CN117604027B - 一种新的菠萝高效遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的菠萝高效遗传转化方法，诱导出菠萝愈伤后，暗培养增殖，再继续暗培养，通过暗培养诱导菠萝愈伤组织不定芽分化，使莲座状的丛生芽抽生茎秆，再按节切段(1节/段)作为受体材料进行农杆菌侵染，经再分化和筛选获得转基因植株，显著提高了菠萝农杆菌介导转化效率，PCR检测遗传转化植株阳性率能够达到41.51％，显著高于现有的方法的阳性率，在菠萝规模化转基因实践中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种遗传转化方法，尤其涉及一种新的菠萝高效遗传转化方法。
背景技术
菠萝(Ananas comosus)又称凤梨，是世界三大热带果树之一，也是重要的观赏植物和纤维植物。像其它园艺作物一样，菠萝的种质资源创制和品种改良仍然依靠杂交育种、诱变育种和芽变选种等常规育种技术。由于菠萝是无性繁殖植物，其遗传基础狭窄、基因组杂合度高、基因连锁性强，遗传变异率低，常规育种技术很难创制出遗传性状优异的种质材料。另一方面，菠萝又是严格的配子体型自交不亲和性植物，不能通过自交获得纯合子，给基因定位和遗传规律分析造成了极大的困扰。
随着生物科学的迅速发展，基因分析功能鉴定、基因编辑、转基因育种和智能设计育种转等方法已逐渐引入植物育种研究之中，利用转基因技术培育了具有抗除草剂、抗虫等性状的转基因玉米、大豆、棉花和油菜新品种，自1996年以来在全球大面积种植，产生了巨大的经济效益和社会效益。然而，这些研究都必须建立在高效的遗传转化体系的基础之上。菠萝的遗传转化始于上世纪末期，Firoozabady等(1998，1999)用胚性愈伤组织作为转化的受体材料，通过根癌农杆菌介导法将GUS基因导入菠萝植株中。此后，不断有菠萝遗传转化的报道(Firoozabady et al.,2005；Firoozabady&Gutterson,1998；Firoozabady&Moy,2004；何业华等,2006；Jun et al.,2012；Ming,2018；Sripaoraya et al.,2001)。
虽然目前菠萝离体再生技术已较成熟(何业华等,2006,2010,2012)，但由于菠萝等自身的独特性，对于转基因技术经验积累较少的研究人员来说，建立稳定的菠萝转化体系依然难度较大，获得能改变遗传性状的转基因材料还非常少。在已有的报道中，菠萝的转化受体有用茎尖、叶基、愈伤组织、悬浮细胞系和体细胞胚等(何业华等,2006；Wang etal.,2009；谢桃,2019)，然而目前菠萝的转化效率依然很低。以普通愈伤组织作为转化受体，经3代、5代和7代筛选后的累计阳性率分别9.9％、0.77％和0.017％(Fang，2009)。因此，寻找新的受体材料和转化方法来提高菠萝转化效率对推动其转基因技术的应用具有重大意义。
植物高效的遗传转化体系首先必须依赖良好的受体材料，它应该是能够大量获得、植株再生能力强和容易接受T-DNA导入的组织。由于农杆菌介导时受体材料需要产生伤口和容易再生，在目前所用的菠萝转化材料中，茎尖因为数量少、消毒费力和再分化较困难，不宜直接作为转基因的受体材料；另一方面，由于菠萝容易分化，经过4-5代以上培养的愈伤组织、悬浮细胞系和体细胞胚等在体视镜下观察发现，它们实际上主要是由莲座状(无明显茎)芽体组成丛生不定芽，以丛生芽作受体材料转化效率非常低；而叶基作为转化受体虽然转化效率稍高，但必须是来源于组织培养产生不定芽的幼嫩叶基，数量有限。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种新的菠萝高效遗传转化方法。
本发明的技术方案如下所示：
一种菠萝高效遗传转化方法，包括以下步骤：
(1)愈伤组织诱导：诱导出菠萝非胚性愈伤组织，然后暗培养增殖；
(2)茎组织培养：继续暗培养，直至在菠萝愈伤上生出茎秆；
(3)植株转化：以菠萝茎秆的节点为切口处横切菠萝秆茎，将其分为几段，产生伤口，然后采用活化的转基因农杆菌侵染；
(4)筛选培养：将侵染后菠萝秆茎段接种在含不同浓度Km的培养基中进行多轮筛选，最后将抗性芽转移至生根培养基进行生根培养；
(5)炼苗移栽，得到正常生长菠萝苗；
(6)PCR阳性检测。
其中，步骤(1)中暗培养的培养基为MS+2.8-3.2mg/L 6-BA+1.8-2.2mg/L NAA，优选为MS+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA。
其中，步骤(2)中暗培养的培养基为MS+2.8-3.2mg/L 6-BA+1.8-2.2mg/L NAA，优选为MS+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA。
其中，步骤(1)中暗培养的温度为25-32℃，优选为26-30℃，更优选为28℃。
其中，步骤(2)中暗培养的温度为25-32℃，优选为26-30℃，更优选为28℃。
优选地，步骤(2)中暗培养直至在菠萝愈伤上生出高达10cm以上、具有8节以上茎秆。
优选地，步骤(2)中暗培养50-70天，优选为58-72天，更优选为60天。
优选地，步骤(4)中经过4轮抗Km筛选，Km的浓度依次为28-32mg/L、38-42mg/L、48-52mg/L和58-62mg/L，优选地，Km的浓度依次为30mg/L、40mg/L、50mg/L和60mg/L。
更优选地，步骤(4)中，将侵染后菠萝秆茎段接种于筛选培养基S1正常培养，然后依据接种于筛选培养基S2、筛选培养基S3和筛选培养基S4，每个培养基中培养26-30d后换培养基。
其中，筛选培养基S1为MS+1.8-2.2mg/L 6-BA+0.8-1.2mg/L NAA+6-8g/L琼脂+28-32g/L蔗糖+48-52mg/LCarb+28-32mg/L Kan，优选为MS+2.0mg/L 6-BA+1mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+50mg/L Carb+30mg/L Kan，
其中，筛选培养基S2为MS+1.8-2.2mg/L 6-BA+0.8-1.2mg/L NAA+6-8g/L琼脂+28-32g/L蔗糖+38-42mg/L Carb+38-42mg/L Kan，优选为(MS+2.0mg/L 6-BA+1mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+40mg/LCarb+40mg/L Kan，
其中，筛选培养基S3为MS+1.8-2.2mg/L 6-BA+0.8-1.2mg/L NAA+6-8g/L琼脂+28-32g/L蔗糖+28-32mg/LCarb+48-52mg/L Kan，优选为MS+2.0mg/L 6-BA+1mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+30mg/L Carb+50mg/L Kan，
其中，筛选培养基S4为MS+1.8-2.2mg/L 6-BA+0.8-1.2mg/L NAA+6-8g/L琼脂+28-32g/L蔗糖+18-22mg/L Carb+58-62mg/L Kan，优选为MS+2.0mg/L 6-BA+1mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+20mg/LCarb+60mg/L Kan，
其中，生根培养基为MS+1.8-2.2mg/L 6-BA+0.8-1.2mg/L NAA+6-8g/L琼脂+28-32g/L蔗糖，优选为MS+1.0mg/L IBA+1.0mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖。
优选地，步骤(3)中在转染之前，将横切后的茎秆段在黑暗中预培养处理2-3d，预培养的培养基为：MS+6-BA 1.8-2.2mg/L+NAA0.9-1.1mg/L+蔗糖25-35g/L+琼脂5-9g/L，优选为MS+6-BA2mg/L+NAA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L。
其中，步骤(3)中侵染结束后，将菠萝茎段与农杆菌基黑暗中共培养2-3d。
其中，共培养的培养基为MS+1.8-2.2mg/L 6-BA+0.8-1.2mg/L NAA+6-8g/L琼脂+28-32g/L蔗糖+90-110μmol/L AS，优选为MS+2.0mg/L 6-BA+1mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+100μmol/L AS。
其中，转基因农杆菌为含有目标基因的农杆菌，本领域技术人员可根据实际应用需要的对目标基因进行选择，本发明对此不作特别限定。在本发明一个具体实施方式中，转基因农杆菌选用的是含有pK7WG2D-AcPI的根癌农杆菌GV3101，应当理解的是，此处是为了举例说明，并不限定本发明，本领域技术人员可根据实际需要选择其他目标基因连接到合适的载体上，转化成转基因农杆菌，进行应用。
本发明建立了一种新的菠萝高效遗传转化方法，通过暗培养诱导菠萝愈伤组织不定芽分化，使莲座状的丛生芽抽生茎秆，再按节切段(1节/段)作为受体材料进行农杆菌侵染，经再分化和筛选获得转基因植株，显著提高了菠萝农杆菌介导转化效率，PCR检测遗传转化植株阳性率能够达到41.51％，显著高于现有的方法的阳性率，在菠萝规模化转基因实践中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为菠萝愈伤组织通过暗培养发育出茎秆。
图2为菠萝茎段在光下和暗下诱导愈伤和不定芽。
图3为侵染后菠萝秆茎段接种在不同筛选培养基生长状况及转化植株生根和移栽情况。A：S1培养。B：S2培养。C：S3培养。D：S4培养。E：生根培养。F：转基因植株移栽后生长情况。
图4为转基因鉴定结果。A：AcActin引物检测。B：Kan引物检测。C：载体前引+基因后引检测。D：C图中经检测为遗传转化阳性植株的PCR产物与转基因载体的序列比对。
图5为转基因植株表型观察。A、B、C：野生型‘神湾’。D、E、F：转基因‘神湾’。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
1材料
本试验菠萝材料为‘神湾’(Ananas comosus cv.Shenwan)，采自华南农业大学园艺学院果园，取其吸芽作为外植体；含有AcPI的植物超表达重组质粒(pK7WG2D-AcPI)(制备方法参见中国专利申请CN202210519193.6，“一种调控植物器官形态的功能基因AcPI及其应用”)。
应当理解的是，本实验以“神湾”为菠萝材料进行实验只是举例说明，也可以以其他菠萝品种为材料进行相关实验，比如‘巴厘’、‘玉玲珑’、‘冰糖红’、‘红珍珠’、‘热品紫叶’、‘茜碧’等菠萝品种均可。
2方法和结果
2.1愈伤组织诱导
按照何业华等(何业华等,2010)的方法，诱导出的菠萝愈伤后暗培养增殖，温度28℃。具体操作为：
于超净工作台中，将无菌苗(高3～5cm)叶片带基部茎皮撕下，在MS+2.0mg·L-1 6-BA+2.5mg·L-1NAA培养基上诱导非胚性愈伤组织，4周后切下非胚性愈伤组织转到增殖培养基(MS+3mg·L-16-BA+2mg·L-1NAA)上，每4周继代1次进行愈伤组织增殖培养。
2.2茎组织培养
诱导出愈伤组织后，将菠萝愈伤组织在暗处(28℃)继续暗培养60d左右(期间不用换培养基)，此时在菠萝愈伤上会发出多个细细长长的茎秆，进而用茎秆进行农杆菌介导的菠萝遗传转化。
将菠萝(A.comosus)愈伤组织暗处(28℃)培养60d左右不换培养基，愈伤组织会慢慢长出茎秆(图1)。菠萝茎秆培养至组培瓶2/3处，茎秆粗1.5mm左右时，于超净工作台上将茎秆组织切分为1cm茎段组织(注意一定要切到茎秆节点，此处有生长点)，整齐排列于MS固体培养皿，分别放在光下和暗下培养30d左右，发现光下慢慢分化愈伤进而长出不定芽，有趣的是，在暗培养下也会诱导出愈伤，当然也会长出类似菠萝叶片的植物组织(图2)，说明此时茎段具有分化出愈伤的能力，适合作为转化菠萝的受体。
愈伤组织、悬浮细胞系和体细胞胚等离体培养物作受体时，易大批量获得、无菌和无需经过脱分化过程，优点是显而易见的。但菠萝脱分化形成的愈伤组织在增殖培养基(MS+3.0mg/L BA+2.0mg/L NAA)上继代3次以上时会产生大量直径1mm左右的小球茎状不定芽。切片在体视镜下观察后会发现，这些小球茎实际是莲座状的，外被是1-数枚幼小叶片，中间是空的，顶端生长点极其细小。这种小球茎如在浸染的不从生长点处切开，T-DNA进入受体细胞的可能性极小。刚从液体培养基中取的悬浮细胞系太分散，不易切出伤口，需在固体培养基上培养1代。体细胞胚需是体细胞胚诱导初期的胚性愈伤组织，已进入体细胞胚分化中后期的材料转化率低。但本发明中利用菠萝茎秆培养愈伤组织进行转化实验，极大的增加了受体的可获得性以及新鲜度，大大提高了转化效率。采用由外植体获得的1代愈伤再发育出的茎秆组织做受体是转化成功秘诀之一。
2.3植株转化
按照何业华等(何业华等,2012)的方法进行转化，划线培养含有pK7WG2D-AcPI的根癌农杆菌GV3101，挑取单克隆于含有Kan(100mg/ml)的YEP液体培养基，在28°摇床(280rpm)下振荡过夜，摇至菌液浓度为0.5-0.8ng/μL。茎组织长到组培瓶的2/3时(高度达10cm以上、具有8节以上茎秆)，于超净工作台内小心用解剖刀横切菠萝茎，切口处为节点(此处有生长点，以供分化愈伤)，将其分为几段，产生伤口用于农杆菌侵染。将茎秆组织切分成1cm大小，接于MS+6-BA2mg/L+NAA1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L,pH＝5.8的培养基中，黑暗中预培养处理2d。将预培养后的菠萝茎段转至20mL无菌注射器中，向其中加入10m L农杆菌菌液，推动注射器芯杆排出多余气体至注射器的10mL刻度处，用橡胶塞堵住注射头后，拉动芯杆至20mL刻度处使得根癌农杆菌处于真空环境下侵染菠萝茎段，每次真空侵染1.5min，期间不断晃动注射器。侵染结束后，黑暗条件下在MS+2.0mg/L6-BA+1mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+100μmol/L AS共培养2-3d。共培养结束后，取出菠萝茎段用无菌水洗3遍，洗去表面的农杆菌后，将秆茎段接种于筛选培养基S1培养，10d后开始分化出愈伤和不定芽，28d后将愈伤和不定芽依次转入筛选培养基S2、S3和S4，各培养基中依次培养26-30d后，将绿芽转录生根培养基(光照条件下完成筛选培养和生根培养)。
筛选培养基S1为MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+50mg/L Carb+30mg/L Kan，
筛选培养基S2为MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+40mg/L Carb+40mg/L Kan，
筛选培养基S3为MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+30mg/L Carb+50mg/L Kan，
筛选培养基S4为MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+20mg/L Carb+60mg/L Kan，
生根培养基为MS+1.0mg/L IBA+1.0mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖。
结果显示，农杆菌介导的pK7WG2D-AcPI转化了1540个茎段，经过连续4轮的选择，获得了53株抗Kan植株。第二轮筛选培养后，菠萝茎段两端开始分化愈伤组织，部分茎段组织变黑，而部分茎段腋芽出开始分化不定芽，留下愈伤组织，淘汰掉变黑的组织和腋芽组织，pAcPI第二代愈伤的发生率为83.1％(表1)。第二轮选择培养后进入S3，前一阶段的愈伤长出不定芽，可看见2～5枚肉眼可辨别的叶片，绿芽(Kan抗性芽)率56.2％。继续提高Kan质量浓度至60mg/L，加大选择压力，这样在第4轮选择培养结束后，第1轮中的大部分假阳性植株因还原为白色植株而被清除掉；淘汰率63％～78％。第4轮选择后，将抗性芽转移至生根培养基中，当培养至植株具8枚以上长度约3cm的叶、5条以上长度大于1cm的根时，即可进行炼苗移栽，移栽后转化苗能正常生长。
表1pAcPI不同Kan浓度的筛选情况
2.4抗性植株的分子检测
分别取0.2g转化植株和非转化植株叶片，采用CTAB法提取DNA，提取53株绿色菠萝组培苗基因组DNA，根据AcActin上游引物(AcActin-F:CTGGCCTACGTGGCACTTGACTT、AcActin-R:CACTTCTGGGCAGCGGAACCTTT)，用Actin检测DNA，再用Kan引物(Kan-F:GTTCTTTTTGTCAAGACCGACC、Kan-R:CAAGCTCTTCAGCAATATCACG)对其基因组DNA进行PCR扩增，最后用AcPI特异引物和载体通用引物(35S-F:CTATCCTTCGCAAGACCCTTC、qPI-R:CCCTCATGTTCCCATTCATC)对其基因组DNA进行目的片段PCR扩增。以上用擎科生物科技的I-52×High-Fidelity Master Mix进行检测，PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
结果如图4所示，用Actin检测DNA都可用(图4-A)，再用Kan引物对其基因组DNA进行PCR扩增，53株绿色菠萝组培苗中有50株可以扩增出目的片段(图4-B)，最后用AcPI特异引物和载体通用引物对其基因组DNA进行PCR扩增，所取的53株中有22株扩增出了目的片段，分别是图4-C中的第13、25、26、27、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、47-1、48、49号植株，经PCR产物检测和序列比对鉴定(图4-D)遗传转化阳性率达41.51％。
2.5表型结果
与野生型植株相比(图5A-C)，转基因植株(图5D-F)叶片基部以及叶片表面除了毛鳞片覆盖的数量不同外，特殊的有出现红色。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (6)
1.一种菠萝遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）愈伤组织诱导：诱导出菠萝非胚性愈伤组织，然后28℃暗培养增殖，暗培养的培养基为MS+2.8-3.2 mg/L 6-BA+1.8-2.2 mg/L NAA；
（2）茎组织培养：继续28℃暗培养50-70天，培养基为MS+2.8-3.2 mg/L 6-BA+1.8-2.2mg/L NAA，直至在菠萝愈伤上生出高达10cm以上、具有8节以上茎秆；
（3）植株转化：以菠萝茎秆的节点为切口处横切菠萝秆茎，将茎秆组织切分成1 cm大小，接于MS+6-BA 2 mg/L+NAA 1 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 7 g/L, pH=5.8的培养基中，黑暗中预培养处理2 d，然后采用活化的转基因农杆菌侵染；侵染结束后，将菠萝茎段与农杆菌基黑暗中共培养2-3d；共培养的培养基为MS+1.8-2.2 mg/L 6-BA+0.8-1.2 mg/L NAA+6-8 g/L琼脂+28-32 g/L蔗糖+90-110 μ mol/L AS；
（4）筛选培养：共培养结束后，取出菠萝茎段用无菌水洗3遍，洗去表面的农杆菌后，将秆茎段接种于筛选培养基S1培养，10 d 后开始分化出愈伤和不定芽，28 d 后将愈伤和不定芽依次转入筛选培养基S2、S3和S4，各培养基中依次培养26-30d后，将绿芽转录生根培养基，光照条件下完成筛选培养和生根培养；
筛选培养基S1为MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+50 mg/L Carb+30mg/L Kan，
筛选培养基S2为 MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+40 mg/L Carb+40mg/L Kan，
筛选培养基S3为MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+30 mg/L Carb+50mg/L Kan，
筛选培养基S4为MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+20 mg/L Carb+60mg/L Kan，
生根培养基为MS+1.0mg/L IBA+1.0mg/LNAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖；
（5）炼苗移栽，得到正常生长菠萝苗；
（6）PCR阳性检测。
2.根据权利要求1所述的菠萝遗传转化方法，其特征在于，步骤（1）中，暗培养的培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA；
步骤（2）中暗培养的培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA。
3.根据权利要求1或2所述的菠萝遗传转化方法，其特征在于，步骤（2）中暗培养58-72天。
4.根据权利要求3中任意一项所述的菠萝遗传转化方法，其特征在于，步骤（2）中暗培养为60天。
5.根据权利要求1所述的菠萝遗传转化方法，其特征在于，步骤（3）中，共培养的培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+1mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+100 μ mol/L AS。
6.根据权利要求1所述的菠萝遗传转化方法，其特征在于，转基因农杆菌为含有pK7WG2D-AcPI的根癌农杆菌GV3101。
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