.0 mg/L
말토스	10 g/L
슈크로스	30 g/L
세포탁심	250 mg/L
하이그로마이신	25 mg/L
피타겔	0.2% (w/v)
pH 5.8로 적정됨

뿌리 유도 배지

하기 외식편은 본 발명의 바람직한 실시태양을 증명하는데 관련된다. 뒤따르는 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시시 잘 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내어 실시동안 바람직한 모드를 구성하는 것으로 여겨질 수 있음이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나 본 발명의 개시 관점에서 당업자는 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어남 없이 많은 변화가 특이적인 실시태양에서 이루어질 수 있고, 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인식한다.

(실시예 1) 민들레 재생 상의 식물-호르몬의 효과

표 9는 다른 농도로 α-나프탈렌 아세트산과 조합한 6-벤질아데닌 또는 키네틴을 포함한 시들링 배지(표 1) 상에서 4일 배양 후 우생 슈트 형성을 나타내는 잎 외식편의 백분율을 나타낸다. 괄호는 외식편 당 재생된 슈트의 수를 나타낸다. 1 또는 2 mg/L의 6-벤질아데닌 및 0.1 mg/L의 α-나프탈렌 아세트산의 조합이 슈트 형성을 나타내는 외식편의 백분율, 잎 외식편 당 재생된 슈트 수 및 재생된 잎 형태에 기초하여 민들레의 슈트 재생에 가장 적당하다(표 9). 이에 반해 0.05 mg/L의 α-나프탈렌 아세트산과 1.0 mg/L의 키네틴 또는 0.1 mg/L의 α-나프탈렌 아세트산과 2.0 mg/L의 키네틴의 조합도 민들레 슈트 재생에 적당하였다(표 9).

α-나프탈렌 아세트산 (mg/L)	6-벤질아데닌(mg/L)					키네틴(mg/L)
α-나프탈렌 아세트산 (mg/L)	0	0.25	0.5	1.0	2.0	0	0.25	0.5	1.0	2.0
0	10.0(1.0)	60.0(21.2)	75.0(17.4)	85.0(17.4)	99.9(16.0)	10.0(1.0)	99.9(24.8)	99.9(22.7)	95.0(21.9)	99.9(14.7)
0.1	0.0(0.0)	63.0(16.3)	99.9(23.8)	99.9(25.1)	99.9(17.4)	0.0(0.0)	96.7(19.8)	99.9(23.4)	99.9(23.6)	99.9(19.3)
0.5	20.0(2.0)	78.0(12.0)	99.9(23.7)	99.9(20.4)	99.9(20.7)	0.0(0.0)	99.9(16.9)	99.9(16.8)	99.9(20.3)	99.9(25.5)
1.0	0.0(0.0)	97.0(24.5)	88.0(21.7)	83.0(13.1)	99.9(8.5)	5.0(0.0)	99.9(8.1)	99.9(6.7)	95.5(13.4)	99.9(8.9)
2.0	0.0(0.0)	90.0(3.6)	40.0(3.2)	99.9(5.9)	99.9(5.4)	0.0(0.0)	99.9(5.8)	99.9(9.8)	96.2(7.3)	99.9(8.1)

(실시예 2) 슈트 재생 상의 말토스 효과

민들레 식물로부터 유도된 잎 외식편이 슈트 생성 상의 말토스 효능을 비교하기 위해 말토스(w/v)를 포함하지 않은 것 또는 1%의 말토스(w/v)를 포함한 슈트 유도 배지 내에 배양되었다. 표 10은 말토스 없는 것과 비교시 말토스가 슈트 생성을 증가시킴을 나타낸다.

말토스(%)	외식편 당 슈트의 수
0	16
1	25

(실시예 3) 재생 반응 상의 외식편 형태의 효과

민들레 식물로부터 유도된 잎 또는 뿌리 외식편이 재생 상의 외식편 원료의 효과를 평가하기 위해 슈트 유도 배지에서 배양되었다. 결과는 잎 보다는 뿌리가 더 좋은 외식편의 원료임을 나타낸다(표 11).

외식편 조직 원료

조직 형태	슈팅에 필요한 날
잎	21
뿌리	15

(실시예 4) 형질전환 효율 상의 선택 전 슈트 유도 배지 내 인큐베이션의 효과

민들레 잎 외식편이 이원 벡터, pCAMBIA1301를 지닌 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주 EHA105와 동시-배양되었다. 외식편은 슈트 유도 배지로 이동되었고, 약 7일간 약 22℃에서 혼합된 백색광 및 적색광 하에서 인큐베이트되었다. 이후 외식편은 50 mg/L의 하이그로마이신을 포함한 선택 배지 내에 위치하였고 하이그로마이신 저항성 캘러스에 대해 선택되었다. 표 12는 하이그로마이신 선택 전 슈트 유도 배지 내에서의 7일간의 인큐베이션이 아그로박테리움에 의한 형질전환 효율을 11%까지 증가시킴을 나타낸다.

인큐베이션 일	외식편 수	슈트를 지닌 하이그로마이신 저항성 캘러스 수
0	550	11 (2%)
7	550	61 (11%)

(실시예 5) 민들레 게놈 DNA의 PCR

GUS 유전자가 하이그로마이신-저항성 식물 내의 민들레 게놈 내로 통합되었음을 확인하기 위해 주형으로서 게놈 DNA 및 GUS 유전자와 대조군으로서 18S 리보솜 단백질에 모두에 대해 특이적인 프라이머를 이용한 PCR이 수행되었다. PCR 생성물은 18S 대조군에서 관찰되었으나 야생형 식물의 GUS 프라이머에서는 그렇지 않았다(도 1). GUS와 18S 프라이머 모두의 PCR 생성물이 하이그로마이신-저항성 슈트 내에서 관찰되었고 이는 GUS 유전자가 민들레 게놈 내로 통합되었음을 나타낸다(도 1).

(실시예 6) 민들레 GUS 전사체의 RT-PCR

GUS가 하이그로마이신-저항성 식물 내에서 전사되는지 여부를 더욱 측정하기 위해 유전자에 특이적인 프라이머를 이용한 RT-PCR이 수행되었다. 어떤 PCR 밴드도 야생형 민들레 RNA에서 관찰되지 않았다(도 2A). R₁ 세대-형질전환된 식물로부터 수득된 RNA는 986 bp 밴드를 나타내었으나(도 2A) 형질전환 식물 번호 2는 예외였고 이는 하이그로마이신-저항성 식물간의 의사-양성 형질전환 식물의 존재를 의미한다. 형질전환 식물 번호 3의 GUS 유전자 발현은 다른 형질전환 식물보다 상대적으로 낮았고 이는 불완전한 형질전환 또는 불안정한 발현을 의미한다.

(실시예 7) 자손 데이터

GUS 유전자 발현을 안정화하기 위해 R₁ 식물의 뿌리 조직으로부터 R₂ 세대를 생성하였다. 뿌리는 다른 그룹에 의해 앞서 관찰된 잎 보다 우생 슈트 유도에 더 좋은 원료였다. RT-PCR 분석은 5개의 독립적 R₂ 형질전환 라인 내의 유사한 레벨의 GUS 발현을 나타내었고(도 2B) 이는 안정화된 유전자 발현을 의미하였다. 뿌리는 R₂-형질전환 슈트로부터 유도되었다. 형질전환 식물은 토양 화분 내로 옮겨졌고 비닐하우스에서 생장되었다.

여기 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 발명의 개시의 관점 내에서 과도한 실험없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시태양에 의해 기술되었으나 본 발명의 개념, 정신 및 범위에서 벗어남 없이 여기 기술된 조성물 및 방법 및 상기 방법의 단계 또는 단계 순서에 적용됨이 당업자에게 명백할 것이다. 더욱 특별하게는 화학적으로 또한 생리학적으로 모두 관련된 어떤 약제가 여기 기술된 약제를 대신하더라도 동일하거나 유사한 결과가 달성됨이 명백할 것이다. 이러한 당업자에게 명백한 모든 유사한 치환 및 변형은 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내에 있음으로 간주된다.

본 발명의 효과는 형질전환 민들레 식물 제조방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 아세토시린곤, 글루코스 및 베타인을 함유한 동시-배양 배지 내에서 아그로박테리움 튜메파시엔스와 민들레 외식편을 접촉시키는 것으로 구성된 형질전환 민들레 외식편 제조방법을 제공한다.

도 1은 GUS 유전자 및 대조군으로서 18S에 특이적인 프라이머를 사용한 민들레 게놈 DNA의 PCR 분석을 나타낸 것이다. 각각 야생형 및 하이그로마이신-저항성 민들레의 18S(레인 1) 및 GUS(레인 2) PCR 생성물. PCR 생성물은 18S 대조군에서 관찰되었으나 야생형 식물 내의 GUS 프라이머에서는 관찰되지 않았다. GUS와 18S 프라이머 모두의 PRC 생성물은 하이그로마이신-저항성 슈트에서 관찰되었고 이는 GUS 유전자가 민들레 게놈 내로 통합되었음을 나타내었다.

도 2는 형질전환 R₁ 및 R₂ 민들레 식물의 RT-PCR 분석을 나타낸 것이다. A, 2개의 야생형 식물 및 5개의 독립적 형질전환 R₁ 민들레 식물. R₁세대 형질전환된 식물로부터 수득된 RNA는 986 bp 밴드를 나타내었으나 형질전환 식물 번호 2는 예외였고 이는 하이그로마이신-저항성 식물간에 의사-양성 형질전환 식물의 존재를 의미하였다. B, 2개의 2개의 야생형 식물 및 5개의 독립적 형질전환 R₂ 민들레 식물. 총 RNA가 민들레의 야생형 및 형질전환 식물로부터 분리되었고, 유전자-특이적 프라이머로 역전사되었고, PCR의 주형으로서 사용되어 986 bp GUS cDNA 단편 및 303 bp 18S rRNA 단편의 증폭을 초래하였다. RT-PCR 분석은 5개의 독립적 R₂ 형질전환 라인 내에 유사한 GUS 발현 레벨을 나타내었고 이는 안정화된 유전자 발현을 의미하였다.

Claims

(a) 옥신, 시토키닌, 아세토시린곤, 글루코스, 슈크로스 및 베타인을 포함한 예비-배양 배지 내에 민들레 외식편을 예비-인큐베이트시켜 형질전환된 민들레 외식편을 생성하고 ;

(b) 적어도 하나 이상의 T-DNA 경계에 실시가능하게 연결된 목적 DNA 단편으로 구성된 아그로박테리움 세포를 지닌 민들레 외식편을 예비-인큐베이션 배지를 포함한 플레이트 내에 접촉시키고 동시-배양하여 형질전환된 민들레 외식편을 생성하고 ;

(c) 옥신, 시토키닌, 말토스, 슈크로스 및 항생제를 포함한 선택 배지 내에 형질전환된 민들레 외식편을 배양하여 형질전환된 민들레 슈트를 생성하는 것으로 구성되고 :

상기 예비-인큐베이션 배지 내에 0.05∼0.5 mM의 아세토시린곤이 포함되고, 상기 선택 배지 내에 0.5∼3% (w/v)의 말토스가 포함됨을 특징으로 하는 형질전환 민들레 슈트 제조방법
제 1항에 있어서, 옥신, 시토키닌, 말토스, 슈크로스 및 항생제를 포함한 뿌리 유도 배지 내에서 형질전환된 민들레 슈트를 배양하여 형질전환 민들레 식물을 생성하는 것으로 더욱 구성됨을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 민들레는 타락사컴속(Taraxacum)의 일원임을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 민들레는 타락사컴 플라티카르펌(Taraxacum platycarpum)임을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 목적 DNA 단편은 고무 중합효소, 시스-프레닐트랜스퍼라제, 이소펜테닐 피로포스페이트 신타제 또는 알부민으로부터 선택된 적어도 하나 이상이나 이에 한정적이지 않음을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 민들레 외식편은 시험관 내에서 생장된 시들링으로부터인 것임을 특징으로 하는 방법