JP2021007321A - カルスからの植物器官の形成効率を向上させる方法 - Google Patents

Abstract

【課題】カルスからの植物器官の形成効率を向上させる新規な方法を提供する。【解決手段】カルスからの植物器官の形成効率を向上させる方法は、植物体又は植物組織片に放射線を照射する照射工程と、前記照射工程後の植物体又は植物組織片からカルスを誘導するカルス誘導工程と、前記カルスを培養して再分化させる再分化工程と、を含む。照射工程における放射線の照射線量は、例えば、２０Ｇｙ〜１４０Ｇｙであってもよい。【選択図】図２

Description

本発明は、カルスからの植物器官の形成効率を向上させる方法に関する。

クローン技術を用いてある植物体から別の植物体を生産する方法として、植物組織片からまずカルス（細胞塊）を作製し、そこから新たに植物器官を形成する技術が知られている。しかし、植物の種類によってはカルスからの植物器官の形成が困難であるためにこの方法を適用できない場合がある。したがって、植物器官の形成を促す要因を見出すことは、クローン技術を用いた植物体の生産効率の向上に有用であると考えられる。

本発明者らは先の研究により、ヒストン修飾酵素（ヒストン脱メチル化酵素、ヒストンメチル化酵素等）として作用するタンパク質をコードする核酸を植物体に導入することで、カルスからの植物器官の形成効率が向上することを見出した（例えば、特許文献１、２参照）。

特開２０１９−２４３７３号公報 特開２０１９−２４３７４号公報

しかし、特許文献１、２に記載の方法はいずれも核酸の導入を必要とするものであり、簡便な方法とは言い難かった。

本発明は、カルスからの植物器官の形成効率を向上させる新規な方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞ カルスからの植物器官の形成効率を向上させる方法であって、
植物体又は植物組織片に放射線を照射する照射工程と、
前記照射工程後の植物体又は植物組織片からカルスを誘導するカルス誘導工程と、
前記カルスを培養して再分化させる再分化工程と、を含む方法。

＜２＞ 前記放射線がγ線又はＸ線である＜１＞に記載の方法。

＜３＞ 前記照射工程における前記放射線の照射線量が２０Ｇｙ〜１４０Ｇｙである＜１＞又は＜２＞に記載の方法。

＜４＞ 前記カルスが、植物の根、葉、茎、芽、花、又は枝から誘導される＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の方法。

本発明によれば、カルスからの植物器官の形成効率を向上させる新規な方法を提供することができる。

シロイヌナズナの苗に４０Ｇｙ又は８０Ｇｙのγ線を照射した後、根端部をカルス誘導培地で６日間培養し、誘導されたカルスをシュート誘導培地で２１日間培養した場合における、カルスからのシュート形成の状態を示す図である。 図１Ａにおけるカルス１個あたりのシュート数を示す図である。 シロイヌナズナの苗に２０Ｇｙ〜１００Ｇｙのγ線を照射した後、根端部をカルス誘導培地で６日間培養し、誘導されたカルスをシュート誘導培地で１４日間培養した場合における、カルス１個あたりのシュート数を示す図である。 シロイヌナズナの苗に８０Ｇｙのγ線を照射した後、根端部をカルス誘導培地で３日間〜８日間培養し、誘導されたカルスをシュート誘導培地で１４日間培養した場合における、カルス１個あたりのシュート数を示す図である。 野生型のシロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）の苗、及びＤＮＡ損傷修復に関係する遺伝子（ａｔｒ遺伝子、ａｔｍ遺伝子、又はｓｏｇ１−１遺伝子）をノックアウトしたシロイヌナズナの苗に４０Ｇｙのγ線を照射した後、根端部をカルス誘導培地で６日間培養し、誘導されたカルスをシュート誘導培地で１４日間培養した場合における、カルス１個あたりのシュート数を示す図である。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本明細書において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。

本実施形態に係るカルスからの植物器官の形成効率を向上させる方法（以下、「植物器官形成効率向上方法」ともいう。）は、植物体又は植物組織片に放射線を照射する照射工程と、照射工程後の植物体又は植物組織片からカルスを誘導するカルス誘導工程と、カルスを培養して再分化させる再分化工程と、を含む。

本発明者らの検討により、放射線照射後の植物体又は植物組織片からカルスを誘導し、そのカルスを培養して再分化させると、カルスからの植物器官の形成効率が向上することが見出された。このような知見は、これまで報告されていないものである。

ここで、カルスからの植物器官の形成とは、カルスから、幼芽、不定芽、不定根、茎、葉等の植物器官を形成させることを意味する。植物器官には、一般的にシュートと称される、茎頂分裂組織に由来する茎及びそれに付随する葉、不定芽等を含んだ構造も含まれる。また、植物器官の形成効率の向上とは、放射線を照射しない場合と比較して、植物器官形成過程の一時点において、植物器官の形成割合が向上していることを意味する。

以下、本実施形態に係る植物器官形成効率向上方法の各工程について説明する。

まず、照射工程では、植物体又は植物組織片に放射線を照射する。放射線としては、α線、β線、γ線、中性子線、Ｘ線、イオンビーム等が挙げられる。これらの中でも、γ線、Ｘ線等の電磁放射線が好ましい。放射線源としては、所望の放射線を放射するものを用いることができる。例えば、γ線であれば、コバルト６０等を用いることができる。

放射線の照射線量は、放射線の種類や植物の種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。放射線の照射線量は、例えば、２０Ｇｙ〜１４０Ｇｙであってもよく、３０Ｇｙ〜１３０Ｇｙであってもよく、４０Ｇｙ〜１２０Ｇｙであってもよく、４０Ｇｙ〜１１０Ｇｙであってもよく、４０Ｇｙ〜１００Ｇｙであってもよく、５０Ｇｙ〜１００Ｇｙであってもよく、６０Ｇｙ〜１００Ｇｙであってもよい。

植物体に放射線を照射する場合、放射線は、植物体の全体に照射してもよく、一部の部位にのみ照射してもよい。植物体の一部の部位にのみ放射線を照射する場合、放射線を照射する部位としては、後段のカルス誘導工程においてカルスを誘導する部位（根、葉、茎、芽、花、枝等）であることが好ましい。また、植物組織片に放射線を照射する場合、植物組織片としては、後段のカルス誘導工程においてカルスを誘導する部位（根、葉、茎、芽、花、枝等）であることが好ましい。

放射線の照射対象となる植物の種類は特に制限されない。放射線の照射対象となる植物は、被子植物及び裸子植物のいずれであってもよく、被子植物の場合、単子葉植物及び双子葉植物のいずれであってもよい。
裸子植物としては、ソテツ等のソテツ科植物；イチョウ等のイチョウ科植物；アカマツ、クロマツ、モミ、トウヒ等のマツ科植物；スギ等のスギ科植物；イチイ等のイチイ科植物；などが挙げられる。
単子葉植物としては、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ、タケ、ヨシ、ススキ、アマランサス、ミスカンサス、スイッチグラス、ソルガム等のイネ科植物；サトイモ等のサトイモ科植物；ヤシ、ナツメヤシ等のヤシ科植物；バナナ等のバショウ科植物；などが挙げられる。
双子葉植物としては、シロイヌナズナ、ナタネ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー等のアブラナ科植物；ナス、トマト、ジャガイモ、タバコ等のナス科植物；メロン、カボチャ等のウリ科植物；ダイズ等のマメ科植物；ワタ等のアオイ科植物；キク等のキク科植物；ポプラ等のヤナギ科植物；ブドウ等のブドウ科植物；バラ、リンゴ等のバラ科植物；ラン等のラン科植物；ユリ、チューリップ等のユリ科植物；などが挙げられる。

なお、放射線の照射後、カルスを誘導する前に、植物体の栽培又は植物組織片の培養を所定期間継続することが好ましい。放射線の照射からカルスの誘導までの期間は、例えば、３日間〜１０日間であってもよく、４日間〜６日間であってもよい。

次いで、カルス誘導工程では、照射工程後の植物体又は植物組織片からカルスを誘導する。カルスは、植物の根、葉、茎、芽、花、枝等から公知の方法によって誘導することができる。カルス誘導工程では、必要に応じて、公知のカルス誘導培地（ＣＩＭ）を用いてもよい。

カルス誘導工程の期間は、植物の種類、カルスを誘導する部位等の諸条件に応じて適宜設定することができる。

次いで、再分化工程では、カルスを培養して再分化させ、植物器官を形成させる。再分化工程における培養条件は特に制限されず、従来より採用されている培養条件と同様であってもよい。再分化工程では、必要に応じて、公知のシュート誘導培地（ＳＩＭ）や根誘導培地（ＲＩＭ）を用いてもよい。

本実施形態に係る植物器官形成効率向上方法では、カルス誘導前の植物体又は植物組織片に放射線を照射しているため、カルスから植物器官を効率的に形成させることができる。カルスから形成した植物器官は、必要に応じて所定の条件下でさらに培養して植物個体の状態としてもよい。

なお、以上の実施形態では、カルス誘導工程及び再分化工程を互いに独立した工程として説明したが、両者は明確に区別できないものであってもよい。例えば、培地中の植物ホルモンを適切に設定することにより、カルス誘導と再分化とを１段階の培養で実現することも可能である。

以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。

＜試験例１＞
シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）の種子を、１／２ＭＳ培地（１／２ＭＳ、１ｗ／ｖ％ スクロース、１ｗ／ｖ％ ゲランガム）を添加したプレートに播種し、４℃で１日間静置して春化処理を行った。その後、長日条件下（１６時間明期及び８時間暗期のサイクル）、２２℃で７日間培養することにより、シロイヌナズナを生育させた。７日間の生育後、プレートをガンマ線照射装置に入れ、シロイヌナズナの苗に４０Ｇｙ又は８０Ｇｙのγ線を照射した。γ線の照射後、長日条件下、２２℃で６日間培養することにより、シロイヌナズナの苗をさらに生育させた。比較のため、γ線を照射しない対照群も同様にして準備した。

次いで、根端から上部約１ｃｍをハサミで切り取り、根端部をカルス誘導培地（ＣＩＭ）に移し、長日条件下、２５℃で６日間培養することにより、カルスを誘導した。カルス誘導培地としては、３．３ｇ／Ｌ ガンボーグＢ５培地用混合塩類（Ｗａｋｏ）、２０ｇ／Ｌ グルコース、０．１ｖ／ｖ％ ガンボーグビタミン溶液（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｇ／Ｌ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、８ｇ／Ｌ ゲランガム、５００μｇ／Ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、５０μｇ／Ｌ カイネチンを含有するガンボーグＢ５培地を用い、ＫＯＨでｐＨ５．７に調節した。

次いで、誘導したカルスをシュート誘導培地（ＳＩＭ）に移し、長日条件下、２５℃で２１日間培養して再分化させることにより、シュートを形成させた。シュート誘導培地としては、３．３ｇ／Ｌ ガンボーグＢ５培地用混合塩類（Ｗａｋｏ）、１０ｇ／Ｌ グルコース、０．１ｖ／ｖ％ ガンボーグビタミン溶液（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｇ／Ｌ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、８ｇ／Ｌ ゲランガム、２ｍｇ／Ｌ ゼアチン、１ｍｇ／Ｌ Ｄ−ビオチン、４００μｇ／Ｌ インドール−３−酢酸を含有するガンボーグＢ５培地を用い、ＫＯＨでｐＨ５．７に調節した。

カルスからのシュート形成の状態を図１Ａに示す。また、カルス１個あたりのシュート数を図１Ｂに示す。有意差検定としてはＷｅｌｃｈのｔ検定を行った。図１Ｂに示すとおり、γ線の照射線量を８０Ｇｙとした場合、カルス１個あたりのシュート数が有意に増加した（^＊ｐ＜０．０５）。

＜試験例２＞
γ線の照射線量を２０Ｇｙ〜１００Ｇｙの範囲とし、かつ、シュート誘導培地（ＳＩＭ）での培養期間を１４日間としたほかは試験例１と同様にして、カルスからシュートを形成させた。カルス１個あたりのシュート数を図２に示す。図２中、異なるアルファベットが付されている場合、有意差があることを示す。有意差検定としてはＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定を行い、ｐ＜０．０５となる場合を有意とした。図２に示すとおり、γ線の照射線量が増加するに従ってカルス１個あたりのシュート数が増加し、照射線量を８０Ｇｙとした場合にシュート数が最大となった。

＜試験例３＞
γ線の照射線量を８０Ｇｙとし、かつ、カルス誘導培地（ＣＩＭ）での培養期間を３日間〜８日間としたほかは試験例２と同様にして、カルスからシュートを形成させた。カルス１個あたりのシュート数を図３に示す。図３に示すとおり、カルス誘導培地（ＣＩＭ）での培養期間を４日間〜８日間とした場合、カルス１個あたりのシュート数が有意に増加した（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１）。なお、カルス誘導培地（ＣＩＭ）での培養期間を３日間とした場合には、カルス１個あたりのシュート数に有意差が認められなかったが、これは脱分化が不十分であったためと推測される。

＜試験例４＞
野生型のシロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）以外に、ＤＮＡ損傷修復に関係する遺伝子（ａｔｒ遺伝子、ａｔｍ遺伝子、又はｓｏｇ１−１遺伝子）をノックアウトしたシロイヌナズナを用い、かつ、γ線の照射線量を４０Ｇｙとしたほかは試験例２と同様にして、カルスからシュートを形成させた。カルス１個あたりのシュート数を図４に示す。図４に示すとおり、ＤＮＡ損傷修復に関係する遺伝子をノックアウトしたシロイヌナズナを用いた場合であっても、γ線の照射により、カルス１個あたりのシュート数が増加した。この結果から、ＤＮＡ損傷修復は、γ線照射によるシュート形成効率向上に影響しないと推測される。

Claims (4)

1. カルスからの植物器官の形成効率を向上させる方法であって、
   植物体又は植物組織片に放射線を照射する照射工程と、
   前記照射工程後の植物体又は植物組織片からカルスを誘導するカルス誘導工程と、
   前記カルスを培養して再分化させる再分化工程と、を含む方法。
2. 前記放射線がγ線又はＸ線である請求項１に記載の方法。
3. 前記照射工程における前記放射線の照射線量が２０Ｇｙ〜１４０Ｇｙである請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記カルスが、植物の根、葉、茎、芽、花、又は枝から誘導される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。