KR101497774B1 - 형질전환 동안 ｂｂｍ의 유도를 통해 가임 식물을 제공하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 뉴클레오티드 시퀀스로 식물 세포 또는 식물 재료를 형질전환시키는 것을 포함하는, 트랜스제닉 식물을 제공하는 방법에 관한 것이고, 여기에 있어서 BBM 단백질의 활성은 형질전환된 식물 세포 또는 식물 재료의 형질전환 및/또는 재생 단계 동안 유도되고, 상기 식물 세포 또는 식물 재료는 다루기 힘든 식물로부터 유래된다. 추가적으로, 본 발명은 BBM 단백질을 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 그들의 재료에 관한 것이고 여기에 있어서 상기 트랜스제닉 식물은 다루기 힘든 식물이다.

Description

형질전환 동안 ＢＢＭ의 유도를 통해 가임 식물을 제공하는 방법{METHOD FOR PROVIDING FERTILE PLANTS VIA INDUCTION OF BBM DURING TRANSFORMATION}

본 발명은 성숙한 트랜스제닉 식물을 제공하는 방법에 관한 것으로서, 상기 식물은 다루기 힘든 식물이다. 본 발명은 추가적으로, 본 발명의 방법에 의하여 얻을 수 있는, 성숙한 트랜스제닉 식물, 식물 재료, 자손 (progeny), 식물의 일부, 종자 또는 그들의 클론에 관한 것이다. 본 발명은 또한 공동-형질전환 시스템으로서 본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는 성숙한 트랜스제닉 식물 또는 그 식물의 일부의 용도에 관한 것이다.

유전자 형질전환은 생명과학 분야에서 사용되는 방법론이고 많은 목적을 위하여 다양한 생물에서 사용되는 것이다. 이러한 기술은 생명과학 연구의 많은 분야에서 주요한 영향을 가진다. 상기 기술의 일 관점은 각각의 뉴클레오티드 분자 (예컨대, 유전자 요소 및/또는 유전자) 또는 그러한 뉴클레오티드 분자에 의해서 암호화되는 단백질의 기능을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 그 결과인, 유전적으로 변형된 생물은 기초 또는 응용 연구에서 이용될 수 있거나 또는 산업적으로 적용되어 이용될 수 있다.

유전자 형질전환은 그것이 관심 있는 뉴클레오티드 분자를 수신 식물 종으로 이동시키는 것을 가능하게 하기 때문에 식물 과학 분야에서 강력한 기술일 수 있다. 그러한 뉴클레오티드 분자는 단백질 기능성 유전자의 프로모터, 유전자, 종결자 (terminators), 억제자 (repressors) 또는 증폭자 (enhancers) 등등을 포함할 수 있다.

유전자 형질전환은 예를 들어 관심 있는 단백질의 수신 식물 (receiving plant)로의 추가에 따른 효과를 연구하기 위하여 이용될 수 있다. 그러한 경우에 있어서, 대개 더 큰 뉴클레오티드 분자의 일부인, 관심 있는 단백질을 암호화하는 유전자가 수신 식물로 도입된다.

유전적으로 변형된 식물을 얻기 위하여, 형질전환, 그에 뒤따르는 재생 및 그 다음의 형질전환 및 재생된 식물 재료를 성숙한 트랜스제닉 식물로 발달시키는 것을 포함하는 방법이 적용될 수 있다. 그러한 방법은 형질전환 및 재생 단계, 및 그 다음의 성숙한 트랜스제닉 식물로의 추가적인 발달 모두에 대하여 반응성을 가지는 특별한 식물 종에만 성공적으로 적용될 수 있다. 그러한 식물종은 예컨대 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 또는 브라시카 나푸스 (Brassica napus)를 포함한다.

형질전환 동안 관심 있는 뉴클레오티드 분자가 식물 세포로 도입된다. 재생 단계 동안, 형질전환된 식물 재료는 캘러스 (callus) 조직 같은 다소 정의되지 않은 구조로부터 잎-유사 구조 (leaf-like structures, LLS), 싹-유사 구조 (shoot-like structures, SLS) 또는 체세포배 (somatic embryos)와 같은 식물 기관으로 발달하는 것이 가능하게 되고, 이에 따라 성숙한 트랜스제닉 식물이 그로부터 얻어질 수 있다.

상기 형질전환 단계는 관심 있는 뉴클레오티드 분자를 가지는 Ti (종양-유도, Tumour-inducing) 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 박테리아와 식물 세포 또는 식물 재료를 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 상기 Ti 플라스미드는 아그로박데리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)에 의하여 숙주-식물로 이동되는 하나 이상의 DNA 분절; T-DNA 요소를 포함한다. 상기 T-DNA 요소 (T-DNA element)는 소위 좌측 보더 (left border) 및 우측 보더 (right border)로 불리는, 반복되는 DNA로 플랭킹 (flanking) 되어 있다. 유전공학은 관심 있는 뉴클레오티드 분자를 상기 Ti 플라스미드의 좌측 및 우측 T-DNA 보더 사이에 놓는 것을 가능하게 한다. 식물 세포 또는 식물 재료가 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 박테리아와 접촉하는 동안, 관심 있는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 하나 이상의 Ti 플라스미드 T-DNA 요소는 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 박테리아로부터 식물 세포로 이동되어, 그곳에서 핵의 게놈 또는 미토콘드리아 또는 엽록체와 같은 세포 소기관 게놈으로 안정적으로 통합된다. 형질전환의 다른 방법들 역시 식물 재료에 적용될 수 있다.

육안으로 보이는 관점에서 적절한 재생 단계를 고려하면, 식물 세포 또는 조직의 재생은 싹-유사 구조 (shoot-like structures, SLS) 또는 잎-유사 구조 (leaf-like structures, LLS)가 발달할 수 있는 세포의 무정형의 덩어리(예컨대, 캘러스)로 발달될 수 있다. 대개 만약 필요하다면, 적절한 식물 호르몬의 영향 아래에서 대개 그러한 구조로부터 신장된 줄기가 발달할 수 있다. 그 후에, 그러한 구조는, 만약 필요하다면, 하나 또는 그 이상의 적절한 뿌리-유도제의 영향 아래에서, 뿌리 시스템의 형성을 개시하여 추가적인 발달을 유지하는데 적절한 발전된 뿌리 시스템을 발달시킬 것이다. 그 다음에, 적절한 발전된 발달 단계의 식물 재료는 시험관 내로부터 시험관 외 환경으로 이식될 수 있다. 상기 식물은 그 후에 성숙한 트랜스제닉 식물을 얻을 수 있는 적절한 조건 하에서, 흙, 질석 (vermiculite), 암면 (rock wool) 또는 그와 유사한 것과 같은 시험관 외에서 성장한다. 상기 재생 과정은 이러한 일반적인 컨셉의 추가적인 또는 대안적인 스텝을 포함할 수 있다. 대안적으로, 재생은 성숙한 식물로 자랄 수 있는 체세포 배의 형성을 통해 진행될 수 있다.

형질전환 및 재생의 그러한 방법은 바람직하게는 출발 물질로서 어린 체세포 식물 조직, 원형질체 (protoplast)와 같은 배양된 세포 또는 기관에 적용된다. 어린 식물 조직의 이식체 또는 묘목 (seedlings) 유래의 식물 재료의 조각과 같은, 그러한 조직은 다양한 정도의 분화 또는 결정 (determination)을 가지는 세포를 포함한다. 그러한 조직은, 그러한 조직에 존재하는 다양한 수준 또는 정도의 분화를 가지는 세포의 이종 집단 때문일 것 같은, 재생 처리 초기 단계에 대하여 특히 반응성을 가진다.

오직 어떤 식물 또는 식물 종만 형질 전환 및 재생 방법에 대하여 반응성을 보였다. 그러한 식물을 형질전환하고 재생하기 위하여 기존 방법을 비교적 간단한 방식으로 적용하는 것이 가능했다. 반대로, 다른 식물 또는 식물 종은 그러한 형질전환 및 재생 방법에 대하여 반응성을 보이지 않는 것이 명백했다. 상기 식물은 적절한 방식에서 재생되지 않으며 및/또는 성숙한 식물로 전혀 재생될 수 없다. 그러한 식물, 식물 변이종 또는 식물 재배종은 "다루기 힘든 (recalcitrant)" 또는 "난재생성"이라고 불리운다.

어떠한 기본적인 분자적 또는 생리적인 인자가 원인이 되는지 또는 식물이 다루기 힘든지 아닌지를 결정하는 것은 대체로 알려져 있지 않다. 이것은 다양한 식물 종에 적용될 수 있는 믿을 만한 식물-특이적 형질전환 및 재생방법을 개발하기 위한 최근의 수요를 나타낸다. 사실, 성숙한 트랜스제닉 식물의 효율적인 공급을 위한 적절한 형질전환 및 재생 방법은 약간의 종 또는 재배종에 대하여만 개발되었다.

다루기 힘든 식물에 형질전환 및 재생 방법을 행하였고 이에 따라 성숙한 트랜스제닉 식물로 발달되었을 때, 과다한 다른 문제점들이 관찰되었고 대처할 수 없는 것으로 밝혀졌다. 그러한 문제점들은 사안의 식물 세포 또는 식물 재료로부터 식물 세포를 형질전환시키는 데 불능인 것을 포함한다. 또는 형질전환을 이룰 수 없는 상황에서, 그러한 형질전환된 재료는 성숙한 형질전환 식물로 발달될 수 없을 수 있다. 형질전환된 세포 또는 식물 재료는 특정 발달 단계까지 재생될 수 있고, 바뀌거나 잘못된 성장, 발달의 조숙한 종료, 심각하게 늦은 발달 또는 올바르지 않은 발달과 같은 잘못된 행동을 보인다. 아울러, 그릇된-양성 식물이 형성되는 것으로 알려져 있다. 그러한 비-형질전환된 식물 재료는 선택적인 약제의 작용에서 벗어날 수 있고 성숙한 식물로 재생될 수 있다.

더욱이, 상기 방법의 적용 가능성, 신뢰성 및 적합성 면에 대하여 다음의 문제점들이 알려져 있다: 재현성이 문제될 수 있고; 상기 방법의 결과를 예측할 수 없을 수 있으며, 싹, 뿌리 또는 묘목을 재생시키는 양이 너무 적어 산업적 적용에 적합하지 않을 수 있으며; 상기 방법은 단일한 식물 종 또는 주어진 식물 종의 재배종에서 특별한 그룹에만 적용될 수 있고; 상기 방법이 대규모 생산 또는 루틴한 적용에 부적절할 수 있으며; 적절한 적용가능성을 위하여 특정 박테리아 균주에 의존성일 수도 있다. 상기 방법들은 비용-효율적인 산업적 적용에 대하여 적절하지 않다. 이런 이유로, 다루기 힘든 식물 종에 적용될 수 있는 성숙한 트랜스제닉 식물의 제공에 대하여 효율적이고 신뢰성 있는 방법들이 필요로 하게 된다.

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따라서, 본 발명의 목적은 성숙한 트랜스제닉 식물을 얻는 방법을 제공하는 것이고, 여기에 있어서 상기 식물은 다루기 힘든 식물이고 상기 방법은 형질전환 단계 및 재생 단계를 포함한다. 더욱이, 본 발명의 목적은 본 발명의 방법에 의하여 얻어질 수 있는 트랜스제닉 식물을 제공하는 것이다.

다른 것 중에서 상기 목적은, 덧붙이는 청구항에서 정의된 방법에 의하여 제공된다.

구체적으로, 본 발명은 식물 세포 또는 식물 재료를 형질전환 및 재생하는 단계를 포함하는, 성숙한 트랜스제닉 식물을 제공하는 방법에 관한 것이고, 여기에 있어서 상기 식물 세포 또는 식물 재료는 BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 뉴클레오티드 분자로 형질전환되고, 여기에 있어서, 상기 BBM 단백질의 활성은 형질전환된 식물 세포 또는 식물 재료의 형질전환 및/또는 재생 단계 동안 유도되고, 상기 식물 세포 또는 식물 재료는 다루기 힘든 식물로부터 유래된다.

본 발명의 연구 기간 동안, 스위트 페퍼 (sweet pepper) 및 페튜니아 W138과 같은, 몇몇의 다루기 힘든 식물로부터 유래된 식물 재료는 형질전환 및 재생 단계 동안 BBM을 유도함에 따라 성숙한 트랜스제닉 식물로 재생되도록 할 수 있음을 발견하였던 반면, 상기 단계 동안 BBM의 유도가 없이 그러한 식물은 성숙한 트랜스제닉 식물로 발달되지 않았음을 발견하였다. 상기 기술 분야 및 본 명세서에서 다루기 힘든 식물들은, 그러한 식물로부터 유래된 식물 재료가 반응성 식물에 적절한 형질 전환 및 재생 단계의 과정에 투입될 때, 본질적으로, 성숙한 트랜스제닉 식물로 재생되지 않고 발달되지 않는 식물이다. 그러한 방법의 기본은 식물 호르몬 (phytohormones), 바람직하게는 옥신 (auxin), 사이토키닌 (cytokinin) 또는 지베렐린 산 (gibberellic acids), 또한 아브시스산 (abscisic acid), 에틸렌 또는 그들의 저해제를 포함하는 배지와 접촉하는 형질전환된 식물 재료는 반응성 있는 식물에 대한 경우에서처럼 형질전환된 식물 재료의 재생을 허락하는 것이다. 본 명세서에서, 다루기 힘든 식물은 그러한 어떤 조건 하에서도 성숙한 트랜스제닉 식물로 발달될 수 없는 식물이다.

특히 경제적으로 중요한 식물 종, 작물 또는 변이종에 속하는, 상당수의 다루기 힘든 식물은 재생 단계를 이용하여 성숙한 트랜스제닉 식물을 공급하기 위한 적절한 방법을 개발하는 목표를 가지는 광범위한 연구의 주제이었다. 스위트 페퍼 같은 다루기 힘든 식물을 성숙한 트랜스제닉 식물로 재생시킬 수 없는 점과 선행 기술의 방법을 이용하여 식물재료를 그러한 식물로부터 성숙한 트랜스제닉 식물로 형질전환하고 재생하는 것을 시도할 때 마주치는 많은 다른 문제점들이 결합되어 악명이 높다는 점을 고려하면 본 발명의 효율성은 놀라운 것이다.

본 발명의 장점은 피토크롬 (phytohormone) 또는 피토크롬의 효과를 모방하는 물질과 같은 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성제의 첨가에 의하여 목표하거나 또는 목표하지 않는, 다루기 힘든 식물 유래의 식물 세포 또는 식물 재료를 성숙한 트랜스제닉 식물로 명백하게 발달하도록 만들 수 있다는 것이다. 사용되었을 때, 트랜스제닉 식물 재료를 성숙한 트랜스제닉 식물로 발달시키기 위하여, 형질전환된 식물 재료를 가지고 배양되는 배지 상으로 그러한 생물학적 활성제가 추가될 수 있다. BBM의 활성이 유도되지 않았던 식물 세포 또는 식물 재료에 그러한 생물학적 활성제를 추가하는 것으로는, 그러한 식물 세포 또는 식물 재료가 성숙한 트랜스제닉 식물로 재생되지 않았다.

본 발명의 다른 장점은 형질전환 및/또는 재생 단계 동안 BBM 활성의 시기를 제어하는 가능성을 포함한다. BBM의 시기적인 활성의 조정은 추가적으로, 본 발명에 의하여, 다루기 힘든 식물로부터 얻어질 수 있는 성숙한 트랜스제닉 식물의 질 또는 양의 최적화를 더 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 추가적인 장점은 생식 발달 단계를 통해 형질전환된 식물 재료의 적절한 발달을 보장하는 가능성에 관한 것이다. 식물 발달의 생식 단계 동안 BBM 단백질의 부적절한 발현 및/또는 활성을 막음에 따라, 부분적인 또는 전체적인 불임과 관련된 문제점들을 피하거나 완화시킬 수 있다.

본 명세서에서 참고로서 다음의 도면들을 나타낸다 :
도 1은 다양한 식물 종 유래 BBM 단백질 (babyboom protein)의 계통수 (phylogenetic tree)를 보인다.
도 2는 캘러스가 형성되고 3주 후의 이식체를 보인다.
도 3은 캘러스 및 그 대조군의 SLS (shoot-like structure)형성을 보인다.
도 4는 35S::BBM:GR로 형질전환된 이식체 상의 SLS 상에서 체세포배 형성을 보인다.
도 5는 신장된 줄기를 보인다.
도 6은 고정되어 싹 (rooted shoot)를 보인다.
도 7은 트랜스제닉 붉은 블로키 유형 (transgenic red blocky type)을 보인다.
도 8은 트랜스제닉 노란 블로키 유형 (transgenic yellow blocky type)을 보인다.
도 9는 트랜스제닉 식물의 종자를 보인다.
도 10은 Km 을 포함하는 배지 상에서 자손을 분리하는 것을 보인다.
도 11은 분리한 트랜스제닉 식물의 표현형을 보인다. 위쪽 열은 Km 저항성 묘목을 보이는 것이고, 아래쪽 열은 Km 민감성 묘목을 보인다.
도 12는 대조군 또는 35S::BBM:GR 중 어느 하나로 형질전환된 떡잎 이식체의 캘러스, 싹-유사 구조 (shoot-like structure (SLS)) 및 싹 형성의 백분율을 보인다.
도 13은 트랜스제닉 페퍼 식물 상에서 수행된 PCR 결과의 겔을 나타낸다. 레인 (Lane): M, 분자의 마커 (molecular marker); P, 35S::BBM:GR 플라스미드 DNA; A, 비-트랜스제닉 아라비돕시스 (Arabidopsis); A+, 트랜스제닉 아라비돕시스; C, 비-형질전환 페퍼; Cl-4 독립적인 트랜스제닉 스위트 페퍼; C5-8 동일한 이식체로부터 얻은 트랜스제닉 페퍼 싹.
도 14는 W138 배경의 트랜스제닉 페튜니아의 싹 재생을 보인다.
도 15는 W138 배경의 트랜스제닉 페튜니아의 싹 재생을 보인다.
도 16은 서열번호 1을 보인다.
도 17은 서열번호 2를 보인다.
도 18은 서열번호 3을 보인다.
도 19는 핵 전사의 베이비붐 활성이 유도된 후에, 스위트 페퍼 트랜스제닉 라인을 포함하는 35S::BBM::GR의 Tl 자손의 상처입은 부위의 가장자리에서 체세포배가 형성되는 것을 보인다.

본 명세서에서 재생은 형질전환된 식물 세포가 체세포배, 잎-유사 구조 또는 싹-유사 구조로 발달하는 것을 포함한다. 그 다음 단계에서 그러한 식물 조직들은 성숙한 트랜스제닉 식물로 더 발달할 수 있다.

본 발명은 따라서 형질전환 및 재생 단계 동안 BBM을 활성화시킴에 의하여 다루기 힘든 식물로부터 얻어지는 식물 재료 유래의 성숙한 트랜스제닉 식물을 효율적으로 얻는 것을 최초로 가능하게 한다. 본 명세서에서 BBM의 활성을 가지는 것은 형질전환된 BBM의 발현이 형질전환된 숙주 식물 유전자의 전사 상에 미치는 영향을 뜻한다. BBM이 전사 인자이기 때문에, 그의 활성은 하나 또는 그 이상의 BBM 타겟팅 유전자의 전사에 영향을 미치는 것을 포함한다. BBM의 활성은 BBM이 유도 시에 핵으로 국소화 (nuclear localized) 되는 것을 가능하게 함에 따라, 뿐만 아니라 그것의 전사 또는 해석을 유도함에 따라, 수행될 수 있다. BBM의 활성은 BBM이 조절 뉴클레오티드 및/또는 단백질 시퀀스에 직접적으로 또는 간접적으로 결합함에 따라 그것의 타겟팅 유전자의 전사를 유도 또는 억제를 유발한다는 개념이 가능하다. BBM 활성의 기본 메커니즘과 무관하게, 발현 구조체 (expression construct)로부터 발현된 BBM 단백질의 유도된 활성에 대한 결과는, 형질전환 및 재생 단계의 대상인 다루기 힘든 식물로부터 유래된 식물재료가 성숙한 트랜스제닉 식물로 발달될 수 있다는 것이다.

본 명세서에서 “성숙한 트랜스제닉 식물 (mature transgenic plant)”은 상기 식물이 하나 이상의 생식 기관, 바람직하게는 열매를 포함하는 종자와 같은 그러한 기관들 이상을 생산하도록 발달의 발전된 단계에 도달한 식물을 뜻하고, 여기에 있어서, 그러한 생식 기관으로부터 독자 생존 가능한 자손가 얻어질 수 있다. 본 명세서에서 용어 “성숙한 식물”은 용어 “가임 식물”과 교체 가능하다. 그러한 생식 기관은 꽃과 같은 성적인 생식기관 또는 덩이줄기 (tuber), 기는 줄기 (stolon), 뿌리줄기 (rhizome), 알줄기 (corm), 살눈 (bulbil) 또는 알뿌리 (bulb)와 같은 식물의 생식 기관일 수 있다. 특히 관심있는 것은 본 명세서에서 기재한 것처럼 생식 기관으로부터 얻어질 수 있는 독자 생존 가능한 자손로부터 본 발명에 따라 얻어질 수 있는 성숙한 트랜스제닉 식물이다.

본 명세서에서 꽃은 예컨대 하나 이상의 남성 생식 기관 (수술군, androecium) 또는 하나 이상의 여성 생식 기관 (암술군, gynoecium) 중 어느 하나를 가지는 단성이거나; 또는 본 명세서에서 꽃은 예를 들면, 하나 이상의 남성 생식 기관 및 하나 이상의 여성 생식 기관을 가지는 양성일 수 있다.

본 명세서에서 꽃은 바람직하게는 가임이지만, 그러나 또한 기능성 난세포 또는 기능성 꽃가루 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 가임인 꽃의 경우에 있어서, 그러한 꽃은 기능성 꽃가루 및 하나 또는 그 이상의 난세포를 가지고, 이것은 그 다음에 독자 생존 가능한 자손을 가져올 수 있다. 기능성 꽃가루 및 하나 또는 그 이상의 기능성 난세포를 가지는 꽃은 자가 수정 (self-fertilization) 또는 타가수정 (cross-fertilization)에 의하여 하나 또는 그 이상의 종자를 생산할 수 있다. 기능성 난세포 또는 기능성 꽃가루 중 어느 하나를 포함하는 꽃의 경우에 있어서, 그러한 꽃은 자가수정으로부터 종자를 생산하지 않지만, 타가 수정으로부터 종자를 생산할 수 있다. 그러한 꽃은 따라서 수 불임 (male-sterile) 또는 암 불임 (female-sterile)일 수 있다. 그러나, 수 불임 꽃은 다른 꽃으로부터의 기능성 꽃가루에 의하여 가임될 수 있다. 수 불임 꽃의 꽃가루는 다른 꽃을 가임시키는데 이용될 수 있다. 그러한 꽃에서 상기의 수 불임은 세포질성 수 불임 (cytoplasmic male sterility), 포자체적 자가 불화합성 (sporophytic self-incompatibility), 배우체적 자가 불화합성 (gametophytic self-incompatibility) 또는 다른 불임 시스템의 결과일 수 있다. 상기 생물학적 용어들은 그들의 기술 분야에서 인식된 의미로 사용된다.

아울러 성숙한 트랜스제닉 식물이 얻어질 수 있었던 1차 형질전환된 식물 재료로부터 이식체를 얻는 것이 가능할 것으로 생각된다. 1차 형질전환체의 이식체로부터 얻어진 성숙한 트랜스제닉 식물은, 본 발명에 따른 성숙한 트랜스제닉 식물의 의미 및 본 발명의 상기 방법에 따라 직접적으로 얻어지는 생산물을 포함된다.

본 명세서에서 상기 용어 “식물 세포”는 식물 또는 식물 재료로부터 얻어진 어떤 세포를 의미한다. 또한 액상 서스펜션 또는 그와 유사한 것으로부터 얻어진 어떤 세포 또는 원형질체를 의미한다.

본 명세서에서 상기 용어 “식물 재료”는 식물 유래의 어떤 구조, 조직 또는 기관으로부터 얻어진 어떠한 이식체, 조각 또는 커팅을 의미한다. 본 명세서에서 식물 재료는 또한 식물의 어떠한 조직 또는 기관을 의미할 수 있다. 상기 이식체, 조각 또는 커팅의 기원인 상기 식물의 조직 또는 기관은 떡잎 (cotyledon), 하배축 (hypocotyl), 상배축 (epicotyl), 종자 (seed), 캘러스 (callus), 잎 (leaf), 뿌리 (root), 싹 (shoot), 꽃 (flower), 꽃밥 (anther), 꽃가루 (pollen), 밑씨 (ovule), 난세포 (egg cell), 열매 (fruit), 분열 조직 (meristem), 원기 (primordium), 꽃송이 (inflorescence), 잎자루 (petiole), 원형질체 (protoplast), 수용 조직 (sink tissue), 공급 조직 (source tissue), 묘목 (seedling), 수용 기관 (sink organ), 공급 기관 (source organ), 덩이줄기 (tuber), 접합자배 (zygotic embryo), 체세포배 (somatic embryo) 또는 반수체의 2중 반수체 (doubled haploids)로부터 얻어진 배 (embryos)를 포함하는 것으로부터 얻어진다. 아울러 본 관점에서 단일 세포 배양, 서스펜션, 안드로겐 배양, 자성 배양 (gynogenic cultures)과 같은 세포 배양을 포함한다. 구체적으로, 상기 용어 식물 재료는 떡잎 또는 그의 조각과 같은 묘목-유래 조직에 관한 것이다.

본 명세서에서 상기 용어 “형질전환”은 발현 벡터 또는 구조체와 같은 뉴클레오티드 분자를 수신 식물 세포로 도입하는 방법에 관한 것이다. 상기 형질전환 과정은 프로모터, 증폭자, 종결자 또는 그와 유사한 것과 같은 다른 유전적 요소 또는 유전자 또는 단백질의 기능성을 설명하는데 사용될 수 있다. 상기 뉴클레오티드 분자는 바람직하게는 식물 또는 식물로부터 얻어진 뉴클레오티드 시퀀스에 기초하여 얻어진다. 상기 뉴클레오티드 분자는 또한 합성의 기원을 가질 수 있다. 상기 뉴클레오티드 분자는 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) (예시로서 Bent, 2000를 보라) 또는 식물 형질전환에 적합한 다른 박테리아 (예시로서 Broothaerts et al . , 2005를 보라)와 같은 박테리아 벡터를 이용하여 식물 세포에 도입될 수 있다. 상기 형질전환 과정은 또한 유전자총 (particle bombardment), 기계적인 주입 또는 본 발명의 이용에 적합한 다른 형질전환 테크닉을 포함할 수 있다. 그러한 테크닉은 당업자에게 매우 잘 알려져 있고 본 발명을 수행하기 위하여 별도의 수행없이 적용될 수 있다.

본 발명의 다른 관점은 솔라늄 (Solanum), 페튜니아 (Petunia), 튤리파 (Tulipa), 릴리움 (Lilium), 크로커스 (Crocus), 아이리스 (Iris), 글라디올루스 (Gladiolus), 스피나시아 (Spinacia), 베타 (Beta), 체노포디움 (Chenopodium), 파제올루스 (Phaseolus), 피섬 (Pisum) 및 캡시컴 (Capsicum) 속으로 구성된 군에서 선택되는, 구체적으로 솔라나세 (Solanaceae)과에서 유래된 식물로부터 선택되는 식물 세포 또는 식물 재료에 관한 것이다. 본 발명은 조금 더 구체적으로 솔라늄 투베로섬 (Solanum tuberosum), 페튜니아 하이브리다 (Petunia hybrida), 튤리파 아종 (Tulipa spp), 릴리움 아종 (Lilium ssp), 크로커스 아종 (Crocus ssp), 아이리스 아종 (Iris ssp), 글라디올루스 아종 (Gladiolus ssp), 스피나시아 올레라세아 (Spinacea oleracea), 베타 불가리스 (Beta vulgaris), 체노포디움 퀴노아 (Chenopodium quinoa), 파제올루스 불가리스 (Phaseolus vulgaris), 파제올루스 코시네우스 (Phaseolus coccineus), 피섬 사티붐 (Pisum sativum) 및 캡시컴 아늄 (Capsicum annuum) 종에 관한 것이고, 더 구체적으로는 파프리카 캡시컴 아늄 (Capsicum annuum) 식물에 관한 것이다. 이러한 식물 종 및 또는 몇몇 식물 종의 몇몇의 재배종, 변이종 또는 유형은 매우 다루기 어렵고 성숙한 트랜스제닉 식물로 형질전환 및/또는 재생시키는 것이 어려운 것으로 악명높다.

본 발명은 구체적으로 다루기 힘든 감자 솔라늄 투베로섬 (Solanum tuberosum) 유형 또는 그 변이종, W138과 같은 페튜니아 {페튜니아 하이브리다, Petunia hybrida) 유형 또는 그 변이 또는 스위트 페퍼 (캡시컴 아늄, Capsicum annuum) 유형 또는 변이종에 관한 것이고 더 구체적으로는 적어도 스위트 페퍼의 경우에 있어서, 당업자에게 매우 다루기 어려운 것으로 생각되고 알려져 있다.

상기 캡시컴 아늄 (Capsicum annuum) 종은 열매의 맛에 기초하여 두 그룹, 즉, 달콤한 (또는 순한 ) 페퍼 유형 및 맵고 (또는 칠리맛의) 페퍼 유형으로 나누어졌다. 달콤한 맛의 페퍼 유형의 그룹은 맵지 않고, 달콤한 열매를 맺는 페퍼 식물을 포함한다. 상기 열매의 조금 더 증진된 성숙도 레벨에서, 상기 열매는 열매 내에 캡사이신 (capsaicin) (8-메틸-N-바닐릴-6-노넨아마이드, 8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide)을 낮은 수준으로 가진다. 상기 달콤한 맛의 페퍼 그룹은 본 명세서에서 블로키 (blocky), 벨 (bell), 라무요 (lamuyo), 파프리카 (paprika), 헝가리 파프리카 (Hungarian paprika), 뉴멕시칸 파프리카 (New Mexican paprika), 스퀴시 고추 (squash pepper), 스패니쉬 파프리카 (Spanish paprika), 피미엔시오 (pimientio), 이탈리안 프라잉 (Italian frying), 일본의 달콤한, 비죠 아루가 둘체 (Viejo arruga dulce) 및 쿠바 변이종 (Cuban varieties) (De Witt & Bosland, 1997)을 포함한다.

스위트 페퍼는 매우 다루기 어려운 캡시컴 아늄 (Capsicum annuum)으로 여겨진다. 스위트 페퍼 식물이 형질전환 및 재생 단계를 포함하는 방법으로 얻어질 때, 하기 관찰이 보고되었다: 캘리 (calli) 유래의 잎 원기 (leaf primordia) 형성의 부재; 상기 재생 단계를 통해 진행하는 잎-유사 구조의 불능; 재생 조직에서 싹의 부재; 싹의 눈 신장의 실패; 싹의 눈으로부터 싹-유사 테라토마의 발달; 정단 분열조직의 신장 실패; 재생 싹의 감소된 정아 우성 (apical dominance); 선택적인 압력 하에서 성장한 캘리 유래의 비-트랜스제닉 싹의 재생; 재생 싹의 감소된 생식력, 트랜스제닉 싹으로부터 발달되기 위한 적절한 뿌리 시스템의 불능 또는 식물 조직 또는 기관의 심각하게 지체된 성장. 또한 긍정 오류 (false-positive) 식물의 발생, 즉, 선택적인 압력 하에서 식물 성장을 가능하게 하는데 필요한 저항 부여 유전자를 포함하지 않는 식물의 발생이 알려져 있다. 그러므로 선행기술이 성숙한 트랜스제닉 스위트 페퍼 식물의 공급에 대하여 적절하고 효율적이거나 신뢰성 있는 방법을 제공하지 않았다는 것을 언급할 수 있다. 본 발명은 성숙한 트랜스제닉 스위트 페퍼 식물을 얻는 방법을 제공하는 장점을 가진다.

본 발명에 따른 방법의 적용은 성숙한 트랜스제닉 스위트 페퍼 식물의 공급을 가져왔고, 구체적으로 이러한 식물 유래의 완전히 발달된 페퍼 열매 및 독자 생존 가능한 종자의 공급 또한 가져왔다. 더욱이, 본 발명은 외인성의 BBM 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 싹 틔운 묘목의 공급을 위하여 이용될 수 있다. 자가수정된 성숙한 트랜스제닉 식물의 분리 분석은 전이 유전자가 다음 세대의 자손에 의하여 물려받는 것을 보여주었다. 몇몇 성숙한 트랜스제닉 식물의 자손의 멘델 분리 (Mendelian segregation)는 단일한 위치의 존재에 대응하였다. 표 4는 분리 분석 결과를 보여준다. 본 발명은 따라서 형질전환된 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 독자 생존 가능한 자손을 생산하는 성숙한 트랜스제닉 스위트 페퍼 식물을 제공하였다.

본 발명의 방법에 의하여 얻어지는 트랜스제닉 스위트 페퍼 종자는 NCIMB 41732로 기탁되었다.

본 발명의 다른 관점은 BBM 단백질 또는 그의 기능적인 동족체 (homolog)에 관한 것으로, 이것은 서열번호 1에 대하여 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지고 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 가짐에 따라 특징되거나 또는 상기 BBM 단백질이 서열번호 1인 것에 의하여 특징된다. 단백질이 BBM 동족체인지 아닌지는 관심있는 단백질이 서열번호 1의 BBM 단백질 보다, BBM 타겟팅 유전자의 프로모터에 연결되는 리포터 유전자의 유사한 발현을 초래하는지 아닌지를 평가함에 따라 밝혀질 수 있다. 그러한 타겟팅 유전자는, 예를 들면, 액틴 해중합 인자 9 (Actin Depolymerizing Factor 9 (ADF9; 유전자ID : 829649, TAIR: AT4G34970))를 포함한다.

대안적으로, 후보 유전자는 발현 벡터가 상기 BBM 후보 단백질의 유도성 핵 전사 활성을 제공하는 상기 후보 BBM 단백질을 암호화하는 발현 벡터를 이용하여 스위트 페퍼 식물로 형질전환될 수 있다. 스위트 페퍼 식물로부터 식물 세포로의 형질전환시에, 대상의 식물 재료가 하나 또는 그 이상의 성숙한 트랜스제닉 식물로 본 발명에 따라 발달될 것이다. 유전자 또는 단백질이 본 발명에 따른 BBM의 기능성 동족체인지 아닌지를 확고히 하는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 초기 탐구에서, 당업자는 현대의 전기적인 분자 생물학적 도구 및 NCBI(http : //www . ncbi . nIm . nih . gov / ) 또는 그러한 다른 기관에 의하여 제공되는 데이터베이스를 찾아볼 수 있었다. 그러한 도구 및 데이터베이스는 만약 어떤 알려지지 않은 유전자 또는 단백질이 기능성 BBM 동족체일 수 있는지 아닌지에 대한 지시가 있다면, 당업자에게 그러한 의미에 대하여 빠른 접근을 제공한다. 그러한 지시는 관련된 계통군 (clade) 또는 동일한 계통군에서 진화적인 보존 및 분류에 대한 BBM의 관계에서 알려지지 않은 시퀀스 정보; 알려지지 않은 시퀀스가 ANT, PLTl, PLT2를 포함하는 AP2 과와 같은, 유전자 또는 단백질의 BBM 관련 클래스에 속하는지 아닌지; AP2 도메인과 같은 특별한 도메인의 공유; 그러한 공유 도메인, 단일 또는 반복된 AP2 도메인의 수; BBM-유사라고 불리는 시퀀스와 같은 유전자 또는 단백질의 명명법을 포함할 수 있다. 그 결과, 두 번째 조사 단계에서 유전자 또는 단백질의 제한된 수에 대해서만, 관심있는 시퀀스가 기능성 BBM 동족체인지 아닌지를 확인하기 위하여, 다루기 힘든 식물, 즉 구체적으로 스위트 페퍼로 형질전환될 필요가 있을 것이다. 그러므로 이어지는 다음 단계에서, 현대의 생명공학 분야의 당업자는 유전자 또는 단백질이 기능성 BBM 동족체일 수 있었는지 아닌지에 대하여, 과도한 부담을 가지지 않고 확인할 수 있다.

본 명세서에서 상기 용어 "시퀀스 동일성 (sequence identity)"은 서열번호 1에 따른 BBM 단백질의 전체 길이에 걸쳐 동일한 아미노산의 수로서 정의되고, 전체 길이의 아미노산 수로 나뉘고 100을 곱한 것이다. 예를 들면, 다음 식 : 521/579 * 100 = 90%에 의하여 예로 든 것처럼, 서열번호 1과 90% 동일성을 가지는 시퀀스는 서열번호 1의 579개의 아미노산 전체 시퀀스 상에서 521개의 동일한 아미노산을 포함한다.

BBM은 브라시카 나푸스 (Brassica napus), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 메디카고 트렁큐라타 (Medicago trunculata), 글라이신 맥스 (Glycine max), 지 메이스 (Zea mays) 같은, 다양한 종의 변이종에 걸쳐 보존되어 있다. 본 출원에 기재한 바와 같이, 형질전환 및 재생 단계를 포함하는 방법에 의해서 별개이고 먼 친척관계인 솔라나세 (Solanaceae) 과 유래의 성숙한 트랜스제닉 식물을 얻기 위하여, 크루시퍼스 (Crucifers) (또는 브라시카세 (Brassicaceae)) 분류군 (taxon)으로부터 얻어진 식물 유래의 BBM 유전자를 사용하는 것이 가능하다. 진화적인 보존 수준으로 인해 아마도, 이러한 단백질은 다른 다루기 힘든 식물 종, 솔라나세 (Solanaceae)까지, 또는 모노코트 (monocots)에서 다이코트 (dicots)에 이르기까지 상기 방법을 적용할 수 있을 것이다.

gi 넘버	식물 종
gi: 21069055	브라시카 나푸스 (Brassica napus)
gi: 21069053	브라시카 나푸스 (Brassica napus)
gi: 58761187	메디카고 트렁큐라타 (Medicago trunculata)
gi: 21069057	아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) Col 0
gi: 151936654	아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) C 24
gi: 46451393	아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)
gi: 9755766	아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)
gi: 195615496	지 메이스 (Zea mays)
gi: 195612040	지 메이스 (Zea mays)
gi: 21304277	오리자 사티바 (Oryza sativa)
gi: 189170271	페니세튬 스투무라튬 (Pennisetum squamulatum)
gi: 189170265	페니세튬 스투무라튬 (Pennisetum squamulatum)
gi: 180170267	켄크러스 실리아리스 (Cenchrus ciliaris)
gi: 189170269	켄크러스 실리아리스 (Cenchrus ciliaris)

표 1: 서열번호 1의 BBM과 비슷한 다양한 식물 종 단백질의 GI 넘버 (유전자 정보 식별자, Genlnfo identifier).

그러나 본 발명의 다른 관점은 전사 활성자, 번역 활성자 또는 핵 타겟팅 시스템으로 구성된 군에서 선택된 유전자 요소 (genetic elements)에 작동 가능하게 연결된 BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스에 관한 것이다. 그러한 유전자 요소는 상기 BBM 단백질의 적절한 공간적 및/또는 시간적 활성이 가능하도록 BBM 단백질의 활성을 조절하는 것을 가능하게 한다. 본 명세서에서 공간적인 활성은 기관 또는 조직 특이적 BBM 활성을 얻을 수 있다는 것을 의미한다. 그러한 유전자 요소를 이용하는 장점은 BBM 단백질의 부적절한 발현 또는 활성과 관련된 문제의 발생을 막을 수 있다는 데 있다.

바람직한 실시예에서, BBM 단백질은 핵 타겟팅 시스템 (nuclear targeting system)에 작동 가능하게 연결되어 있다. 이러한 실시예에서, 핵으로 이동시키거나 전위시키기 위하여 번역상 연결된 상기 BBM ::GR을 초래함에 따라 BBM의 활성을 제어하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 유전자 요소가 전사 활성자일 때, 전사 레벨 상에서 BBM의 활성을 조절하는 것이 가능하다. 그러한 전사 유도 시스템은 에탄올 유도 프로모터 (ethanol inducible promoter) 또는 열-충격 유도 프로모터 (heat-shock inducible promoter)를 포함하는 시스템일 수 있다. 5'UTR 또는 3'UTR 시퀀스에 위치할 수 있었던 번역 활성자는 번역을 제어함에 따라 BBM 활성을 조절하는데 이용될 수 있다. 어떤 시스템이 상기 언급한 유전자 요소에 의하여 BBM 활성을 유도하는데 이용될 수 있는지 하는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 적절한 시스템은 에스트로겐 유도 시스템 (oestrogen inducible system), PRP 유도 시스템 (PRP inducible system), UAS 유도 시스템, 시스템을 포함하는 어떤 VP16도 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 서열번호 2로 특징되는 뉴클레오티드 시퀀스에 작동 가능하게 연결된 BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스가 있다. 이러한 뉴클레오티드 시퀀스에 의하여 암호화되는 펩타이드는 식물 재료가 덱사메타손 (dexamethasone, DEX)을 포함하는 배지와 접촉될 때, BBM 단백질의 활성이 유도되는 것을 허용한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 재생하는 형질전환된 식물 세포 또는 식물 재료는 BBM 단백질의 활성을 유도하는데 적절한 약제 (agent)를 포함하는 배지와 접촉한다.

그러나 본 발명의 다른 실시예에서 에탄올은 BBM 단백질의 활성을 유도하는데 적절한 약제이다. 이러한 실시예에서, 에탄올은 외인성 BBM 유전자의 전사를 유도하는데 사용될 수 있다. 전사의 유도를 위한 다른 시스템은 또한 본 발명을 수행하는데 적절하다. BBM의 활성은 또한 본 발명을 수행하기 위하여, 번역 또는 전사 후 레벨과 같은 다른 레벨 상에서 조절될 수 있었다.

본 관점의 실시예에 따르면, 상기 발현 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택 마커, 하나 또는 그 이상의 관심있는 단백질 및/또는 하나 또는 그 이상의 관심있는 전사물을 더 암호화한다. 관심있는 그러한 단백질은 관심있는 어떠한 병원체에 대하여 저항성을 제공하는 어떤 단백질을 포함하고, 뿐만 아니라 비타민, 영양소, 당 및 그와 유사한 것을 생산하는 경로의 일부분인 단백질 또한 포함한다.

추가적으로 본 발명은 상기 언급한 방법에 의하여 얻을 수 있는, BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스 및 BBM 단백질의 활성 유도를 허용하는데 적절한 유전자 요소를 포함하는 외인성 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 성숙한 트랜스제닉 식물 또는 그의 재료에 관한 것이고, 여기에 있어서 상기 성숙한 트랜스제닉 식물은 다루기 힘든 식물이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 성숙한 트랜스제닉 식물은 솔라늄 (Solanum), 페튜니아 (Petunia), 튤리파 (Tulipa), 릴리움 (Lilium), 크로커스 (Crocus), 아이리스 (Iris), 글라디올루스 (Gladiolus), 스피나시아 (Spinacia), 베타 (Beta), 체노포디움 (Chenopodium), 파제올루스 (Phaseolus), 피섬 (Pisum) 및 캡시컴 (Capsicum) 속으로 구성된 군에서 선택되는 식물이고, 구체적으로 솔라나세 (Solanaceae) 유래 식물이다.

본 발명의 더 바람직한 실시예에서 성숙한 트랜스제닉 식물은 스위트 페퍼 캡시컴 아늄 (Capsicum annuum) 식물이다.

본 발명에 따른 성숙한 트랜스제닉 식물은 외인성 BBM 단백질 또는 이것은 서열번호 1에 대하여 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상의 동일성, 바람직하게는 80% 이상의 동일성, 더 바람직하게는 90%이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지고 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 가짐에 따라 특징되는 기능성 동족체를 포함하거나 또는 상기 외인성 BBM 단백질은 서열번호 1이다. 바람직하게, 상기 성숙한 트랜스제닉 식물은 그것의 게놈에서 본 발명에 따라 BBM 단백질을 코딩하는 외인성 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.

본 명세서에서 외인성 뉴클레오티드 시퀀스는 형질전환 같은, 생명공학적 과정을 통해서 식물 재료에 도입된 뉴클레오티드 시퀀스이다. 외인성 단백질은 상기 외인성 뉴클레오티드 시퀀스로부터 암호화되는 단백질이다.

그러나 본 발명의 다른 실시예에서는 전사 활성자, 번역 활성자 또는 바람직하게는 핵 타겟팅 시스템으로 구성된 군에서 선택되는 외인성 BBM 단백질의 활성을 유도하는 것을 허락하는데 적절한 유전자 요소가 있다.

본 발명의 장점은 공간적 및 시간적 방식 모두에 있어서, BBM 단백질의 적절한 활성 또는 발현을 허용하기 위하여, 외인성 BBM 단백질의 활성이 유도될 수 있다는 것이다. 형질전환 및/또는 재생 단계 동안 외인성 BBM 활성을 유도하는 가능성뿐만 아니라, 외인성 BBM 활성이 부정적이고 불리한 효과를 보였던 발달 단계 동안, 외인성 BBM 활성이 줄어들거나 없을 수 있다는 것은 매우 장점이 되는 것으로 보인다. 외인성 BBM의 공간적인 활성은 조직-특이적 프로모터를 이용하여 제어될 수 있었다. 예를 들면, 식물 발달의 생식 단계 동안 활성이 아닌 프로모터의 이용은, 불임 관련 문제점들을 막을 수 있었다. 묘목의 성장 및 발달 단계동안 활성인 프로모터의 이용은 형질전환된 식물 재료의 재생 단계 동안 바람직할 수 있었다.

본 발명에 따른 유전자 요소는 외인성 BBM의 적절한 활성을 허용하는 외인성 BBM 유전자로 작동 가능하게 연결된다. 적절한 요소들은 어떤 열 충격 유도 시스템 (heat-shock inducible system), 에탄올 유도 시스템 (ethanol inducible system), 에스트로겐 유도 시스템 (oestrogen inducible system), PRP 유도 시스템 (PRP inducible system), UAS 유도 시스템 (UAS inducible system), 어떤 VP16 포함 시스템을 포함한다. 어떤 다른 적절한 시스템이 본 발명을 수행하는데 이용될 수 있고 그러한 시스템을 생산하기 위하여 어떤 생명공학적 방법이 이용될 수 있는지 하는 것은 당업자에게 자명하다.

게다가 우성 억제자 (dominant repressor), 우성 활성자 (dominant activator), 안티센스 구조체 (antisense construct), RNAi 구조체 (RNAi construct), siRNA 구조체, 녹-아웃 (knock-out)의 이용에 기초한 방법들 또는 BBM 활성에 영향을 미치는 동일한 효과로 분류되는 다른 방법들에 의해 본 발명에 따른 BBM 활성 제어가 가능한 것으로 생각된다.

본 발명의 바람직한 실시예는 서열번호 2에 의하여 특징되는 상기 BBM 단백질의 활성 유도를 허용하는데 적절한 유전자 요소에 관한 것이다. 이러한 유전자 요소는 BBM 단백질에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 이것은 번역적인 융합 (translational fusion)을 초래한다. 그러한 작동 가능한 연결은 BBM 단백질이 트랜스제닉 세포의 핵에 위치하도록 만들며, 이를 통해 BBM 단백질의 유도가 가능하다. 이러한 실시예에서, 외인성 BBM의 활성은 식물 재료가 덱사메타손을 포함하는 배지에서 접촉될 때, BBM 단백질의 활성이 유도되도록 하는 서열번호 2에 의하여 암호화되는 펩티드에 의해 매개된다.

더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 성숙한 트랜스제닉 식물의 자손, 식물 부분, 종자 또는 클론에 관한 것이다. 본 발명의 장점은 자손이 본 발명에 따른 성숙한 트랜스제닉 식물로부터 얻어질 수 있다는 것이다. 그러한 자손은 예를 들면 조직 또는 기관으로부터 무성 번식 (a-sexual propagation)에 의하여 성숙한 트랜스제닉 식물로부터 얻어질 수 있다. 그러한 경우에 있어서, 자손은 세포, 조직, 기관 또는 다른 적절한 식물 부분을 번식하는 적절한 방법에 따라 얻어질 수 있다. 그러한 방법은 다양한 방법에 의한 식물 재료의 클로닝, 접붙이기 (grafting), 잎 커팅의 번식, 커팅들의 루팅 또는 다른 적절한 방법을 포함할 수 있다. 번식 방법은 또한 자손을 얻기 위한 생식세포 (gamete)의 준비에 기반한 기술을 포함할 수 있다. 그러한 기술은 자성생식 (gynogenesis) 또는 웅성 생식 (androgenesis)에 의한 2중 반수체 자손의 생산을 포함한다. 아울러 자손을 얻기 위하여 구상된 것은 식물 조직 배양 또는 식물 세포 배양을 포함하는 적절한 방법들이다.

또한 본 발명에 따라서 BBM 유전자가 BBM을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 식물 세포의 게놈으로부터 절단, 재조합 또는 결실되도록 하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 유전자 구조로 클로닝됨에 의하여 본 발명을 수행하는 것이 가능한 것으로 고려된다. 그러한 시스템은 예를 들면, Cre-Lox 시스템, FLP/FRT 시스템을 포함할 뿐 아니라, 또한 다른 적절한 재조합 시스템을 포함할 수 있다.

트랜스제닉 및/또는 비-트랜스제닉 자손이 본 발명에 따른 성숙한 트랜스제닉 식물로부터 얻어질 수 있다는 것이 더 주목되었다. 그러한 자손은 멘델 법칙에 따르는 전이 유전자의 분리를 허락하는 성숙한 식물을 타가 수정하거나 또는 자가 수정함에 따라 얻어질 수 있다. 비-트랜스제닉 자손은 상기 전이 유전자에 대하여 이형접합자 ( heterozygous)인 성숙한 트랜스제닉 식물의 자가 수정에 따라 얻어질 수 있거나 또는 비-트랜스제닉 자손을 얻을 수 있는 BBM 전이 유전자를 포함하지 않는 어떤 다른 적절한 식물과 성숙한 트랜스제닉 식물을 교잡 (crossing)함에 따라 얻어질 수 있다.

본 발명의 다른 관점은 본 발명의 방법에 따라 얻어질 수 있는 성숙한 트랜스제닉 식물 또는 식물 부분의 공동-형질전환 시스템 (co-transformation system)으로서의 이용에 관한 것이다. 본 명세서에서 본 발명의 범위는 또한 바람직하게는 마커 프리 시스템 (marker-free system)과 같은, 공동-형질전환 시스템에 대한 기초로서 본 발명에 따라 유도되는 BBM 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 뉴클레오티드 분자의 이용을 포함한다.

본 명세서에서 몇몇의 실시예가 예상된다; 첫 번째 실시예에서, 관심있는 유전자를 포함할 수 있는 다른 발현 구조체로 형질전환된, Tl 또는 고등의 스위트 페퍼 식물과 같은, 외인성의 유도성 BBM-포함 식물로부터 유래된 식물 재료가 있다. 이러한 Tl 또는 고등 식물은 외인성의 유도성 BBM 전이 유전자에 대하여 이형접합적이거나 동형접합적일 수 있다. 두 번째 실시예에서, 유도성 BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스 뿐만 아니라, 관심있는 하나 또는 그 이상의 유전자 요소 또는 하나 또는 그 이상의 관심있는 유전자를 코딩할 수 있는 다른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 발현 구조체로 형질전환된 (및 성숙한 트랜스제닉 식물로 재생된) 비-트랜스제닉의 다루기 힘든 식물로부터 얻어진 식물 재료를 보인다. 이러한 전략의 장점은 유도 BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스의 포함은 본질적으로 각각의 얻어진 성숙한 식물이 유도성 BBM 구조체 및 추가적으로 관심있는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 것이기 때문에 효율적인 마커-프리 형질전환 및 재생을 가능하게 한다는 것이다.

추가적인 실시예에서, 비-트랜스제닉의 다루기 힘든 식물 세포 또는 재료는 유도성 BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 구조체 및 제2의 다른 관심있는 뉴클레오티드 시퀀스를 더 포함하는 발현 구조체로 형질전환된다. 바람직하게는. 다루기 힘든 식물 세포 또는 식물 재료는 동시에 양쪽의 발현 구조체와 접촉한다. 이러한 관심있는 뉴클레오티드 시퀀스는 바람직하게는 관심있는 단백질을 더 코딩할 수 있다. 본 실시예의 장점은 예컨대, 스위트 페퍼처럼, 다루기 힘든 식물 종이 어떤 관심있는 유전자 또는 뉴클레오티드 시퀀스로 필수적으로 형질전환되고 재생될 수 있다는 것이다. 관심있는 그러한 뉴클레오티드 시퀀스는 관심있는 시퀀스, 과발현 시퀀스, 기능을 얻은 시퀀스 (gain-of-function sequence) 또는 어떤 다른 관심 있는 시퀀스에서 지정된 RNAi 시퀀스 또는 안티센스 시퀀스로부터 선택될 수 있다.

양쪽의 실시예는 외인성 BBM 뿐만 아니라, 관심있는 어떤 다른 뉴클레오티드 분자를 포함하는, 스위트 페퍼와 같은, 성숙한 트랜스제닉 식물을 얻는 것을 허락한다.

공동-형질전환 시스템에 관한 첫 번째 실시예는 외인성 BBM을 포함하는 트랜스제닉 식물이 적절한 표현형 또는 유전자형에 기초하여 1차로 선택될 수 있다는 추가적인 장점을 가진다. 적절한 표현형은 충분히 성장하고 발달하는 식물 또는, 적절한 생식력 또는 어떤 다른 적절하거나 바람직한 표현형을 가지는 식물을 포함할 수 있다. 적절한 유전자형은 전이 유전자의 안정성, 위치 효과 (position effect)에 따라 초래되는 것과 같은 BBM의 발현 레벨, BBM의 부적절한 활성인 상기 구조체의 누설성, 단일한 식물의 전이 유전자의 수, 단일한 식물의 단일한 통합 부위에 존재하는 구조체의 수 (T-DNA 구조체의 다양한 복제물이 단일 좌위에 삽입될 수 있다) 또는 어떤 다른 적절하거나 또는 바람직한 속성에 관한 것일 수 있다.

공동-형질전환 시스템에 관한 두 번째 실시예는 단일한 형질전환 및 재생 처리에 있어서, 외인성 BBM 뿐만 아니라, 관심있는 어떤 다른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 다루기 힘든 식물을 얻는 것을 허락한다는 점에서 추가적인 장점을 가진다.

본 명세서에서는 상기 실시예 모두에 있어서 공동-감염 (co-infection) 또는 공동 형질전환 (co-transformation)을 위하여 원형질체를 이용하는 것이 가능하다는 것이 특별히 언급된다.

따라서, 추가적으로 또는 대안적으로, 그들의 재생 단계 동안 형질전환된 식물 세포 또는 형질전환된 식물 재료에 있어서 BBM 활성을 유도하는 것을 포함하는 성숙한 트랜스제닉 식물을 얻는 방법이 제공되는데, 여기에 있어서 상기 식물 세포 또는 식물 재료는 BBM 단백질의 활성을 유도하는 것을 가능하도록 하기에 적합한 유전자 요소에 작동 가능하게 연결된 BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 외인성 뉴클레오티드 분자를 포함하고, 여기에 있어서 식물 재료의 식물 세포는 다루기 힘든 식물, 구체적으로 스위트 페퍼로부터 얻어진다. 원할 때, 상기 트랜스제닉 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물 재료는 성숙한 트랜스제닉 식물로 재생된다. 상기 식물 세포 또는 식물 재료는 Tl 또는 고등 형질전환체로부터 얻어질 수 있다. 이러한 식물은 유도성의 BBM 전이 유전자에 대하여, 바람직하게는 동형접합적일 뿐 아니라 이형접합적일 수 있다.

재생은 상기 BBM 단백질의 활성을 유도하는데 적절한 약제를 포함하는 배지를 형질전환된 식물 세포 또는 식물 재료와 접촉함에 따라 얻어질 수 있다.

Tl 또는 고등 식물이 그것의 활성이 유도될 수 있는 BBM 단백질을 포함하기 때문에, 개개의 다루기 힘든 식물은 BBM 활성에 있어서 재생-경쟁적 (regeneration-competent)으로 만들어진다. 이것은 형질전환된 식물 세포 또는 식물 재료가 관심있는 추가의 뉴클레오티드 시퀀스, 구체적으로는 관심있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 다른 뉴클레오티드 분자로 형질전환될 수 있고, 이러한 식물 재료가 성숙한 트랜스제닉 식물로 재생되는 가능성을 열었다. 이러한 관심있는 두 번째 뉴클레오티드 시퀀스는 또한 관심있는 시퀀스, 과발현 시퀀스, 기능을 얻은 시퀀스 (gain-of-function sequence) 또는 어떤 다른 관심 있는 시퀀스에서 지정된 RNAi 시퀀스 또는 안티센스 시퀀스를 포함한다. 재생 가능한 다루기 힘든 식물을 가지는 것은 활성이 유도될 수 있는 외인성 BBM 단백질의 존재 때문에, 관심있는 어떠한 뉴클레오티드 시퀀스 또는 유전자와 함께 한다는 점에서, 현재 최초로 형질전환 및 재생되어 효율적으로 성숙에 이를 수 있는 스위트 페퍼가 특히 주목받는다. 이러한 실시예에서, 상기 방법은 그러므로 본 명세서에서 의미하는 바와 같이 공동-형질전환 시스템으로서 사용된다.

대안적으로, 유도성 BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 식물 재료 또는 식물 세포의 재생은, 외인성 BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 트랜스제닉 식물이, 본 명세서에서 의미하는 BBM의 유도에 적절한 약제를 포함하는 배양배지와 접촉할 때, 수많은 체세포배로 발달하기 때문에, 식물-증식의 목적을 위하여 이용될 수 있다. 바람직하게, 이러한 배지는 또한, 더 많은 체세포배를 목적하는 때에도, 티디아주론 (thidiazuron), 제아틴 (zeatin) 또는 6-벤질아미노퓨린 (6-benzylaminopurine)과 같은 사이토키닌 (cytokinin 적정량을 포함한다. 떡잎 절편제의 표면 상에서 명백히 구별가능한 체세포배의 숫자가 100개를 초과하여 발견되었기 때문에, 이러한 배 (embryos)를 분리하고 그들이 성숙한 트랜스제닉 식물로 싹트게 하고 발달시키는 것이 가능하다. 증식될 수 있는 이러한 식물 재료는 바람직하게는 이식체, 구체적으로 떡잎 이식체로부터 얻어진다.

추가적으로, 체세포배로부터 얻어진 성장하거나 성숙하는 식물 재료 유래의 재료 또는 세포는, 그로부터 체세포배의 공급을 초래하는 재생 단계 동안 유도성의 BBM에 의하여 증식의 다른 경로에 넣을 수 있다.

본 발명의 마지막 관점은 식물 재료를 성숙한 트랜스제닉 식물로 형질전환 및 재생하기 위한 뉴클레오티드 분자의 용도에 관한 것으로, 여기에 있어서 상기 식물 재료는 다루기 힘든 식물로부터 유래되고, 상기 뉴클레오티드 분자는 BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하며, 상기 BBM 단백질은 서열번호 1에 대하여 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상의 동일성, 바람직하게는 80% 이상의 동일성, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 가짐에 따라 특징되는 기능성 동족체 또는 상기 BBM 단백질이 서열번호 1인 것에 의하여 특징된다.

본 발명의 이러한 관점의 바람직한 실시예에서는 BBM 단백질 활성 유도를 허락하기에 적절한 유전자 요소와 작동 가능하게 연결된 BBM 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스가 있다.

본 발명의 이러한 관점의 다른 바람직한 실시예에서는 전사 활성자, 번역 활성자 또는 바람직하게는 핵 타겟팅 시스템으로 구성된 군에서 선택되는 BBM 단백질의 활성을 유도하는 것을 허락하기에 적절한 유전자 요소가 있다.

본 발명의 이러한 관점의 또 다른 바람직한 실시예에서는 서열번호 2의 BBM 단백질의 활성 유도를 허락하기에 적절한 유전자 요소가 있다.

본 발명의 이러한 관점의 마지막 바람직한 실시예에서는 솔라늄 (Solanum), 페튜니아 (Petunia), 튤리파 (Tulipa), 릴리움 (Lilium), 크로커스 (Crocus), 아이리스 (Iris), 글라디올루스 (Gladiolus), 스피나시아 (Spinacia), 베타 (Beta), 체노포디움 (Chenopodium), 파제올루스 (Phaseolus), 피섬 (Pisum) 및 캡시컴 (Capsicum) 속으로 구성된 군에서 선택되는, 구체적으로 솔라나세 (Solanaceae) 과 유래 식물이며, 조금 더 구체적으로는 스위트 페퍼 캡시컴 아늄 (Capsicum annuum) 식물인 다루기 힘든 식물이 있다.

[실시예]

[실시예 1]

BBM 을 가진 달콤한 맛의 고추의 유전자 형질전환

서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 캡시컴 아늄 (Capsicum annuum) 종의 스위트 페퍼 식물의 유전자 형질전환. 표현형적으로 및 유전자형적으로 구별되는 변이종인 피에스타 (Fiesta), 페라리 (Ferrari) 및 스피릿 (Spirit)으로부터 얻어진 식물을 이용하였다.

공여 식물의 성장

Fl 혼성 피에스타, 페라리 및 스피릿의 살균된 종자 표면 (Enza Zaden, The Netherlands)은 2% 수크로오스로 보충되고, 0.8% 마이크로아가 (Microagar , Duchefa)로 굳힌 전체 강도의 MS 배지 (Murashige and Skoog, 1962)상에 심어졌다. 10일 지난 떡잎은 3-10mm의 이식체로 잘렸고 23℃에서 희미한 불빛 조건 하에서 1-2일 동안 공동-배양 배지 (co-cultivation medium, CCM) 상에서 전배양되었다. CCM은 1.6% 글루코오스 및 2mg/l 제아틴 리보사이드 (zeatin riboside), 0.1 mg/l 인돌-3- 아세트산 (Indole-3-acetic acid, IAA), 또는 0.25 - lmg/1 티디아주론 (Thidiazuron, TDZ), lOM 덱사메타손 (Dexamethasone)으로 보충되고 0.7% 의 마이크로아가 (Microagar)로 굳힌 변형된 R 배지를 포함한다. 200개의 이식체의 평균은 6-10번의 독립적으로 반복되는 실험에서 구조체당 이용되었다.

아그로박테리움 튜메파시엔 (Agrobacterium tumefaciens)의 성장

35S::BBM:GR (당질 코르티코이드 수용체 (Glucocorticoid Receptor, GR)가 번역적으로 융합된 (서열번호 2) BBM을 코딩하는 시퀀스에 작동 가능하게 연결되어 있는 35S 프로모터를 포함하는, 35S::BBM (서열번호 1의 BBM을 코딩하는 시퀀스에 작동 가능하게 연결된 35S 프로모터를 포함하는) 또는 35S::GUS를 운반하는 대조군 플라스미드를 운반하는 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101+pMP90는 28 ℃, 100ml YEB 배지에서 (0.5% 효모 추출물 (yeast extract), 0.5% 소고기 추출물 (beef extract), 2% 수크로오스, pH7.2) 적절한 항생제, 리팜피신 (Rifampicin (lOOmg/1)), 카나마이신 설페이트 (Kanamycin sulfate (lOOmg/1)) 및/또는 겐타마이신 (Gentamycin (25mg/l))의 존재 하에서 밤 내내 배양되어 성장하였다. 식물의 형질전환 전에, 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 서스펜션은 신선하게 준비된 40mg/l 아세토실링곤 (acetosyrringone (Sigma))으로 보충된 액상 CCM으로 OD660 0.3-0.4 되도록 희석되었다.

식물 재료의 유전자 형질전환

상기 희석된 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 배양액은 전-배양된 이식체에 추가되었고 실온에서 30-60분동안 배양되었다. 이식체는 플로팅하여 건조시키고 추가적으로 lOOmg/1 카나마이신 설페이트 (Kanamycin sulfate) 및 500mg/l 케포탁심 (Cefotaxime)으로 보충된 CCM으로 구성된 선택적인 배지로 이동되기 전에 23 ℃ 희미한 불빛 조건 하에서 2-3일동안 40mg/l 아세토실링곤 (Acetosyrringone)으로 보충된 CCM 상에서 공동 배양되었다.

트랜스제닉 식물 재료의 재생

이식체는 두 달동안 23℃, 전체적으로 빛이 비치는 조건의 16/8 h의 낮/밤 주기의, 4주 후에 하나의 서브 배양 (sub-culture)하는 조건으로 이동되었다. 싹-유사 구조체가 발현하는 이식체는 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)의 매크로- (macro-) 및 마이크로- 솔트 (micro-salt) 혼합물, B5 배지(Gamborg O. L. 1968)에 따른 비타민, 1.6% 글루코오스, lmg/1 이노시톨, 20mg/l 아데닌 설페이트 (Adenine sulfate), 200mg/l 카제인 하이드롤리세이트 (Casein hydrolysate), lOmg/1 GA3, 4mg/l BAP, 30μM 실버티오설페이트 (Silverthiosufate), lOOmg/1 카나마이신 설페이트 (Kanamycine sulfate) 및 500mg/l 케포탁심 (Cefotaxime)으로 구성된 신장 배지 (elongation medium, EM)로 4주의 기간동안 옮겨졌다. 신장된 싹은 전-고정 배지 (pre-rooting medium, PRM), 30mg/l 글로타치온 (glutathione), 60ml/l 카나마이신 설페이트 (kanamycin sulfate) 및 300mg/l 케포탁심 (Cefotaxime)로 보충된 변형된 MS 배지에 두 달동안 옮겨졌고 그 후에 2% 수크로오스, 50mg/l 케포탁심 (Cefotaxime) 및 반코마이신 (Vancomycine)로 보충된 루기니 배지 (Rugini medium)로 구성된, lmg/1 IAA가 있거나 또는 없는, 고정 배지로 옮겨졌다. 고정된 싹은 종자를 발아시키기 위하여 온실로 이동되었다. 화학물질과 관련된 모든 조직 배양은 Duchefa Biochemicals (Haarlem, The Netherlands) 사에 의하여 공급받았다.

트랜스제닉 싹의 분석

DNA는 CTAB mini-preparation 방법을 통한 잎으로부터 분리되었고 50μL TE (1OmM Tris pH 8, ImM EDTA)에서 용해되었다. BBM 특이적 프라이머는 공개된 cDNA 시퀀스 BBMfw: gttaggyttytctctmtctcc, BBMrw: gggctgcaaatccttgataacca 에 기초하여 (AF317904 및 -905) 디자인되었다. 형질전환된 플라스미드 및 트랜스제닉 아라비돕시스 라인 유래의 DNA는 대조군으로 사용되었다. PCR 혼합물은 공급자의 프로토콜에 따라 이용되었다. PCR 조건: 15 초 94 ℃; 30 초 48℃: 45초 72℃; 35 사이클. 결과는 도13에서 나타낸다.

트랜스제닉 자손의 분석

각각의 개별적인 트랜스제닉 싹은 자가수분 (self-pollinated)되었고, 또한 전이 유전자의 유전을 분석하기 위하여 최초의 공여 라인으로부터의 식물과 교접되었다. 종자를 수확하고 나서 표면이 살균되었고 2% 수크로오스, 0.8% 마이크로아가 (microagar) 및 200mg/l 카나마이신 설페이트 (Kanamycin sulphate) 또는 100ml/L 파로모마이신 설페이트 (Paromomycin sulfate)의 MS 배지 상으로 심어졌다. 분리는 종자를 심고 4주 후에 평가되었다.

결과

전체적으로, 3개의 재배종에서 10000개 이상의 이식체가 대조군 또는 BBM 구조체 중 하나와 공동-배양되었다. 선택적인 배지 상에서 배양한 첫 번째 3주 동안, 모든 이식체는 사이즈가 커졌고 약간의 옅은 녹색 또는 희끄무레한 캘리 (calli)가 눈에 보이게 되었다. 추가적인 2주가 지난 후에, 캘러스 형성 및/또는 직접적인 싹의 형성이, 사용된 사이토키닌의 유형에 의존하여, 잘려진 표면에서 일어났다. TDZ의 존재 하에서, 이식체는 다양한 싹-유사 구조 (SLS)를 형성하였고, 제아틴 리보사이드 (zeatin riboside)가 우세하게 캘러스를 유도하는 동안 SLS의 수는 줄었다 (도 2 및 3). 이 단계에서, 35S::BBM:GR로 형질전환된 이식체는 대조군보다 많은 SLS를 생산하였다.

EM 배지로 이동하고 난 후, 오직 35S::BBM:GR SLS만 다음의 3-4주 내에 증식되었고 1차 잎 상에서 싹 또는 체세포배 중 어느 하나를 형성하였다 (도 4 및 5, 및 표 2). 싹눈 틔우기, 적절한 싹의 신장 및 형성은 RPM으로의 이동 후에 모두 향상되었다. 뿌리 형성은 고정된 배지로 신장된 줄기의 이동 후에 이동된지 2주 내에일어났다. 형질전환된지 6개월 후에, 고정된 싹은 암면 블록으로 옮겨졌고 종자 생산을 위하여 온실 조건에 적응하였다.

	이식체 없음	SLS 없음	% SLS	고정된 싹
35S::BBM:GR	5620	662	11,78	170
35S:BBM	1128	11	0,98	0

표 2는 2개의 BBM 구조체에 의한 재생의 비교를 보인다.

트랜스제닉 싹은 35S::BBM:GR 구조체로의 형질전환체로부터 생산되었지만 대조군에서는 생산되지 않았다. 선별한 조건 하에서 상기 대조군의 형질전환은 싹-유사 구조 (SLS) 또는 싹보다 캘러스의 생산을 보여준다 (도 12). 3개의 테스트 라인으로부터, 피에스타 (Fiesta)는 가장 높은 재생능 (48%)을 보여주었고, 이어서 스피릿 (Spirit) (3,4%) 및 페라리 (Ferrari) (1,7%) 순이었다 ( 표 3). 온실 조건에 적응한 후에, 식물은 빠르게 자랐고 꽃이 피었지만 비-형질전환된 대조군 식물보다 30% 짧게 머물렀다. 자가 생식 (Selfing) 및 교잡은 성공적으로 수행되었는데, 이는 생식력이 형질전환 및 재생 과정에 의하여 영향을 받지 않음을 나타낸다.

체세포 배형성 (embryogenesis)의 시작은 트랜스제닉 식물의 다양한 싹 생성으로 귀결되었다 (도 5). 몇몇의 독립적인 형질전환 실험으로부터 얻어진 피에스타 및 페라리 유래의 20개 이상의 독립적인 트랜스제닉 식물이 전체적으로 생성되었다. 동일한 이식체로부터 얻어진 독립적인 TO 식물 상에서 PCR에 의한 분자적 분석은 모든 싹이 트랜스제닉된 것을 보여주고, 형질전환 당 이용된 이식체의 초기 수로부터 계산된 전체 형질전환 효율성이 0.5 와 1 % 사이에서 다양할 수 있음을 보인다.

분리 분석은 전이 유전자가 멘델의 패턴에 따라 물려받는 것을 보여주었다 (표 4).

	이식체의 Nr	싹의 Nr	%
페라리 (Ferrari)	886	15	1,7
피에스타 (Fiesta)	1304	626	48
스피릿 (Spirit)	1781	61	3,4

표 3은 35S::BBM:GR로 형질전환된 후에 다른 변이종의 싹 생성의 백분율을 보여준다.

식물 ID	배경	싹눈 틔운 수 (n)	Km R	Km S	비율	n 좌위
1702	피에스타 (Fiesta)	42	31	11	3:1	1
2559	피에스타 (Fiesta)	100	74	24	3:1	1
2639	피에스타 (Fiesta)	113	0	113	0:1	0
2647	피에스타 (Fiesta)	78	0	78	0:1	0
2649	피에스타 (Fiesta)	70	51	19	3:1	1
2650	피에스타 (Fiesta)	50	32	14	3:1	1
2655	피에스타 (Fiesta)	50	37	11	3:1	1
2656	피에스타 (Fiesta)	63	48	15	3:1	1
2676	피에스타 (Fiesta)	24	20	4	5:1	〉1
2691	피에스타 (Fiesta)	14	13	1	13:1	〉1
2692	피에스타 (Fiesta)	49	42	7	6:1	〉1
2693	피에스타 (Fiesta)	100	98	2	49:1	〉1
2696	피에스타 (Fiesta)	77	65	12	5:1	〉1
2697	피에스타 (Fiesta)	100	75	25	3:1	1
2700	피에스타 (Fiesta)	100	82	18	5:1	〉1
2831	페라리 (Ferrari)	79	69	10	7:1	〉1
2832	페라리 (Ferrari)	65	54	11	5:1	〉1
3041	페라리 (Ferrari)	100	75	25	3:1	1

표 4는 선택적인 배지 상에서 성장한 자가 수정된 성숙한 트랜스제닉 식물로부터 얻어진 자손의 분리 분석을 보인다.

논의

상기 결과는 유도성의 과발현된 BBM 유전자를 이용함에 따라, 트랜스제닉 스위트 페퍼 식물에서 좋은 품질의 싹이 직접적으로 또는 체세포 배형성을 통해 재생될 수 있고 상기 전이 유전자가 다음 세대로 유전되는 것을 보인다.

매운 페퍼 종 및 변이종에서 체세포 배 형성의 유도는 정상 식물로 재생되도록 집중적으로 연구되었다. 그러나, 스위트 페퍼에서, 체세포배의 유도는 가능하였지만 배는 정단분열조직 (apical meristem)이 결핍되어서 정상 식물로 발달할 수 없었다. 재생 과정 동안 BBM 유전자를 활성화시킴에 따라, 가임의 스위트 페퍼 식물을 재생시키는 것이 가능해졌다.

[실시예 2]

BBM 를 이용하는 다루기 힘든 페튜니아 W138 의 유전자 형질전환

페튜니아 라인 W138은 재생 및 그 다음의 트랜스제닉 식물의 생산에 있어서 다루기 어려운 것으로 입증되었다.

성숙한 트랜스제닉 페튜니아 식물을 얻으려는 시도에서, W138의 이식체는 페튜니아 형질전환에 대한 표준의 프로토콜을 이용하여 형질전환되었다.

W138 배경의 2가지 라인 (NC2676-10, NC2676-11) 및 W5 배경 중 하나의 라인 (293)은, 이 경우 유도성의 BBM 구조체 (35S : :BBM: : GR) 또는 GUS 리포터 유전자 (reporter gene)를 포함하는 대조군 T-DNA 구조체로 형질전환되었다. 카나마이신 저항성 캘리 (Kanamycin resistant calli)가 NC2676-11, 뒤이어서 293에 대하여 가장 높은 효율성을 가지고 양쪽 구조체를 갖는 모든 세 개의 라인으로부터 얻어졌고, 대조군 구조체의 캘리는 강력한 GUS 발현을 보였다.

싹 유사 구조 (SLS) 및 원기 (primordia)가 라인 NC2676-11에서 첫 번째로 나타났고 동일한 순서로 다른 것들이 뒤이어 나타났지만, 추가적인 발달 및 성장은 오직 35S:BBM::GR으로 형질전환된 캘리에서만 관찰되었다 (도 14 및 15).

스위트 페퍼와 유사하게, BBM의 과발현은 다루기 힘든 식물에서 트랜스제닉 싹의 형성을 가져온다.

[실시예 3]

35S::BBM::GR 라인의 자손 분석

다양한 35S::BBM::GR 라인의 동형접합 Tl 후손은 TDZ, DEX 및/또는 TDZ 및 DEX를 추가적으로 포함하는 공동-재배 배지 시험관 내에서 성장하였다. 대조군으로서 TDZ/DEX를 포함하지 않는 것을 사용하였다.

동형접합적 35S::BBM:GR 라인으로부터 얻어진 떡잎 이식체의 재배는 핵에 의한 유도 및 비-핵에 의해 유도된 BBM 단백질에 의해 초래된 발달상의 차이점을 나타내었다. 횡단선으로 잘렸던 떡잎 가장자리에서, 체세포배가 형성된다 (도 19). 이러한 영향은 DEX가 없는 배지에서 성장한 떡잎 이식체에서는 관찰되지 않았다.

본 명세서의 결과는 제어된, 외인성 BBM 발현은 트랜스제닉 스위트 페퍼의 형태학적으로 정상인 싹을 고품질로 생산하는데 사용될 수 있다. 그러한 체세포배는 접합자배 (zygotic embryos)와 매우 현저한 유사성을 가졌다. 사실, 많은 수 (>100)의 체세포배가 페퍼 떡잎 상에서 유도될 수 있었다. 페퍼 이식체 상에서 확인될 수 있는 그러한 배의 고용량은 조직 배양에 있어서 성숙한 스위트 페퍼의 생산에 도달하기 위한 100배 이상의 증식 인자를 허락하기 위하여 충분하다. 이러한 발견은 또한 유지자 (maintainer) 라인을 사용할 필요 없이 수 불임의 스위트 페퍼 식물을 증식시키는 것을 가능하게 한다.

NCIMB Ltd. NCIMB41732

SEQUENCE LISTING <110> ENZA Zaden Beheer N.V. <120> Method for providing mature transgenic recalcitrant plants via induction of BBM during regeneration <130> 3K/2GC41/21 <140> PCT/EP2009/058860 <141> 2009-07-10 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 579 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 1 Met Asn Asn Asn Trp Leu Gly Phe Ser Leu Ser Pro Tyr Glu Gln Asn 1 5 10 15 His His Arg Lys Asp Val Tyr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Val Val Asp 20 25 30 Val Ala Gly Glu Tyr Cys Tyr Asp Pro Thr Ala Ala Ser Asp Glu Ser 35 40 45 Ser Ala Ile Gln Thr Ser Phe Pro Ser Pro Phe Gly Val Val Val Asp 50 55 60 Ala Phe Thr Arg Asp Asn Asn Ser His Ser Arg Asp Trp Asp Ile Asn 65 70 75 80 Gly Cys Ala Cys Asn Asn Ile His Asn Asp Glu Gln Asp Gly Pro Lys 85 90 95 Leu Glu Asn Phe Leu Gly Arg Thr Thr Thr Ile Tyr Asn Thr Asn Glu 100 105 110 Asn Val Gly Asp Gly Ser Gly Ser Gly Cys Tyr Gly Gly Gly Asp Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Leu Gly Leu Ser Met Ile Lys Thr Trp Leu Arg Asn 130 135 140 Gln Pro Val Asp Asn Val Asp Asn Gln Glu Asn Gly Asn Ala Ala Lys 145 150 155 160 Gly Leu Ser Leu Ser Met Asn Ser Ser Thr Ser Cys Asp Asn Asn Asn 165 170 175 Asp Ser Asn Asn Asn Val Val Ala Gln Gly Lys Thr Ile Asp Asp Ser 180 185 190 Val Glu Ala Thr Pro Lys Lys Thr Ile Glu Ser Phe Gly Gln Arg Thr 195 200 205 Ser Ile Tyr Arg Gly Val Thr Arg His Arg Trp Thr Gly Arg Tyr Glu 210 215 220 Ala His Leu Trp Asp Asn Ser Cys Lys Arg Glu Gly Gln Thr Arg Lys 225 230 235 240 Gly Arg Gln Val Tyr Leu Gly Gly Tyr Asp Lys Glu Glu Lys Ala Ala 245 250 255 Arg Ala Tyr Asp Leu Ala Ala Leu Lys Tyr Trp Gly Thr Thr Thr Thr 260 265 270 Thr Asn Phe Pro Met Ser Glu Tyr Glu Lys Glu Val Glu Glu Met Lys 275 280 285 His Met Thr Arg Gln Glu Tyr Val Ala Ser Leu Arg Arg Lys Ser Ser 290 295 300 Gly Phe Ser Arg Gly Ala Ser Ile Tyr Arg Gly Val Thr Arg His His 305 310 315 320 Gln His Gly Arg Trp Gln Ala Arg Ile Gly Arg Val Ala Gly Asn Lys 325 330 335 Asp Leu Tyr Leu Gly Thr Phe Gly Thr Gln Glu Glu Ala Ala Glu Ala 340 345 350 Tyr Asp Ile Ala Ala Ile Lys Phe Arg Gly Leu Thr Ala Val Thr Asn 355 360 365 Phe Asp Met Asn Arg Tyr Asn Val Lys Ala Ile Leu Glu Ser Pro Ser 370 375 380 Leu Pro Ile Gly Ser Ala Ala Lys Arg Leu Lys Glu Ala Asn Arg Pro 385 390 395 400 Val Pro Ser Met Met Met Ile Ser Asn Asn Val Ser Glu Ser Glu Asn 405 410 415 Ser Ala Ser Gly Trp Gln Asn Ala Ala Val Gln His His Gln Gly Val 420 425 430 Asp Leu Ser Leu Leu His Gln His Gln Glu Arg Tyr Asn Gly Tyr Tyr 435 440 445 Tyr Asn Gly Gly Asn Leu Ser Ser Glu Ser Ala Arg Ala Cys Phe Lys 450 455 460 Gln Glu Asp Asp Gln His His Phe Leu Ser Asn Thr Gln Ser Leu Met 465 470 475 480 Thr Asn Ile Asp His Gln Ser Ser Val Ser Asp Asp Ser Val Thr Val 485 490 495 Cys Gly Asn Val Val Gly Tyr Gly Gly Tyr Gln Gly Phe Ala Ala Pro 500 505 510 Val Asn Cys Asp Ala Tyr Ala Ala Ser Glu Phe Asp Tyr Asn Ala Arg 515 520 525 Asn His Tyr Tyr Phe Ala Gln Gln Gln Gln Thr Gln Gln Ser Pro Gly 530 535 540 Gly Asp Phe Pro Ala Ala Met Thr Asn Asn Val Gly Ser Asn Met Tyr 545 550 555 560 Tyr His Gly Glu Gly Gly Gly Glu Val Ala Pro Thr Phe Thr Val Trp 565 570 575 Asn Asp Asn <210> 2 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dexamethasone induction system <400> 2 tctacaaaga aaaaaatcaa agggattcag caagccactg caggagtctc acaagacact 60 tcggaaaatc ctaacaaaac aatagttcct gctgcattac cacagctcac ccctaccttg 120 gtgtcactgc tggaggtgat tgaacccgag gtgttgtatg caggatatga tagctctgtt 180 ccagattcag cgtggagaat tatgaccaca ctcaacatgt taggtgggcg tcaagtgatt 240 gcagcagtga aatgggcaaa ggcgatacca ggcttcagaa acttacacct ggatgaccaa 300 atgaccctgc tacagtactc atggatgttt ctcatggcat ttgccctggg ttggagatca 360 tacagacaat caagtggaaa cctgctctgc tttgctcctg atctgattat taatgagcag 420 agaatgtctc taccctgcat gtatgaccaa tgtaaacaca tgctgtttgt ctcctctgaa 480 ttacaaagat tgcaggtatc ctatgaagag tatctctgta tgaaaacctt actgcttctc 540 tcctcagttc ctaaggaagg tctgaagagc caagagttat ttgatgagat tcgaatgact 600 tatatcaaag agctaggaaa agccatcgtc aaaagggaag ggaactccag tcagaactgg 660 caacggtttt accaactgac aaagcttctg gactccatgc atgaggtggt tgagaatctc 720 cttacctact gcttccagac atttttggat aagaccatga gtattgagtt cccagagatg 780 ttagctgaaa tcatcactaa tcagatacca aaatattcaa atggaaatat caaaaagctc 840 ctgtttcatc aaaaatgact g 861 <210> 3 <211> 1740 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 3 atgaataata actggttagg cttttctctc tctccttatg aacaaaatca ccatcgtaag 60 gacgtctact cttccaccac cacaaccgtc gtagatgtcg ccggagagta ctgttacgat 120 ccgaccgctg cctccgatga gtcttcagcc atccaaacat cgtttccttc tccctttggt 180 gtcgtcgtcg atgctttcac cagagacaac aatagtcact cccgagattg ggacatcaat 240 ggttgtgcat gcaataacat ccacaacgat gagcaagatg gaccaaagct tgagaatttc 300 cttggccgca ccaccacgat ttacaacacc aacgaaaacg ttggagatgg aagtggaagt 360 ggctgttatg gaggaggaga cggtggtggt ggctcactag gactttcgat gataaagaca 420 tggctgagaa atcaacccgt ggataatgtt gataatcaag aaaatggcaa tgctgcaaaa 480 ggcctgtccc tctcaatgaa ctcatctact tcttgtgata acaacaacga cagcaataac 540 aacgttgttg cccaagggaa gactattgat gatagcgttg aagctacacc gaagaaaact 600 attgagagtt ttggacagag gacgtctata taccgcggtg ttacaaggca tcggtggaca 660 ggaagatatg aggcacattt atgggataat agttgtaaaa gagaaggcca aacgcgcaaa 720 ggaagacaag tttatttggg aggttatgac aaagaagaaa aagcagctag ggcttatgat 780 ttagccgcac tcaagtattg gggaaccacc actactacta acttccccat gagcgaatat 840 gaaaaagagg tagaagagat gaagcacatg acaaggcaag agtatgttgc ctcactgcgc 900 aggaaaagta gtggtttctc tcgtggtgca tcgatttatc gtggagtaac aagacatcac 960 caacatggaa gatggcaagc taggatagga agagtcgccg gtaacaaaga cctctacttg 1020 ggaacttttg gcacacaaga agaagctgca gaggcatacg acattgcggc catcaaattc 1080 agaggattaa ccgcagtgac taacttcgac atgaacagat acaacgttaa agcaatcctc 1140 gaaagcccta gtcttcctat tggtagcgcc gcaaaacgtc tcaaggaggc taaccgtccg 1200 gttccaagta tgatgatgat cagtaataac gtttcagaga gtgagaatag tgctagcggt 1260 tggcaaaacg ctgcggttca gcatcatcag ggagtagatt tgagcttatt gcaccaacat 1320 caagagaggt acaatggtta ttattacaat ggaggaaact tgtcttcgga gagtgctagg 1380 gcttgtttca aacaagagga tgatcaacac catttcttga gcaacacgca gagcctcatg 1440 actaatatcg atcatcaaag ttctgtttcg gatgattcgg ttactgtttg tggaaatgtt 1500 gttggttatg gtggttatca aggatttgca gccccggtta actgcgatgc ctacgctgct 1560 agtgagtttg attataacgc aagaaaccat tattactttg ctcagcagca gcagacccag 1620 cagtcgccag gtggagattt tcccgcggca atgacgaata atgttggctc taatatgtat 1680 taccatgggg aaggtggtgg agaagttgct ccaacattta cagtttggaa cgacaattag 1740

Claims (16)

1. a) 베이비붐 단백질(babyboom protein, BBM)을 암호화하는 발현 벡터로 스위트 페퍼 캡시컴 아늄(Capsicum annuum) 또는 페튜니아 하이브리다(Petunia hybrida) 식물 세포를 형질전환시키는 단계로서, 상기 발현 벡터는 상기 베이비붐 단백질(BBM)의 유도성 핵 전사 활성을 제공하는 것인, 단계;
   b) 상기 베이비붐 단백질(BBM)의 핵 전사 활성을 초래하는 유도성 조건 하에서 상기 형질전환된 스위트 페퍼 캡시컴 아늄 또는 페튜니아 하이브리다 식물 세포를 싹-유사 구조(shoot-like structures, SLS)로 재생시키는 단계로서, 상기 유도성 조건은, 상기 형질전환된 스위트 페퍼 캡시컴 아늄 또는 페튜니아 하이브리다 식물 세포를 상기 전사 활성을 제공하는 제제(agent)를 포함하는 배지와 접촉하는 것을 포함하는 것인, 단계; 및
   c) 상기 베이비붐 단백질(BBM)의 핵 전사 활성의 부재를 초래하는 비-유도성 조건 하에서 상기 싹-유사 구조(SLS)를 가임 트랜스제닉 스위트 페퍼 캡시컴 아늄 또는 페튜니아 하이브리다 식물로 배양시키는 단계(culturing said shoot-like structures (SLS) into a fertile transgenic sweet pepper Capsicum annuum or Petunia hybrida plant);
   를 포함하는, 가임 트랜스제닉 스위트 페퍼 캡시컴 아늄 식물 또는 페튜니아 하이브리다 식물을 제공하는 방법으로서,
   상기 베이비붐 단백질(BBM)은 서열번호 1의 아미노산 시퀀스를 갖는 것인, 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 유도성 핵 전사 활성은 핵 타겟팅 시퀀스(nuclear targeting sequence)에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는, 방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 핵 타겟팅 시퀀스는 서열번호 2의 뉴클레오티드 시퀀스에 의하여 암호화되는 것을 특징으로 하는, 방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 제제는 덱사메타손(dexamethasone)인 것을 특징으로 하는, 방법.
8. 제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 발현 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택 가능한 마커, 하나 또는 그 이상의 관심 있는 단백질 또는 하나 또는 그 이상의 관심 있는 전사물을 더 암호화하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
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15. 삭제
16. 삭제

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