KR20070016577A - 목표유전자의 식물세포 내로의 도입을 증가시키는 방법 - Google Patents
목표유전자의 식물세포 내로의 도입을 증가시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유전자를 식물체에 형질전환시키는 방법 및 이를 이용하여 제조된 식물체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아그로박테리움을 식물체별 형질전환이 가능한 목적 조직에 접종한 후 아그로박테리움 내의 재조합 플라스미드에 포함된 목표유전자를 식물세포 내에 도입하는 단계를 포함하는 공동배양 과정에서의 배지조성과 조건 등을 새로이 개량함으로써 형질전환 효율을 높이는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 개량된 형질전환 방법을 이용하여 형질전환이 어려운 벼 유전자형의 품종을 대상으로 형질전환 식물체를 생산할 수 있다.
벼, 아그로박테리움, 공동배양과정, 배지조성 및 조건, 형질전환 식물체
Description
도 1은 식물체의 형질전환 및 그 확인을 위하여 개발한 형질전환용 운반체의 주요부를 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명에 사용된 형질전환용 운반체를 3계 교잡방법으로 아그로박테리움에 형질전환하고 콜로니 PCR을 수행하여 그 결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명에 의한 방법에 따라 아그로박테리움을 벼 캘러스에 접종시키고 공동배양 후의 GUS 유전자의 발현 정도를 종래 방법에 의한 것과 비교하여 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명에 의한 방법과 종래 방법 간의 형질전환 효율의 차이와 본 발명에 의한 방법을 실제 벼 형질전환에 적용하였을 때의 형질전환 효율을 재분화 단계에서 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명과 종래 방법에 의해 유도된 형질전환 벼에서 게놈에 삽입된 GUS 유전자를 핵산증폭반응(PCR)하고 그 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명과 종래 방법에 의해 유도된 형질전환 벼의 잎을 대상으로 GUS 검정하고 그 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 본 발명에 의한 방법으로 생산된 형질전환 일품벼에 0.3%의 바스타를 2회 처리하였을 때 제초제에 대한 저항성을 나타낸 사진이다.
본 발명은 유전자를 식물체에 형질전환시키는 방법 및 이를 이용하여 제조된 식물체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아그로박테리움을 식물체별 형질전환이 가능한 목적 조직에 접종한 후 아그로박테리움 내의 재조합 플라스미드에 포함된 목표유전자를 식물세포 내에 도입하는 단계를 포함하는 공동배양 과정에서의 배지조성과 조건 등을 새로이 개량함으로써 형질전환 효율을 높이는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 개량된 형질전환 방법을 이용하여 형질전환이 어려운 벼 유전자형의 품종을 대상으로 형질전환 식물체를 생산할 수 있다.
벼는 아시아 지역 사람들의 주식으로 이용되는 매우 중요한 농작물로서 유전공학 기술의 발달과 더불어 유전자의 기능 연구나 유전자의 단자엽 식물에서의 작용을 구명하는 모델식물로 이용되는 등 그 중요성이 점차 커지고 있다. 주곡 작물에 있어서 제초제 저항성, 내재해 또는 내병성 등의 기능성이 향상된 품종 등 신품종의 개발은 재배 안정성의 증대 및 고부가가치의 농산물 공급이라는 측면에서 매우 중요하다. 따라서, 최근 유전공학적 분자 육종 방법을 적용하여 새로운 형질을 가지는 신품종을 개발하려는 노력이 활발히 진행되고 있다.
유전공학적 분자 육종 방법은 전통적인 육종 방법인 교배 육종법에 비해 우 수한 품종의 유전형질을 그대로 유지하면서 유용 유전자를 직접 도입 가능하다는 점과 다양한 생물 종으로부터 유용 유전자를 확보하여 식물체에 이식할 수 있다는 장점이 있다. 유전공학적 분자 육종 방법을 성공적으로 식물체에 적용하기 위해서는 3단계의 기반 기술이 요구되는데 형질전환이 가능한 식물 조직을 효과적으로 유기하는 방법; 식물세포 내에 목적 유전자를 성공적으로 형질전환하는 방법; 및 형질 전환된 세포로부터 재분화 식물체를 유도하는 방법이 포함된다.
목적 유전자를 식물세포에 성공적으로 형질전환하는 방법은 지금까지 여러 가지가 보고되었으나(Hansen and Wright, Trends Plant Sci. 4: 226-231, 1999), 최근에는 미세입자(Microparticle) 투사 방법과 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 이용하는 방법 등이 가장 일반적으로 사용되고 있다.
미세입자 투사 방법은 유전자 총을 이용하여 미세입자에 코팅된 DNA를 식물 세포에 직접 전이하는 방법으로 식물 세포에 삽입되는 DNA 복제(copy) 수가 많다는 점, 삽입되는 양상의 복잡성 및 삽입 DNA가 절단된 형태로 전이되는 등의 문제점이 있다(De block M. Euphytica. 71: 1-14, 1993). 이러한 문제점으로 인해 최근에는 효율적인 식물 형질전환방법으로 아그로박테리움을 이용하는 방법이 주로 사용되고 있다.
아그로박테리움을 이용한 형질전환방법은 식물 병원균인 아그로박테리움이 지니고 있는 Ti(tumor- inducing) 플라스미드 또는 Ri(Root-inducing) 플라스미드 상의 T-DNA 영역이 식물 세포에 전이되는 성질을 식물체 형질전환에 이용하는 것으로 그 과정은 크게 4단계에 걸쳐서 이루어진다. 여기에는 목적 유전자를 지닌 재조 합 플라스미드가 포함된 아그로박테리움을 식물 세포에 접촉시키는 접종(Inoculation) 과정, 아그로박테리움과 식물 세포를 수 시간에서 수 일 동안 함께 배양 하여 T-DNA의 전이가 이루어지게 하는 공동배양(Co-culture) 과정, 형질전환된 세포를 선발마커가 포함된 배지에서 선발하고 증식하는 과정 및 마지막으로 선발된 세포로부터 재분화 식물체를 유도하는 과정이 포함된다.
벼 형질전환에서 위에서 언급한 형질전환 4단계 중에서 공동배양 과정을 새로운 방법으로 개량하여 식물 형질전환 효율을 높인 연구로는 아그로박테리움의 성장을 억제하는 방법(국제공개특허 WO 01/09302 A2호)과 공동배양 과정에서 발생하는 식물세포의 산화적 파괴(Oxidative burst)를 최소화하는 방법(Dey et al., Rice Genetics Newsletter 19: 82-84)이 대표적인 예라 할 수 있다. 국제공개특허 WO 01/09302 A2호에는 아그로박테리움의 성장을 억제하는 물질을 접종배지와 공동배양용 배지에 하나 또는 그 이상 첨가하여 아그로박테리움의 성장속도를 억제함으로써 벼, 밀 및 옥수수의 형질전환 효율을 높이고 또한 삽입 유전자의 복제 수도 줄일 수 있다고 기재되어 있다. 그리고 Dey 등은 공동배양 배지에 두 가지 항산화 물질(L-시스테인, 아스코르브산)과 질산은(silver nitrate)을 첨가하였을 때 형질전환 효율이 30-40% 증가되었다고 보고하였다.
이에 본 발명자는 상기 두 방법의 장점을 취하고 개선하는 방법을 연구한 결과, 공동배지에 아그로박테리움 성장 억제물질을 첨가하는 것 외에 변온처리 및 여 과지처리를 병행함으로써 아그로박테리움의 과도한 성장 없이 공동배양 기간을 품종별 조건에 맞게 조절하는 것이 가능하도록 하였고, 또한 항산화 물질 3종을 공동배양 배지에 첨가하여 식물세포의 산화적 파괴(Oxidative burst)를 최소화함으로써 식물 형질전환 효율을 획기적으로 증가시켰으며, 이 방법을 적용하여 형질전환이 어려운 품종을 대상으로도 형질전환 식물체의 개발이 가능함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 아그로박테리움을 이용하여 식물체를 형질전환시키는 효율적인 방법 및 그 방법에 의해 얻어지는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 (A) 외래의 목적유전자 및 선발인자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하고 완성된 재조합 플라스미드를 아그로박테리움에 도입하는 단계; (B) 상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물체의 목적 조직과 공동배양하는 단계; (C) 상기 공동배양한 식물체의 조직을 선발배지에서 선발하고 증식시키는 단계; 및 (D) 상기 선발된 조직을 재분화시키고 생산된 식물체를 순화시키는 단계;를 포함하는 형질전환 식물체의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 상기 식물 형질전환 방법을 이용하여 생산된 형질전환 식물체를 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 식물의 세포 및 조직에 목적유전자를 효과적으로 형질전환하는 방법과 이 방법에 의해서 형질전환된 식물체를 생산하여 제공하는 것으로서, 상기 (A) 단계에서의 외래 목적유전자는 식물, 동물 및 미생물 등 다른 종에서 유래한 유전자와 인공적으로 합성한 유전자 등 모든 유전자가 사용될 수 있다.
상기 목적유전자가 도입된 식물체를 효과적으로 선발하기 위한 선발인자로는 NPTⅡ(neomycin phosphotransferase), HPT(hygromycin phosphotransferase), CAT(chloramphenicol acetyltransferase) 및 젠타마이신(gentamicin) 등의 항생제 내성 유전자; bar 유전자 등의 제초제 저항성 유전자; 및 GUS, GFP(green fluorescent protein) 및 LUX(luciferase) 등의 표지유전자가 사용될 수 있다.
목적 유전자를 식물에서 구현하기 위한 형질전환용 발현벡터는 식물세포에서 목적유전자의 RNA 염기서열을 생산하게 하는 프로모터(promoter), 목적으로 하는 유전자의 정보를 가지고 있는 구조 DNA 염기서열 및 식물세포에서 RNA 염기서열의 3' 말단에 폴리아데닐화된 뉴클레오타이드(polyadenylated nucleotide)를 생산하는 기능을 하는 3' 비전사(non-translated) DNA 염기서열 등으로 이루어진 구조를 적어도 하나 이상 지니고 있다.
본 발명에서 상기 발현에 사용하는 프로모터는 식물세포에서 기능하는 모든 종류의 것이 이용될 수 있으며, 여기에는 목적유전자를 식물생육 기간 중 일정 시기에 발현되도록 하는 프로모터, 식물조직의 특이 부분에만 발현하게 하는 프로모 터 및 목적유전자의 발현을 높이기 위해 '인핸서 서열(enhancer sequences)'이 결합된 하이브리드(hybrid) 프로모터 등이 포함된다.
본 발명에서는 벼에서 분리한 상시발현 OsCc1 프로모터(Jang et al., Plant Physiol. 129: 1473-1481, 2002)와 목적유전자가 종실발육시기에 발현되게 하는 글로불린 프로모터(globulin promoter)를 주로 사용하였다. 본 발명에 사용된 재조합 플라스미드의 종류 및 제작방법은 실시예 1에서 보다 상세히 설명한다.
목적유전자를 식물세포 내에 하나 또는 그 이상 도입하기 위해 사용되는 아그로박테리움은 디스암(disarmed)된 Ti 또는 Ri 플라스미드를 가지고 있는 것으로 옥토핀형(octopine-type) 계통인 LBA4404나 숙신아모핀형(succinamopine-type) 계통인 EHA101 또는 EHA105 등 모든 아그로박테리움 계통이 본 발명에서 사용될 수 있다.
상기 (B) 단계에서의 목적조직은 벼, 옥수수, 밀 및 보리 등의 단자엽식물; 및 콩, 목화, 유채 및 해바라기 등의 쌍자엽식물의 모든 조직을 포함하는 것으로 인위적으로 유도된 분열조직인 캘러스나 미숙배, 배아, 정단 및 자엽마디 등 분열조직 그리고 상배축, 하배축, 자엽, 잎, 뿌리 및 줄기 등이 목적조직으로 이용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 27℃ 암실에서 3-4주간 배양한 종자 유래의 캘러스를 목적조직으로 이용하였다.
본 발명에서 목적조직으로서 사용하는 형질전환용 식물의 보다 구체적인 예로는 벼, 콩, 보리, 옥수수, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수 등의 식량작물; 토마토, 고추, 딸기, 파, 양파, 당근, 배추, 무, 수박, 오이, 양배추 및 호박 등의 채소작 물; 인삼, 참깨, 들깨, 땅콩, 유채, 목화, 사탕수수, 사탕무우 및 담배 등의 특용작물; 사과나무, 배나무, 대추나무, 포도, 감귤, 감, 살구, 바나나, 양다래, 장미, 국화, 백합, 거베라, 카네이션, 프리지아, 글라디올러스 및 튤립 등의 과수 및 화훼식물; 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 레드클러버 및 라이그라스 등의 사료작물; 및 아라비돕시스 등의 기타식물을 들 수 있다.
본 발명에서는 아그로박테리움과 식물 세포를 수 시간에서 수 일 동안 함께 배양하여 T-DNA의 전이가 이루어지게 하는 공동배양(Co-culture) 과정을 새로운 방법으로 개량한 것으로서 여기에는 아그로박테리움 성장, 에틸렌활성 억제방법 및 식물세포의 산화적 파괴 최소화 방법 등 T-DNA의 식물세포 내로의 전이가 안정적으로 이루어지도록 하는 최적화 조건이 포함되었다.
이때 사용되는 배지로는 MS 기본배지 및 N6 기본배지 등의 식물배양용 배지가 모두 사용될 수 있으며, 추가적으로 2,4-D를 포함한 식물성장호르몬, 비타민, 아미노산, 철 및 미량요소 등이 첨가될 수 있다. 또한, 공동배양배지 위에 여과지를 1매 이상 덮는 처리가 포함될 수 있으며 겔형성제(Gelling agent)로는 한천(agar) 또는 젤라이트(gelrite; phytagel) 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 공동배양배지로는 1/2 N6 배지를 사용하였고, 첨가되는 젤라이트(gelrite; Duchefa, cat. no. G1101)의 양은 2.6∼5g/L으로 하였으며, 가장 바람직하게는 3.0g/L로 사용하였고, 완성된 배지 위에 여과지를 덮고 그 위에 아그로박테리움이 접종된 식물의 목적조직을 두었다.
아그로박테리움의 성장 및 에틸렌활성 억제방법으로는 공동배양배지 내에 질 산은(silver nitrate) 등 중금속류를 처리하는 방법이 포함될 수 있으며, 상기 질산은의 첨가량은 배지 조성에 대하여 1∼10mg/L 정도가 바람직하다.
식물세포의 산화적 파괴를 최소화하는 방법으로 공동배지 내에 L-시스테인, 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 및 디티오트레이톨(dithiothreitol) 등 항산화 화합물을 한 종 또는 그 이상 첨가하는 처리하는 과정이 포함될 수 있다. 상기 항산화 화합물의 함량은 배지 조성에 대하여 L-시스테인이 5∼50mg/L, 티오황산나트륨이 0.1∼5mM 및 디티오트레이톨이 0.1∼5mM 정도가 바람직하다.
공동배양 과정에서의 처리 온도는 23∼28℃ 범위에서 3℃ 차이로 변온하였으며, 먼저 26∼28℃ 온도에서 하루를 처리한 후 23∼25℃의 온도로 변경하여 나머지 기간을 처리하였다. 공동배양 기간은 작물별 또는 품종별로 조절하여 처리하는 것이 가능하며, 본 발명의 실시예에서는 26.5℃(1일)→23.5℃(4일-8일) 5일 이상 처리하였다.
상기 재분화 식물체 유도단계 (D)에서 벼 재분화 배지에 NAA(Naphthalene Acetic Acid) 0.1∼5mg/L, 키네틴(Kinetine) 1∼10mg/L, 소르비톨 20∼40g/L 및 말토오스 10∼30g/L 등의 배지 조성을 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예에서는 편의를 위하여 외래 목적 유전자로서 제초제 바스타(Basta) 저항성 bar 유전자를 활용하였으나, 동일한 방법으로 다른 여러 가지 외래 목적 유전자를 적용하는 것이 가능하리라는 것은 당업자에게 자명한 사실일 것이다.
[실시예 1] 형질전환을 위한 운반체의 제작 및 아그로박테리움에의 도입
본 발명에 의한 방법과 종래 방법의 식물체 형질전환효율을 비교하기 위하여 GUS 발현 운반체를 포함 모두 4종의 운반체를 제작하였고, 이를 각각 아그로박테리움에 도입하였다.
인트론이 포함된 GUS 유전자는 pCAMBIA 3301 벡터에서 클로닝하여 사용하였으며, 분리된 유전자는 게이트웨이 시스템(Gateway system; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 pSB11 벡터(Komari et al., Plant J. 10: 165-174, 1996)에 도입하였다. 유전자의 도입이 확인된 형질전환용 운반체는 pMJC-GB-GUS로 명명하였으며 본 발명에 포함된 방법과 종래 방법과의 차이를 식물체 형질전환 단계별로 비교하는데 사용하였다.
주 벡터로는 pSB11 바이너리(binary) 벡터가 이용되었으며 GUS 유전자의 발현을 위해서 벼에서 분리한 상시발현 OsCc1 프로모터(Jang et al., Plant Physiol. 129: 1473-1481, 2002)가 사용되었다. 형질전환된 캘러스 및 식물체의 선발을 위해서는 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되는 Bar(Bialaphos resistance) 유전자를 이용하였으며 양쪽 보더(border) 안쪽으로 MAR(Matrix attachment region)를 추가하여 유전자의 안정적인 발현을 유도하였다. 상기 재조합된 플라스미드 pMJC-GB-GUS 의 주요 유전자 배열은 도 1에 나타내었다. 도 1에서 각 부호의 약어는 다음과 같다: LB(left border), RB(Right border), PCytC(OsCc1 promoter), Intron-GUS(GUS coding region with intron insertion), TPinll(Pin-Ⅱ terminator), P35S(CaMV 35S promoter), TNos(Nos terminator), Bar(bar coding region), MAR(Matrix attachment region).
본 발명에 의한 방법이 실제 벼 형질전환에서도 효율적으로 적용 가능한지를 알아보기 위하여 아이소플라본 생합성 유전자 IFS1(Isoflavone synthase 1), IFS2(Isoflavone synthase 2) 2종과 내병성 관련 유전자 하핀(Harpin)이 재조합된 플라스미드를 제작하였다. 운반체의 제작은 GUS 발현 운반체에서와 동일한 방법으로 하였으며 사용된 프로모터로는 IFS1과 IFS2 운반체는 종자에서 강하게 발현하는 글로불린(globulin) 프로모터를 그리고 하핀 운반체는 GUS 운반체와 동일한 OsCc1 프로모터를 사용하여 유전자가 항상 발현되도록 하였다.
제작된 형질전환용 바이너리 벡터 DNA 즉, pMJC-GB-GUS, pMJC-GGB -IFS1, pMJC-GGB-IFS2 및 pMJC-GB-하핀은 3계 교잡법(triparental mating)에 의해 아그로박테리움 LBA4404 균주에 도입하였으며, 재조합된 플라스미드가 포함된 아그로박테리움의 선발을 위해서 2종의 항생제인 스펙티노마이신(spectinomycin)과 테트라사이클린(tetracycline)을 사용하였다. 아그로박테리움 내로의 형질전환 여부는 콜로니 PCR 방법으로 확인하였다.
PCR 반응은 1X f-Taq 완충액(Solgent, Daejeon, Korea), 각 dNTP 50 μM, 1X 밴드 닥터(Solgent, Daejeon, Korea), f-Taq DNA 폴리머라아제 1.5 유닛(Solgent, Daejeon, Korea) 및 각 프라이머 25 pM를 첨가하고 멸균수로 최종 부피를 25μl로 맞춘 PCR 반응액에 각각의 운반체가 형질전환된 콜로니의 일부를 팁으로 찍어 첨가하였다. PCR 반응은 MJ 리서치(MJ Research)사의 PCT-200 기기로 수행하였으며, 조건으로는 94℃에서 4분간 변성 반응시킨 후 94℃에서 15초간 변성, 55℃에서 30 초간 중합, 72℃에서 60초간 신장 반응을 30회 반복 후 72℃에서 7분간 신장 반응하도록 프로그램하였다. 증폭된 산물은 EtBr이 첨가된 0.8% 한천 겔(agarose gel)에서 분리되고 UV 트랜실루미네이터(UV transilluminator)에서 확인하였다.
도 2는 본 발명에 사용된 형질전환용 운반체 pMJC-GGB-IFS2를 3계 교잡방법으로 아그로박테리움에 형질전환하고 콜로니 PCR을 수행한 결과를 보여주는 사진이다. 선발된 10개의 콜로니는 모두 사용한 프라이머의 기대 크기인 1949bp 위치에서 밴드를 나타내어 IFS2 유전자가 아그로박테리움에 안정적으로 형질전환된 것으로 확인되었다. 도 2에서 1-10은 형질전환된 콜로니를 나타내었다.
위의 방법으로 형질전환이 확인된 아그로박테리움 콜로니는 증식시킨 후 형질전환에 이용하였다.
[실시예 2] 형질전환을 위한 캘러스 유도 및 아그로박테리움 배양
목표 유전자의 식물체로의 도입을 위하여 캘러스를 유도하고 아그로박테리움을 배양하였다.
2-1. 캘러스 유도 및 선발
공시품종으로는 형질전환이 되는 것으로 알려진 흑남벼 및 일미벼 등 2개 품종과 형질전환이 어려운 일품벼를 사용하였다. 먼저, 종자 껍질을 제거한 현미를 70% 에탄올에 5분간 세척한 다음 50% 락스 용액으로 상온에서 15분씩 2회 정도 소독한 후 멸균수로 10회 이상 세척하여 멸균처리하였다. 멸균된 종자는 2,4-D 2mg/L가 포함된 2N6배지(표 1 참조)에 약 15-20개(90×20㎝ petridish)를 배 부분이 위로 향하게 치상한 다음 27℃ 암실에서 3-4주간 배양하여 캘러스를 유도하였다. 유도된 캘러스 중에서 1-2㎜의 일정한 둥근 모양의 갈변화가 안된 양호한 상태의 캘러스를 선발하여 2N6 배지에서 3일간 증식시킨 다음 형질전환에 사용하였다.
2-2. 아그로박테리움의 배양 및 현탁액 준비
초저온냉장고(-70℃)에서 글리세롤 스탁으로 저장되어 있는 4종의 재조합 플라스미드가 형질전환된 아그로박테리움을 꺼내 AB-ST배지(표 1 참조)에 조밀하게 스트리킹하여 28℃ 암조건에서 4-5일간을 배양하였다. 배양이 끝난 아그로박테리움을 페트리 접시(petri dish) 당 15-20㎖ AAM 배지(표 1 참조)를 분주한 후 멸균된 루프를 이용하여 긁어내고 팰콘 튜브(falcon tube)로 옮겨 담았다. 그 다음 아그로박테리움이 잘 현탁될 수 있도록 수초 동안 볼텍싱(vortaxing)하였으며, 최종 접종 농도는 OD650㎚에서 1.5-2.0이 되도록 하였다.
| 형질전환 단계 | 배 지 | 조 성 |
| 캘러스 유도 및 증식 | 2N6 | N6 매크로(macro), 미세 염(micro salt), N6 비타민. 카사미노산(casamino acid) 300mg/L, 프롤린 500mg/L, 수크로오스 30g/L, 글루타민 500mg/L, 젤라이트 2.5g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.8 |
| 아그로박테리움 배양 | AB-ST | AB 완충액, 염, 글루코오스 5g/L, 박토-아가(Bacto-agar) 15g/L, 스펙티노마이신(spectinomycine) 50mg/L, 테트라사이클린(tetracycline) 10mg/L, pH 7.0 |
| 아그로박테리움 현탁 및 접종 | AAM | AA 매크로, 미세 염, 아미노산 스탁(stock), MS 비타민, 철 스탁(stock), 카사미노산 500mg/L, 수크로오스 68.5g/L, 글루코오스 36g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 100uM/L, pH 5.8 |
| 공동배양 | 2N6-AS | 2N6 배지, 아세토시린곤 100uM/L, 글루코오스 10g/L, 젤라이트 2.5g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.2 |
| 1/2-2N6- AS-New | 1/2-2N6 배지, 아세토시린곤 100uM/L, 글루코오스 10g/L, L-시스테인 10.5mg/L, 티오황산나트륨 1mM, 디티오트레이톨 1mM, 질산은 5mg/L, 젤라이트 3.0g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.2 | |
| 형질전환 캘러스 선발 | 2N6-CP | 2N6 배지, 세포탁심(cefotaxime) 250mg/L, L-포스피노트리신(L-phosphinotricine) 6mg/L, 젤라이트 2.5g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.8 |
| 재분화 | MSR-CP | MS 매크로, 미세 염, MS 비타민, 세포탁심 250mg/L, NAA 1mg/L, 키네틴(Kinetine) 5mg/L, 소르비톨 30g/L, 말토오스 20g/L, L-포스피노트리신 3mg/L, 젤라이트 4g/L, pH 5.8 |
| 뿌리 유도 | MS0 | MS 매크로 및 미세 염, MS 비타민, 수크로오스 30g/L, 젤라이트 2.5g/L, pH 5.8 |
| 캘러스 유도 | 재분화 | ||
| N6(Chu) 배지 | 첨가량 | MS 배지 | 첨가량 |
| N6 매크로 염 KNO3 (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4 (또는 MgSO4·7H2O) CaCl2 (또는 CaCl2·2H2O) | 2.83g/l 463mg 400mg 90mg (또는 185mg) 125.33mg (또는 166mg) | 매크로 염 KNO3 NH4NO3 KH2PO4 MgSO4 CaCl2 | 1900 mg 1650 mg 170 mg 180.54 mg 332.02 mg |
| 철 (또는 FeNaEDTA) | 36.70mg | 철 FeNaEDTA | 36.70 mg |
| N6 미세 염 MnSO4·H2O ZnSO4·7H2O H3BO3 KI Na2MoO4·2H2 CuSO4·5H2O CoCl2.6H2O | 3.3mg 1.5mg 1.6mg 0.8mg - - - | 미세 염 MnSO4·H2O ZnSO4·7H2O H3BO3 KI Na2MoO4·2H2 CuSO4·5H2O (또는 CuSO4) CoCl2.6H2O | 16.9 mg 8.6 mg 6.20mg 0.83mg 0.25 mg 0.025mg 또는 0.016mg 0.025mg |
| N6 비타민 니코틴산 티아민·HCl 피리독신·HCl 글리신 | 0.5mg 0.1mg 0.5mg 2.0mg | 비타민 니코틴산 티아민·HCl 피리독신·HCl 글리신 미오-이노시톨 | 0.5mg 0.1mg 0.5mg 2.0mg 100mg |
[실시예 3] 형질전환 효율 향상을 위한 아그로박테리움 접종 및 공동배양 방법
목표 유전자의 식물체로의 도입을 향상시키기 위하여 아그로박테리움 접종 및 공동배양 방법을 개량하였다.
3-1. 아그로박테리움 접종
3일간 증식된 캘러스를 빈 페트리 접시에 옮긴 후 15-20ml의 아그로박테리움 현탁액을 부어 약 20-30분간 접종하였다. 접종 후에 멸균된 여과지가 들어있는 페트리 접시에 캘러스를 옮겨 남아 있는 아그로박테리움 현탁액을 제거한 후 공동배양배지에 치상하였다.
3-2. 공동배양
목표 유전자의 식물 세포 내로의 도입을 향상시키고 형질전환된 세포의 생존율을 높이기 위해 공동배양 배지조성 및 조건을 변경하였다(표 3 참조). 배지조성에서의 차이점은 기본배지(2N6)의 함량을 1/2로 줄이고 아그로박테리움과의 공동배양 과정에서 발생되는 식물 세포의 산화적 파괴를 최소화하기 위하여 3종의 항산화 화합물 즉 L-시스테인 10.5mg/L, 티오황산나트륨 1mM, 디티오트레이톨 1mM 등을 첨가하였으며 아그로박테리움의 과도한 성장 및 에틸렌의 활성을 억제하기 위해 질산은 5mg/L을 첨가하였다. 또한 질산은 첨가로 인하여 배지가 물러지는 현상을 방지하기 위해서 첨가되는 젤라이트의 양을 3.0g/L로 높였다.
종래 방법과 달라진 처리로는 접종된 캘러스를 공동배지 위에 직접 올려놓는 종래 방법과는 달리 공동배지 위에 여과지(Watman #1) 1매를 덮고 그 위에다 둠으로써 접종된 세포의 안정성을 높였으며 공동배양 기간동안의 온도는 3℃ 정도의 차이로 변온 처리하였다. 상기의 본 발명에 의한 개량된 방법을 통하여 아그로박테리움의 성장속도를 조절하는 것이 가능하여 공동배양 기간을 5일 이상(벼 품종에 따라 최장 9일까지)으로 연장하였으며 공동배양 기간을 9일 이상으로 연장한 경우에도 아그로박테리움의 과도한 성장으로 인한 피해는 관찰되지 않았다.
| 처리 내용 | 종래 방법 (2N6-AS) | 본 발명의 방법 (1/2-2N6-AS-New) | |
| 배지 조성 | 기본배지(2N6) | 기준량 | 기준량의 1/2량 |
| 항산화 화합물 | 없음 | 3종의 항산화 화합물 첨가 (L-시스테인 10.5mg/L, 티오황산나트륨 1mM, 디티오트레이톨 1mM) | |
| 아그로박테리움 성장 및 에틸렌 활성 억제 물질 | 없음 | 질산은 5mg/L | |
| 젤라이트 양 | 2.5g/L | 3.0g/L | |
| 여과지(filterpaper) | 없음 | 여과지(#1)를 배지 위를 덮어줌 | |
| 온도 처리 | 26.5℃ 고정 | 26.5℃→23.5℃(3도차 변온처리) | |
| 공동배양 기간 | 3일 | 26.5℃(1일)→23.5℃(4일-8일) 5일 이상 처리 | |
[실시예 4] 형질전환된 캘러스의 선발 및 재분화 식물체 육성
목표 유전자가 도입된 캘러스를 선발하고 재분화된 식물체는 유도, 발근 및 순화과정을 거쳐 완전한 형질전환 식물체로 육성하였다.
4-1. 형질전환된 캘러스의 선발
공동배양 과정이 끝난 캘러스는 아그로박테리움을 제거하기 위해 세포탁심(cefotaxim) 250mg/L이 포함된 용액으로 약 10회 이상 세척하였으며, 세척이 끝난 캘러스는 멸균된 여과지가 들어 있는 페트리 접시로 옮겨 담아 남아 있는 용액을 완전히 제거하였다. 이 과정을 마친 캘러스는 PPT(6mg/L)가 포함된 2N6-CP 배지(표 1 참조)에 옮겨 27℃ 암조건에서 3주 동안 형질전환된 캘러스를 1차로 선발하였으며 선발된 캘러스는 동일 배지에 동일 조건으로 2주 동안 배양하는 과정으로 2차 선발하였다.
4-2. 형질전환된 캘러스로부터 재분화 식물체 유도
선발된 캘러스는 PPT 3mg/L, 세포탁심 250mg/L, NAA(Naphthalene Acetic Acid) 1mg/L, 키네틴(Kinetine) 5mg/L, 소르비톨 30g/L 및 말토오스 20g/L이 포함된 MSR-CP 배지(표 1 참조)에 치상한 다음 25℃ 명조건에서 배양하여 형질전환식물체를 유도하였다.
4-3. 뿌리 유도 및 순화
재분화식물체는 생장호르몬이 포함되지 않은 MS0 배지(표 1 참조)에 옮겨 뿌리를 유도하였다. 뿌리가 유도된 식물체는 1000배 하이포닉스 수용액에 약 7-10일간 침지하여 순화시켰으며 순화된 식물체는 화분에 이식하고 온실에서 관리하였다.
[실시예 5] 본 발명에 의한 방법에 따른 형질전환 효율 비교
본 발명에 의한 공동배양 방법과 종래 방법의 형질전환 효율을 알아보기 위하여 GUS 운반체를 사용하여 공동배양 후 GUS 유전자의 식물 세포내 도입 정도와 형질전환율을 비교하였다.
5-1. 공동배양과정 후 접종된 캘러스에서의 GUS 발현 차이
아그로박테리움 pMJC-GB-GUS/LBA440를 흑남벼와 일미벼의 캘러스에 각각 접종하고 본 발명에 의한 방법과 종래 방법으로 공동배양을 실시한 다음 GUS의 발현 정도를 조사하였다. 종래 방법으로 처리된 캘러스의 경우 흑남벼와 일미벼 모두 GUS 발현정도가 매우 약하였으나 개량 방법으로 처리된 캘러스의 경우 GUS 발현이 흑남벼에서 20∼30%, 일미벼에서 40∼50% 정도로 매우 강하게 나타났다(도 3 참조). 이러한 결과는 공동배양 과정을 본 발명에 의한 개량된 방법으로 처리할 경우 목표 유전자를 목적으로 하는 식물 조직에 높은 효율로 도입 가능함을 보여 주고 있다.
5-2. 본 발명에 의한 방법과 종래 방법간 벼 형질전환율 비교
흑남벼에서 공동배양 과정을 종래 방법으로 처리하였을 때 접종에 사용된 500개의 캘러스에서 18개의 형질전환 식물체가 유도되어 3.6%의 형질전환율을 나타내었다. 이에 반해 본 발명에 의한 공동배양 방법으로 처리한 시험에서는 젤라이트(피타젤) 함량이 2.5g 첨가된 배지의 경우 17개의 형질전환 식물체가 유도되어 9.4%의 형질전환율을 보였으나 젤라이트 함량이 3.0g 첨가 때에는 77개의 형질전환식물체가 유도되어 형질전환율이 27.5%로 종래 방법보다 약 7배 이상 획기적으로 증가하였다. 젤라이트 함량에 따라 형질전환율의 차이를 보이는 것은 질산은을 공동배양배지에 첨가하였을 때 물러지는 현상에서 기인한 것으로 젤라이트 함량이 2.5g 들어간 배지는 그 위에 깔아놓은 여과지 위로 물기가 많이 생성되는 것이 관찰되었으며 이러한 원인이 형질전환율에 영향을 미친 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명에서는 젤라이트 함량을 3.0g 이상으로 조정하여 사용하였다. 일미벼에서의 형질전환율은 종래 방법이 3.3%인데 비해 개량 방법에서는 6.8%로 두 배 이상 증가되었으며 증가율은 흑남벼에 비해 다소 낮게 나타났다. 그리고 형질전환이 어려운 일품벼를 대상으로 한 처리에서는 종래 방법의 경우 형질전환 식물체를 얻지 못하였으나 본 발명에 의한 개량 방법에서는 2개의 독립 형질전환 식물체를 얻었는데 이러한 결과는 본 발명에 의한 방법이 품종 장벽을 어느 정도 극복할 수 있음을 보여주고 있다(표 4 참조).
| 품 종 | 처리별 | 공동배양기 간 | 피타젤 (Phytagel) 함 량 | 형질전환 캘러스 수 | 형질전환 식물체 수 (독립 라인) | 형 질 전환율 | 증가율 |
| 흑남벼 | 종래방법 | 3 일 | 2.5 g | 500 개 | 18 개 | 3.6 % | 100 |
| 본 발명 | 7 | 3.0 | 280 | 77 | 27.5 | 764 | |
| 본 발명 | 7 | 2.5 | 180 | 17 | 9.4 | 261 | |
| 일미벼 | 종래방법 | 3 | 2.5 | 240 | 8 | 3.33 | 100 |
| 본 발명 | 7 | 3.0 | 280 | 19 | 6.79 | 204 | |
| 일품벼 | 종래방법 | 3 | 2.5 | 250 | 0 | 0 | 100 |
| 본 발명 | 7 | 3.0 | 220 | 2 | 0.9 | 190 |
[실시예 6] 본 발명에 의한 방법의 벼 형질전환에 실제 적용
본 발명에 의한 방법이 실제 벼 형질전환에서도 GUS 운반체에서와 같이 높은 효율을 보이는지를 알아보기 위하여 IFS1 및 IFS2와 하핀 운반체를 대상으로 형질전환을 실시하였다. 흑남벼에 IFS1과 IFS2 유전자를 각각 형질전환하였을 때 20.8%와 32.1%의 형질전환율을 보여 GUS 운반체의 27.5%와 큰 차이를 보이지 않았다. 그리고 하핀 운반체를 일미벼에 형질전환하였을 때는 형질전환율이 12.4%로 GUS 운반체의 6.8% 보다 약 2배 정도 높은 효율을 보였다. 이러한 결과는 본 방법에 의한 개량 방법이 운반체의 종류에 상관없이 실제 벼 형질전환에도 잘 적용되고 있음을 나타내고 있다(표 5 참조).
| 품 종 | 벡 터 | 공동배양기 간 | 피타젤 함 량 | 형질전환 캘러스 수 | 형질전환 식물체 수 (독립 라인) | 형 질 전환율 |
| 흑남벼 | pMJC-GB-IFS1 | 7 일 | 3.0 g | 240 개 | 50 개 | 20.8 % |
| pMJC-GB-IFS2 | 7 | 3.0 | 280 | 90 | 32.1 | |
| 일미벼 | pMJC-GB-하핀 | 7 | 3.0 | 940 | 117 | 12.4 |
[실시예 7] 형질전환 식물체의 분자생물학적 분석 및 생물 검정
7-1. PCR을 이용한 GUS 유전자의 형질전환 확인
본 발명에 사용된 GUS 유전자가 형질전환된 벼 게놈에 성공적으로 삽입되었는지를 PCR 방법을 이용하여 확인하였다.
먼저 GUS 유전자가 형질전환된 벼 T0 식물체의 어린 잎에서 CTAB 방법(Rogers & Benich, 1994)으로 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 주형으로 하여 GUS 유전자의 ORF 557bp로부터 2005bp까지 1449bp 크기의 DNA 단편을 증폭하도록 디자인된 프라이머 세트인 서열번호 1의 GUS557FOR, 5'-GAA GCCGATGTCACGCCGTATGTT-3'(24 mer)와 서열번호 2의 GUS2005REV, 5'-CTAGCTT GTTTGCCTCCCTGCTGC-3'(24 mer)를 사용하여 PCR을 실시하였다.
PCR 반응을 위해서 벼 게놈 DNA는 50ng, 1X f-Taq 완충액(Solgent, Daejeon, Korea), 각 dNTP 50 μM, 1X 밴드 닥터(Solgent, Daejeon, Korea), f-Taq DNA 폴리머라아제 1.5 유닛(Solgent, Daejeon, Korea) 및 각 프라이머 25 pM를 첨가하고 멸균수로 최종 부피를 50μl로 맞추었다. PCR 반응은 MJ 리서치(MJ Research)사의 PCT-200 기기로 수행하였으며, 조건으로는 94℃에서 4분간 변성 반응시킨 후 94℃에서 15초간 변성, 55℃에서 30 초간 중합, 72℃에서 60초간 신장 반응을 30회 반복 후 72℃에서 7분간 신장 반응하도록 프로그램하였다. 증폭된 산물은 EtBr이 첨가된 0.8% 한천 겔(agarose gel)에서 분리되고 UV 트랜실루미네이터(UV transilluminator)에서 확인하였다.
도 5는 GUS 운반체를 흑남벼 캘러스에 접종하고 공동배양 과정을 종래방법과 본 발명에 의한 개량된 방법(Phytagel 3.0g)으로 처리한 후 유도된 형질전환 T0 식물체 99개 중 종래방법에서 5개체, 개량방법에서 15개체를 무작위로 선발하여 PCR한 결과를 보여주고 있다. 선발된 20개의 식물체는 모두 사용한 프라이머의 기대 크기인 1449bp 위치에서 하나의 밴드를 나타내어 GUS 유전자가 벼 게놈에 안정적으로 형질전환된 것으로 증명되었다. 도 5에서 비형질전환체는 대조군(Con)으로, 종래방법에 의한 재분화 개체는 1-1 내지 1-5, 본 발명에 의한 개량된 방법에 의한 재분화 개체는 3-1 내지 3-15로 나타내었다.
7-2. GUS 유전자의 발현 확인
GUS 유전자의 벼 게놈 내에 삽입이 확인된 상기 7-1에서 언급한 재분화 식물체를 대상으로 GUS 유전자의 발현을 확인하였다.
재분화 식물체의 잎을 가위로 여러 조각으로 자르고 50mM X-Gluc 용액(50mM 인산나트륨 완충액 pH 7.0, 0.2% 트리톤 X-100, 3mM 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide), 3mM 페로시안화칼륨(potassium ferrocyanide) 및 20% 메탄올에서 37℃ 조건으로 하룻밤 동안 처리한 후 70% 에탄올에 탈색시키는 방법으로 GUS의 발현을 확인하였다. 도 6은 그 결과를 보여주고 있으며 개량 방법에 의한 재분화 개체는 15개 중 13개에서, 종래 방법은 5개 중 3개에서 GUS의 발현이 확인되어 GUS 유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 알 수 있었다.
7-3. 제초제 저항성 생물검정
선발마커로 사용된 제초제 저항성 bar 유전자의 기능을 평가함으로써 형질전환 식물체를 재확인하였다. 제초제 저항성 생물검정은 상기 실시예 6과 7-1에서 언급한 형질전환 T0 식물체 398개체 전부를 대상으로 하였으며 공시된 개체의 식물체 전체에 0.3% 바스타 액제를 고르게 2회 살포함으로써 실험에 따른 에러를 최소화하였다. 검정 결과 본 발명에서 획득된 398개체는 바스타 살포 후 모두 생존하여 제초제에 저항성을 보이는 것으로 조사되었다. 이와 같이 회피개체가 한 개체도 없었다는 점은 본 발명에 사용된 bar 유전자가 벼 형질전환에서 선발마커로 엄격히 적용되었음을 증명하고 있다.
도 7은 일품벼 캘러스에 GUS 운반체를 접종하고 본 발명에 의한 방법으로 공동배양처리 후 획득된 형질전환식물체에 대한 제초제 저항성을 확인한 결과이다. 0.3% 바스타 액제를 형질전환체와 비형질전환체에 각각 2회 살포하였을 때 비형질전환식물체는 도 7에서 보는 봐와 같이 완전히 고사하였으나 형질전환식물체는 생생하게 살아 제초제에 저항성을 보였다. 도 7에서 비형질전환체는 야생형(Wild type)으로 나타내었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 방법으로 형질전환하는 경우 식물의 형질전환 효율을 상당히 높일 수 있었으며, 목표로 하는 형질전환 식물체를 빠른 기간 내에 생산할 수 있어 형질전환과정에서 소요되는 인력 및 비용을 절감할 수 있었다. 또한, 형질전환이 어려운 품종을 대상으로도 형질전환 식물체의 생산이 가능해짐으로써 상업적으로 이용 가능한 우수한 품종을 조기에 개발할 수 있을 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Method for improving the introduction of the target gene into
plant cell
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GUS557FOR primer
<400> 1
gaagccgatg tcacgccgta tgtt 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GUS2005REV primer
<400> 2
ctagcttgtt tgcctccctg ctgc 24
Claims (10)
- (A) 외래의 목적유전자 및 선발인자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하고 완성된 재조합 플라스미드를 아그로박테리움에 도입하는 단계; (B) 상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물체의 목적 조직과 공동배양하는 단계; (C) 상기 공동배양한 식물체의 조직을 선발배지에서 선발하고 증식시키는 단계; 및 (D) 상기 선발된 조직을 재분화시키고 생산된 식물체를 순화시키는 단계;를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서,공동배양 단계에서 질산은과 함께 항산화 화합물로서 L-시스테인, 티오황산나트륨 및 디티오트레이톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 첨가하여 배양함을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 (B) 단계의 목적조직은 벼, 콩, 보리, 옥수수, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수 등의 식량작물; 토마토, 고추, 딸기, 파, 양파, 당근, 배추, 무, 수박, 오이, 양배추 및 호박 등의 채소작물; 인삼, 참깨, 들깨, 땅콩, 유채, 목화, 사탕수수, 사탕무우 및 담배 등의 특용작물; 사과나무, 배나무, 대추나무, 포도, 감귤, 감, 살구, 바나나, 양다래, 장미, 국화, 백합, 거베라, 카네이션, 프리지아, 글라디올러스 및 튤립 등의 과수 및 화훼식물; 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 레드클러버 및 라이그라스 등의 사료작물; 및 아라비돕시스 등의 기타식물로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 형질전환용 식물이 벼인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 (C)의 공동배양 단계에서 기본배지 2N6 조성을 1/2로 줄이고, 항산화물질인 L-시스테인 5∼50mg/L, 티오황산나트륨 0.1∼5mM 및 디티오트레이톨 0.1∼5mM를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 (C)의 공동배양 단계에서 질산은 1∼10mg/L을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 (C)의 공동배양 단계에서 젤라이트 2.6∼5g/L를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 (C)의 공동배양 단계에서 공동배지 위에 여과지(Watman #1)를 1매 덮고 그 위에 캘러스를 두는 과정을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 (C)의 공동배양 단계에서 처리 온도를 처음 하루는 26∼28℃에서 처리한 후 나머지 기간은 23∼25℃로 처리하여 처음의 온도보다 3℃ 변경하는 변온처리 과정을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 (D)의 재분화 식물체를 유도하는 단계에서 식물의 재분화 배지에 NAA((Naphthalene Acetic Acid) 0.1∼5mg/L, 키네틴(Kinetine) 1∼10mg/L, 소르비톨 20∼40g/L 및 말토오스 10∼30g/L로 이루어진 배지 조성을 사용하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 의한 방법에 의해 목표 유전자가 도입된 형질전환 식물체 또는 그의 종자.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20050804 |
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| PA0201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20061031 Patent event code: PE09021S01D |
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| PG1501 | Laying open of application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20070518 |
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| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0702 | Registration of establishment of national patent |
Patent event code: PR07021E01D Comment text: Registration of Establishment of National Patent Patent event date: 20070629 |
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| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20070629 End annual number: 20 Start annual number: 1 |
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| PG1601 | Publication of registration | ||
| G170 | Re-publication after modification of scope of protection [patent] | ||
| PG1701 | Publication of correction |