JPH10513042A

JPH10513042A - 花の発生がモジュレートされた遺伝子改変植物

Info

Publication number: JPH10513042A
Application number: JP8520030A
Authority: JP
Inventors: ウェイゲル，デトレフ
Original assignee: ザソークインスティチュートフォアバイオロジカルスタディーズ
Priority date: 1994-12-21
Filing date: 1995-12-21
Publication date: 1998-12-15
Also published as: BR9510172A; EP0798958A4; EP0798958A1; NO972903L; WO1996019105A1; NZ301454A; AU4688496A; US5637785A; US5844119A; FI972581A0; NO972903D0; FI972581A; AU711551B2; US20030167539A1; CA2208061A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、遺伝子改変植物及びモジュレートされた花の分裂組織の発生を示すことを特徴とするそのような植物の生産方法を提供する。具体例として、本発明は、早期の花の分裂組織の発生を示し、そのゲノム中にLEAFYタンパク質をコードする構造遺伝子を含むことを特徴とする遺伝子改変タバコ及びハコヤナギ属植物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】花の発生がモジュレートされた遺伝子改変植物発明の背景 1.発明の分野本発明は一般的には植物の遺伝子工学に関し、特に早期に花の分裂組織を発生する表現型を有するものとして特徴づけられる、新規な遺伝子操作された植物、及びこのような植物の生産方法に関する。 2.関連技術の説明ほとんどの被子植物種では光周期や温度のような環境的な刺激及び年齢のような内部的合図に応答して開花が誘導される。顕花植物の成体器官は、分裂組織と呼ばれる幹細胞の群から発生する。分裂組織の実体は、それをつくる構造から推論される。即ち、栄養分裂組織は根や葉のもととなり、花序分裂組織は花の分裂組織のもととなり、花の分裂組織はがく片や花弁のような花の器官のもととなる。分裂組織は異なる実体の新しい分裂組織を生成することができるばかりでなく、それら自体の実体も発生の間に変化し得る。例えば、栄養苗条分裂組織は花の誘導の際に花序分裂組織へ変化することができ、ある種においては、花序分裂組織自体が最終的に花の分裂組織になる。植物の発生における分裂組織のトランジションは重要であるにも拘わらず、基礎となっている機構についてはほとんど知られていない。発芽に続いて、シュート分裂組織はその隣接部に一連の葉の分裂組織を生成する。しかし、開花の誘導が起こった後は、シュート分裂組織は花の分裂組織を生成するように変化する。花の分裂組織は花器官の原基を生成し、これは個々にがく片、花弁、雄しべまたは心皮へと発生する。このように、花の形成は一連の異なる発生の段階、即ち、花の誘導、花原基の形成及び花器官の生成からなるものと考えられる。各ステップを中断させる突然変異は様々な種において単離されており、遺伝的階層が開花プロセスを支配することが示唆されている(総説についてはWeigel と Meyerwitz，Molecular Basis of Morphogenesis(M．Bernfield 編)．5lst Annual Symposium of the Society for Development Biology，pp.93 -107，New York，1993 参照)。最近、遠い関係にある二つの双子葉植物、ナズナ(Arabidopsis thaliana)とキンギョソウ(Antirrhinum majus)の研究により、単独であるいは共同して作用して花の器官を決定する３つのクラスのホメオティック遺伝子が同定された(Bowma nら，Development,112:1，1991; Carpenter と Coen，Genes Devl.,4:1483，199 0; Schwarz-Sommer ら，Science, 250:931，1990)。これらの遺伝子いくつかは、保存されたＤＮＡ結合ドメインがMADSボックスと称される転写因子である(Sch warz-Sommerら,上出)。花の分裂組織の実体を制御する、より早期に作用する遺伝子も特徴づけられている。花の分裂組織は、アラビドプシス(Arabidopsis)属及びアンチリナム(Anti rrhinum)属のいずれにおいても花序分裂組織に由来する。分裂組織細胞の花への発生を制御する二つの因子が知られている。アラビドプシス属においては、その因子はLEAFY遺伝子(Weigelら、Cell69:843，1992)及びAPETALA1(Mandelら、Natu re 360:273，1992)遺伝子の産物である。これらの遺伝子のいずれかが突然変異によって不活性化されると、花と花序との特徴部分を結合している構造が発生する(Weigelら、上出; Irish and Sussex，Plant Cell，2:741，1990)。アンチリナム属においては、アラビドプシス属LEAFY遺伝子の相同体はFLORICAULA(Coenら，Cell，63:1311，1990)であり、APETALA1遺伝子の相同体はSQUAMOSAである(Hui jserら、EMBO J.,11:1239，1992)。後者の対はMADSボックスドメインを含んでいる。 LEAFYは花原基(anlagen及びprimordia)においてごく早期に発現され、花の分裂組織実体を確立することにおける直接の役割を有することと合致している。発生中の花原基においては、LEAFYの発現は、ホメオティック遺伝子AG及びAP3の発現よりもずっと早期に検出され、LEAFYは花のホメオティック遺伝子の発現の制御において役割を有することを示唆している。植物バイオテクノロジーの分野の研究者には、主要な農作物の品種を含む植物を遺伝子工学的に作出しようとする気運が高まっている。経済的に望ましい遺伝学的改変として植物の開花時期を早めることがある。開花の誘導は農作物植物を成長させることにおいて制限因子となることが多い。開花の誘導を制御する最も重要な因子は、季節的及び地理的に変動する光周期である。場所的あるいは環境的な条件に関わりなく、植物における開花を制御し、誘導する方法を開発し、任意の所定の時期に農作物を生産できるようにすることに対する要請がある。ほとんどの農作物、例えば、種子、穀物、果実は花から得られるので、このような開花の制御方法は経済的に非常に価値が高い。発明の概要本発明は、遺伝子的に改変した植物細胞を作出し、それから完全な植物を再生することができ、この植物細胞中に花の発生の遺伝形質が安定に組み込まれているという知見により完成されたものである。特に、本発明の方法による遺伝子改変により早期の開花の形質を植物に与えることができる。第一の態様においては、本発明は、そのゲノム中に少なくとも１の異種核酸配列を含み、モジュレートされた花の分裂組織の発生を示すことを特徴とする遺伝子改変植物を提供する。植物は、好ましくはLEAFYタンパク質をコードする核酸配列の導入により遺伝子的に改変される。あるいは、その植物はLEAFYタンパク質をコードする核酸配列、APETALA1タンパク質をコードする核酸配列またはその両方での形質転換により遺伝子的に改変されるものである。本発明はまた、前記遺伝子改変植物に由来する植物細胞、植物組織及び種子を提供する。第二の態様においては、本発明は花の分裂組織の発生をモジュレートするための植物細胞の形質転換用のベクターを提供するものであり、ここで該ベクターは、プロモーターに機能を発揮するように結合した、花の分裂組織の発生をモジュレートするタンパク質をコードする、少なくとも１の構造遺伝子からなる核酸配列を含む。好ましくは、該ベクターはLEAFYタンパク質をコードする核酸配列を含む。また、モジュレートされた花の分裂組織の発生を示すことを特徴とする遺伝子的改変植物を作出する方法が提供される。該方法は、植物細胞を、プロモーターに機能を発揮するように結合した、花の分裂組織の発生をモジュレートするタンパク質をコードする、少なくとも１の構造遺伝子からなる核酸配列を含むベクターと接触させて形質転換植物細胞を得る工程と、該形質転換植物細胞から植物を作出する工程と、モジュレートされた花の分裂組織の発生を示す植物を選択する工程とを含む。図面の簡単な説明図１は35S::LFYベクターの構築のための親プラスミドである、pDW139の模式図を示す。LEAFY(LFY)のオープンリーディングフレームには斜線を付し、5'及び3' の非翻訳領域には点を付す。図２は、早期開花表現型の35S::LFYタバコ植物を示す。左は対照植物であり、関連のない構築物で形質転換したものである。中央及び右は、35S::LFY導入遺伝子を有する別々の由来の２種のT₂植物である(146.21株、146.26株)。植物は５週齢のものである。図３は35S::LFYタバコ植物における頂端分裂組織の早期の拡大を示す。パネル (A)は対照であり、関連のない構築物で形質転換したものである。パネル(B)は実験植物であり、35S::LFY構築物により形質転換したものである。寸法を示すバーの長さは50μmである。図４は、35S::LFYアラビドプシス(Arabidopsis)植物の早期開花表現型を示す。パネル(A)は対照植物であり、関連のない構築物で形質転換したものである。ロゼット葉(rl)は子葉(cot)よりも有意に大きい。パネル(B)は35S::LFY形質転換体である(151.106株)。最初の2枚のロゼット葉(rl)は子葉よりも小さい。小さいシュートが形成され、２つの茎(cauline)(＝茎)葉(cl)のようにみえるものを有する。図５は35S::LFYナズナ植物における、全てのシュートの花への転換を示す。パネル(A)は比較のための、約６週齢の成熟ナズナ植物(Nossen生態型)を示す。パネル(B)は野生型のナズナの花序の上部外観であり、シュート分裂組織の不確定さを示している。パネル(C)-(E)は35S::LFY植物(Nossen生態型において生成)であり、３週齢のものである。パネル(C)はシュートが単弁花(三角形)で置換されたものである(151.201株)。子葉を示す(cot)。パネル(D)は、主なシュート上の一次頂生花(1°)の発生と、茎葉(cl)の葉腋における二次単弁花(2°)の発生である。カールしたロゼット葉(rl)の葉腋から生ずる頂生単弁花は三角形により示す(151.209株)。パネル(E)は、(D)で示した一次及び二次花の異なる角度からの接近して見た外観である。雌しべ群(g)は心皮を含み、概ね正常に見える。雄しべの数は減少しており、花弁及びがく片は存在しない。葉、がく片及び心皮様の特徴を有する単一の一次輪生器官を星印により示す。図6は、アラビドプシス属のLFYの構成的発現がポプラシュートを花に変換することを示している。パネルa及びbは、組織培養で成長した５月齢の雑種ポプラ(P opulous tremula x tremuloides)のシュートを示す。パネルaは35S::LFY形質転換体を示す。葉の葉腋における孤立側方花の(lf)及び異常な頂生花(tf)を示す。パネルbは非トランスジェニック対照を示す。矢印は葉の葉腋を示し、ここから通常は次の年に側方栄養シュートが出てくる。組織培養から再生されたポプラ植物は、最初の成長周期の間に種子から成長した植物と同じ幼体表現型を示すことに留意せよ(Nilsson，O.，学位請求論文、Swedish Univ．Agricul．Sciences，1 995)。パネルCは、温室へ移した７月齢の35S::LFY形質転換体の葉腋において形成された、孤立雄花の拡大した外観である。パネルdは、パネルeにおいて示した野生型尾状花序から取った雄花の拡大した外観を示す。包葉(b)が野生型花を有していることに留意せよ。パネルeは、雑種ポプラの親種のうちの1つであるP．t remulaの15年齢の木から取られた雄尾状花序のクラスターを示す。葯中の赤い色素が見える。寸法を示すバーはa，b，5 mm、c，d，1 mm、e，20 mmである。図7は、35S::LFY表現型がap1突然変異によって部分的に抑制されることを示す。パネルaは、erecta突然変異を有する五週齢植物を示す。35S::LFY AP1⁺植物( 左)は細伸長された一次シュートを持たない。35S::LFYap1植物（中央）では一次シュートが十分に発生するが、一次シュートはやはり未成熟なままでとまり、非トランスジェニックap1植物（右）のそれより短い。パネルb-dは、35S::LFYap1 植物の詳細な概観を示す。パネルbは、パネルaで矢印によって示した側生シュートの拡大写真である。パネルcは、ロゼット葉の葉腋に出てきているシュートを示す。パネルdは、頂生花(tf)を有する一次シュートの上部外観を示す。パネルc 及びdは４週齢植物のものである。ap1効果は、cal-1突然変異によってさらに増強されるが、35S::LFY ap1表現型の質的な変化はない。発明の詳細な説明本発明は、早期の花の発生または早期の開花の表現型形質を有することを特徴とする遺伝子的に改変された植物を提供する。この植物は、該植物において開花を誘導するのに十分な、LEAFYのようなタンパク質をコードする少くとも1の構造遺伝子によって遺伝子的に改変されている。第一の態様において、本発明は、少くとも1つの異種核酸配列をそのゲノムに含み、調節された花の分裂組織発生を有することを特徴とする遺伝子的に改変された植物を提供する。また、本発明の遺伝子的に改変された植物に由来する全ての植物細胞及び植物組織も本発明に包含される。さらに、本明細書で記載するような遺伝子的に改変された植物に育ち得る種子も提供される。本明細書で使用される「遺伝的改変」という用語は、完全で生殖能力のある生存可能な植物を作出することができる、一以上の植物細胞中への一以上の異種核酸配列の導入をいうものである。本明細書で使用される「遺伝子的に改変された」という用語は、前記の方法により作出された植物をいう。本発明の遺伝子的に改変された植物は、自家受粉するか、同種の別の植物と交差受粉することができ、生殖細胞系が有する外来遺伝子を農業上有用な植物品種中に挿入し、あるいは農業上有用な植物変種を交配により作出することができる。本明細書で使用される「植物細胞」という用語は、プロトプラスト、配偶子を生産する細胞、及び完全な植物に再生する細胞をいう。従って、完全な植物に再生できる多数の植物細胞を含んでいる種子は、「植物細胞」の定義に含まれる。本明細書で使用されるように、「植物」という用語は、例えば、完全な植物、植物の部分、植物細胞、または植物細胞の群（例えば植物組織等）のいずれかをいうものである。苗木もまた「植物」の意味の範囲内に含まれる。本発明にいう植物は、形質転換技術を使用することができる任意の顕花植物であり、単子葉植物及び双子葉植物の双方を含む。単子葉植物の例としては、これらに限定されるものではないが、アスパラガス、青刈りトウモロコシ及びスイートコーン、オオムギ、小麦、米、穀実用モロコシ、タマネギ、トウジンヒエ、ライ麦、オート麦等が挙げられる。双子葉植物の例としては、これらに限定されるものではないが、トマト、タバコ、綿、ナタネ、ソラマメ、大豆、コショウ、レタス、エンドウ、アルファルファ、クローバー、アブラナ属の作物、即ちBrassica oleracea(例えば、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ)、ハツカダイコン、ニンジン、ビート、ナス、ホウレンソウ、キュウリ、スカッシュ、メロン、カンタロープ、ヒマワリ、種々の鑑賞用植物等が挙げられる。本明細書で記載した典型的なモデルは、タバコ植物と多年生の木、アスペン(aspen)を含む。本明細書で使用される「異種核酸配列」という用語は、プロモーターのような調節配列と機能を発揮するように結合した少くとも1の構造遺伝子をいう。該核酸配列は外来種に由来するまたはその当初の形態から実質的に改変された形態を有する場合には同種に由来する。例えば、「異種核酸配列」という用語は、その配列が天然型とは異なるプロモーターまたは野性型のプロモーターに機能を発揮するように結合された、同種に由来する核酸を含む。本明細書で使用されるように、「核酸配列」という用語は、別の断片の形態でまたはより大きい構築物の構成要素としての、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体をいう。本発明の方法で利用するタンパク質をコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドから組み立てられることができ、これにより組換え転写ユニットにおいて発現され得る合成遺伝子が得られる。本発明のポリヌクレオチドまたは核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びｃＤＮＡ配列を含む。本発明において使用することができる構造遺伝子の例としては、開花を制御するLEAFY遺伝子及びAPETALA1遺伝子が挙げられる。また、LEAFY及びAPETALA1遺伝子の構造上及び機能上の相同体は本発明に包含される。例えば、キンギョソウ（ Antirrhinum majus ）においては、LEAFY遺伝子の相同体はFLORICAULA遺伝子あり、APETALA1遺伝子の相同体はSQUAMOSA遺伝子である。開花を制御するその他の遺伝子は当業者に知られており、あるいは容易に確認することができる。本発明において使用される核酸配列は、いくつかの方法によって得ることができる。例えばＤＮＡは当分野において周知のハイブリダイゼーション手法を使用して単離することができる。そのようなものとしては、限定されるものではないが、1)共通のヌクレオチド配列を検出するためのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーに対するプローブのハイブリダイゼーション、2)共通の構造上の特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、3)ポリメラーゼ連鎖反応(P CR)による合成等が挙げられる。また、特定の遺伝子の配列は、GenBank(国立衛生研究所のコンピューターデータベース)において見つけることができる。本発明で使用する所望の核酸配列のためのスクリーニングに有用なハイブリダイゼーション手法は、各プローブが潜在的に、変性した二本鎖ＤＮＡの不均一な混合物を含むハイブリダイゼーションサンプル中の特異的なＤＮＡ配列の完全な相補体である、標識された混合合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するものである。そのようなスクリーニングのためには、ハイブリダイゼーションは、好ましくは一本鎖ＤＮＡまたは変性された二本鎖ＤＮＡのいずれかについて行われる。ハイブリダイゼーションは、目的のポリペプチドに関連するｍＲＮＡ配列の量が非常に少ないソースに由来するｃＤＮＡクローンの検出において特に有用である。即ち、非特異的結合を避けるようにしたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用することによって、例えば、混合物中の前記標的ＤＮＡの完全な相補体である単一のプローブに対する標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより、特異的なｃＤＮＡクローンをオートラジオグラフィーで可視化すことができる(Wallaceら、Nucleic Acid Research, 9:879，1981)。また、LEAFYタンパク質のような目的の異種タンパク質をコードしている特異的なＤＮＡ配列は、1)ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、2)目的のポリペプチドに必要なコドンを提供するＤＮＡ配列の化学合成、3)真核生物ドナー細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成によっても得られる。最後の場合、一般にｃＤＮＡと呼ばれる、ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補物が最終的に形成される。ｃＤＮＡ発現ライブラリー、例えばλgt11を、異種タンパク質についての抗体特異性を使用して、少くとも1つのエピトープを有する異種ポリペプチドについて間接的にスクリーニングすることができる。そのような抗体は、ポリクローナルあるいはモノクローナルのいずれの形態で得てもよく、異種タンパク質ｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するのに使用することができる。ポリペプチド配列は遺伝暗号から推定することができるが、コードの縮重を考慮しなければならない。本発明において使用する核酸配列は、遺伝暗号の結果として縮重する配列を含む。20種の天然アミノ酸があるが、そのほとんどが1種より多いコドンにより特定される。従って、異種ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的なポリペプチド(少くともセンスポリヌクレオチド鎖の場合において)を生じる限り、全ての縮重したヌクレオチド配列は本発明に包含されるものである。本明細書で使用する「調節された」花の分裂組織発生は、操作されていない天然の植物と比較して、速められているかまたは阻害されている／遅らせられているかのいずれでもよい花の発生をいう。従って、「モジュレートする」という用語は、発生が望ましい場合は花の発生の加速あるいは増強を意味するものであり、発生が望ましくない場合は花の発生の抑制または阻止を意味するものである。本発明で使用する異種核酸配列は、花の分裂組織発生のための構造遺伝子である。好ましくは、そのような遺伝子は開花の開始に十分なタンパク質をコードするものであり、最も好ましくは、核酸配列はLEAFYタンパク質をコードするものである。LEAFY遺伝子あるいはその他の花の分裂組織発生遺伝子は、単独で、あるいは開花の発生において重要なタンパク質をコードする別の遺伝子のようなもう一つの構造遺伝子とともに使用されてもよい。そのような遺伝子の例は、APET ALA1遺伝子である。本発明の遺伝的に改変された植物は、花の分裂組織発生を調節するタンパク質をコードしている少くとも1の構造遺伝子からなる異種核酸配列を含むベクターと、植物細胞とを接触させることによって作出される。植物細胞に導入されたものが有効であるためには、目的の構造遺伝子は、植物細胞において目的の遺伝子の転写を起こすのに有効なプロモーターに機能を発揮するように結合されていなければならない。また、同様に植物細胞において認識されるポリアデニル化配列あるいは転写制御配列を使用してもよい。本明細書で記載するように、異種核酸配列を有しているベクターも一種以上の選択可能なマーカー遺伝子を含み、形質転換細胞を培養物中の非形質転換細胞から選択できるようにされていることが好ましい。「機能を発揮するように結合した」という用語は、プロモーター配列及びプロモーター核酸配列によって制御される構造遺伝子の間の機能的な結合をいうものである。機能を発揮するように結合されたプロモーターは、構造遺伝子によってコードされたポリペプチドの発現を制御する。本発明において使用される構造遺伝子の発現は、種々のプロモーターにより推進され得る。目的の構造遺伝子の内因性プロモーターを遺伝子の転写調節に使用してもよいが、好ましくはプロモーターは外来の調節配列である。植物発現ベクターに適したウイルスプロモーターとしては、CaMVの35SＲＮＡと19SＲＮＡプロモーター(Brissonら，Nature，310:511，1984；Odellら，Nature，313:810，198 5)； Figwortモザイクウイルス(FMV)からの完全長転写プロモーター(Gowdaら，J ．Cell Biochem.，13D:301，1989)及びTMVに対するコートタンパク質プロモーター(Takamatuら，EMBO J.6:307，1987)がある。あるいは、リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット(ssRUBISCO)からの光誘導性プロモーター(Coruzziら，EMBO J., 3:1671，1984; Broglieら，Science, 224:838，1984 )；マンノピンシンターゼプロモーター(Veltenら，EMBO J., 3:2723，1984)ノパリンシンターゼ(NOS)及びオクトピンシンターゼ(OCS)プロモーター(Agrobacteri um tumefaciens の腫瘍誘発プラスミド上に保有される)または熱ョックプロモーター、例えば：大豆hsp17.5-Eまたはhsp17.3-B(Gurleyら，Mol．Cell．Biol.，6 :559，1986; Severinら，Plant Mol．Biol.，15:827，1990)のような植物プロモーターを使用してもよい。本発明において有用なプロモーターは、構成的及び誘導性の天然型プロモーター並びに遺伝子操作されたプロモーターを含む。CaMVプロモーターは構成的プロモーターの例である。有用性が高いものであるためには、誘導性のプロモーターは、1)誘導物質がない場合、低い発現を与えるものであること、2)誘導物質の存在下に高い発現を与えるものであること、3)植物の正常の生理を妨害しない誘導方法を使用するものであること、4)他の遺伝子の発現に影響しないものであること等が必要である。植物において有用な誘導性のプロモーターの例としては、化学的手段により誘導されるもの、例えば、銅イオンによって活性化される酵母のメタロチオネインプロモーター(Mettら，Proc．Natl．Acad．Sci.，U.S.A.，90: 4567，1993)；置換ベンゼンスルホンアミド類、例えば除草剤の毒性緩和剤によって活性化されるIn2-1及びIn2-2調節配列(Hersheyら，Plant Mol．Biol. 17:67 9(1991);及び糖質コルチコイドによって誘導されるGRE調節配列(Schenaら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，U.S.A.，88:10421，1991)等が挙げられる。構成的なもの及び誘導性のものを含むその他のプロモーター、及びエンハンサーは当業者に知られている。選択された特定のプロモーターは、十分な発現を起こして、例えばLEAFYのような構造遺伝子産物を有効な量を生産し、早期の花の分裂組織発生を引き起こすようにできなければならない。本発明のベクター構築物において使用するプロモーターは、所望の場合は、それらの制御特性に影響を及ぼすように改変されていてもよい。また、組織特異的なプロモーターも本発明において使用することができる。組織特異的なプロモーターの例は、シュート分裂組織において発現されるプロモーターである(Atanassovaら，Plant J.，2:291，1992)。トランスジェニック植物において有用なその他の組織特異的なプロモーターとしては、cdc2aプロモーター、cyc07プロモーター等があり、当業者に知られている(例えば、Itoら，Plant Mol．Biol.，24:863，1994; Martinezら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:73 60，1992; Medfordら，Plant Cell，3:359，1991; Teradaら，Plant Journal, 3 :241，1993; Wissenbachら，Plant Journal, 4:441，1993等を参照)。任意に、選択可能なマーカーを、異種核酸配列、即ち機能を発揮するようにプロモーターに結合された構造遺伝子に結合してもよい。本明細書で使用するように、「マーカー」という用語は、そのマーカーを含んでいる植物または植物細胞についての選択あるいはスクリーニングを可能とする形質または表現型をコードしている遺伝子をいうものである。好ましくは、マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であり、それによって適当な抗生物質を使用して非形質転換細胞の中から形質転換細胞を選択することができる。好適な選択可能なマーカーの例としては、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ヒグロマイシンＢ-ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシド3'-O-ホスホトランスフェラーゼII( カナマイシン、ネオマイシン及びG418耐性)等がある。その他の好適なマーカーも、当業者が知得するであろう。本発明において植物細胞を形質転換して花の分裂組織発生を調節するために使用されるベクターは、プロモーターに機能を発揮するように結合された、花の分裂組織発生を調節するタンパク質をコードしている少くとも1の構造遺伝子からなる核酸配列を含む。本発明により形質転換のプロセスを開始するためには、最初に好適なベクターを構築し、それを植物細胞中に適切に導入することが必要である。本発明で使用されるベクターの構築の詳細は、植物遺伝子操作の分野の技術者に知られているものである。例えば、本発明において使用される異種核酸配列は、Tiプラスミド、根-誘発( Ri)プラスミド、植物ウイルスベクター等を使用して植物細胞に導入することができる(そのような手法の総説については、例えば、Weissbach & Weissbach，19 88，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VII I，pp．421-463; 及びGrierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch．7-9,及びHorschら，Science, 227:1229，1985があり、これらはいずれも引用により本明細書の一部として取り込まれている)。当分野の技術者であれば、比較的無損傷の状態で異種核酸配列を導入するために適当なベクターを選択することができるであろう。即ち、導入されたＤＮＡ配列を有している植物を作出するいかなるベクターでも十分使用できるはずでる。効率は低いが、裸のＤＮＡの部分でも本発明の特徴を与えることができると考えられる。ベクターの選択、あるいはベクターを使用するかどうかは通常は選択した形質転換の方法によって決まる。本発明による植物の形質転換は、本質的に植物分子生物学の分野の技術者に知られた種々の方法の任意のものにより行うことができる(例えば、Methods of En zymology，Vol．153，1987，Wu と Grossman ら編，Academic Press参照、これは引用により本明細書の一部として取り込まれている)。本明細書で使用するように、「形質転換」という用語は、異種核酸配列の導入による宿主植物の遺伝子型の改変を意味する。例えば、異種核酸配列は、Tiプラスミドを含んでいるアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を使用して植物細胞に導入することができる。形質転換ビヒクルとしてアグロバクテリウムツメファシエンス培養物を使用する場合、ベクターキャリアーとしてアグロバクテリウムの非発癌性株を使用し、形質転換組織の正常な非発癌性の分化が可能となるようにすることが最も有利である。また、アグロバクテリウムがバイナリーTiプラスミド系を有することが好ましい。そのようなバイナリー系は、1)植物への移入ＤＮＡ(T-ＤＮＡ) の導入のために必須のビルレンス領域を有する最初のTiプラスミド、及び2)キメラプラスミドを含む。後者は、移入される核酸に隣接する野生型Tiプラスミドの T-ＤＮＡ領域の少くとも1つの境界領域を含む。バイナリーTiプラスミド系が植物細胞を形質転換するのに有効であることが示されている(De Framond，Biotech nology，1:262，1983; Hoekemaら，Nature，303:179，1983)。このようなバイナリー系はアグロバクテリウムにTiプラスミドを組み込むことを必要としないので好ましい。アグロバクテリウムを使用する方法としては、限定されるものではないが、1) 培養された単離プロトプラストとのアグロバクテリウムの共存培養、2)植物細胞または組織のアグロバクテリウムによる形質転換、または3)種子、頂部あるいは分裂組織のアグロバクテリウムによる形質転換がある。さらに、遺伝子移入は、Bechtoldらによって記載され(C.R．Acad．Sci．Paris ，316:1194，1993)、本明細書で実施例において示すような、アグロバクテリウムによるin situ形質転換によって行うことができる。このアプローチは、アグロバクテリウム細胞の懸濁物の減圧浸潤に基づくものである。異種核酸を植物細胞に導入する好ましい方法は、そのような植物細胞、外植片、分裂組織、あるいは種子に、先に記載したような形質転換アグロバクテリウムツメファシエンスを感染させることである。当分野において公知の適当な条件下で形質転換植物細胞を増殖させ、シュート、根を形成させ、さらに植物に発生させる。本発明の好ましいベクターは、異種核酸配列がLEAFYタンパク質コードするTi プラスミドバイナリー系を含むものである。そのようなベクターは、任意にAPET ALA1のような第二の花発生因子をコードする核酸配列を含んでもいてもよい。あるいは、それぞれのベクターが異種核酸配列を含む、２つのベクターを使用することもできる。その他の花の発生遺伝子を、同様な方法でーつ以上のベクターの構築のために使用することができる。あるいは、異種核酸は、機械的または化学的手段を用いて植物細胞と接触させることによって植物細胞に導入することができる。例えば、核酸をマイクロピペットを使用したマイクロインジェクションによって直接機械的に植物細胞に移入することができる。あるいは、細胞に取り込まれる遺伝物質との沈殿複合体を形成するポリエチレングリコールを使用することによって、核酸を植物細胞に移入してもよい。異種核酸は、エレクトロポレーションによって植物細胞に導入することもできる(Frommら，Proc．Natl．Acad．Sci.，U.S.A.，82:5824，1985、引用により本明細書の一部として取り込まれている)。この技術においては、関連する核酸配列を含んでいるベクターまたは核酸の存在下で植物プロトプラストをエレクトロポレーションにかける。高い電場強度の電気パルスにより膜を可逆的に透過性にし、核酸の導入を可能とする。エレクトロポレーションを受けた植物プロトプラストは細胞壁を再生し、分裂して植物カルスを形成する。形質転換遺伝子を有する形質転換植物細胞の選択は、本明細書で記載したように表現型マーカーを使用して達成することができる。核酸を植物細胞に導入するためのもう一つの方法は、小さいビーズか粒子のマトリックス内、あるいはその表面に含まれた導入される核酸を有する小粒子による高速弾道透過である(Kleinら，Nature 327:70，1987)。通常は新たな核酸配列の一回の導入のみを必要とするが、この方法では特に複数の導入を提供する。また、異種核酸を植物細胞に導入するためにカリフラワーモザイクウイルス(C aMV)をベクターとして使用してもよい(米国特許第4,407,956号)。CaMVウイルスＤＮＡゲノムを、細菌中で増殖され得る組換えＤＮＡ分子を形成する親細菌プラスミドに挿入する。クローンニングした後に、組換えプラスミドを再びクローンニングし、所望の核酸配列の導入によりさらに改変してもよい。その後組換えプラスミドの改変されたウイルス性部分を親細菌プラスミドから切り出し、植物細胞あるいは植物への接種に使用する。別の態様においては、本発明は、調節された花の分裂組織発生を示すことを特徴とする遺伝子的に改変された植物を作出する方法を含み、該方法は、プロモーターに機能を発揮するように結合した、花の分裂組織の発生を調節するためのタンパク質をコードしている少くとも1の構造遺伝子を含んでいる異種核酸配列を含むベクターに植物細胞を接触させて形質転換植物細胞を得る工程と、形質転換植物細胞から植物を成長させる工程と、モジュレートされた花の分裂組織発生を示す植物を選択する工程とを含む。本明細書で使用されるように、「接触させる」という用語は、先に述べたように化学的及び物理的手段を含む、ベクターを植物細胞に導入する任意の手段を示す。好ましくは、接触させるとは、先に述べたように異種核酸で形質転換したアグロバクテリウムツメファシエンスを介して、核酸またはベクターを植物細胞( 外植片、分裂組織、種子を含む)に導入することをいう。通常は、植物細胞を再生して形質転換工程から完全な植物を得る。形質転換の直接の生成物を、「導入遺伝子体(transgenote)」と称する。本明細書で使用される用語「成長」または「再生」は、植物細胞、植物細胞の群、植物の部分(種子を含む)または植物片(例えば、プロトプラスト、カルスまたは組織部分)から完全な植物が成長することを意味する。プロトプラストからの再生は植物の種により異なるが、一般には、プロトプラストの懸濁物を最初に形成する。ある種においては、次いでプロトプラスト懸濁物から天然の胚と同様の成熟及び発芽段階に胚形成を誘導することができる。培養培地は一般に、成長と再生に必要な種々のアミノ酸とホルモンとを含む。使用されるホルモンの例としては、オーキシンとサイトカイニンとがある。特にトウモロコシ、アルファルファのような種については、グルタミン酸及びプロリンを培地に加えることが有利である場合がある。効率的な再生は、培地、遺伝子型、培養履歴に依存する。これらの要素を管理することにより再生は再現可能なものとなる。再生は、植物カルス、外植片、器官または部分からも起こる。形質転換は、器官または植物部分再生について行うことができる(Methods in Enzymology，Vol ．118及びKleeら，Annual Review of Plant Physiology，38:467，1987)。Horsc hら，Science，227:1229，1985の葉ディスクー形質転換再生法を利用してディスクを選択培地上で培養すると、その後約2-4週間シュート形成が続く。発生するシュートをカルスから切り出し、適当な根-誘発選択培地に移植する。根付いた苗木は根が現れた後、土壌にできるだけ早く移植する。苗木は成熟するまで必要に応じて鉢を変えてもよい。栄養的に増殖した作物においては、成熟したトランスジェニック植物を切断物を採取することまたは組織培養法によって増殖させ、多数の同じ植物を作出する。所望の導入遺伝子体を選択し、新しい品種を得て商業用に栄養増殖させる。種子増殖作物においては、成熟したトランスジェニック植物を自家交配して同型接合の近親交配植物を作出することができる。近親交配植物は、新しく導入された異種遺伝子を含む種子を生産する。これらの種子を成長させて選択された表現型、例えば早期の開花を示す植物を作出することができる。再生された植物から得られた部分、例えば花、種子、葉、枝、果実等で先に記載したように形質転換された細胞を含むものが本発明に包含される。再生された植物の子孫、変種及び突然変異体で、これらの部分が導入された核酸配列を含むものも本発明の範囲内に含まれる。モジュレートされた花の分裂組織発生を示す植物は、目視観察によって選択することができる。本発明は、遺伝子的に改変された植物から生じた植物組織、種子、その他の植物細胞を含む、本発明の方法によって作出された植物を含む。さらに別の態様においては、本発明は植物細胞の花の分裂組織発生をモジュレートするための方法を提供し、該方法は、植物細胞を上記のようにベクターと接触させて形質転換された植物細胞を得、形質転換された植物細胞を植物形成条件下で成長させ、植物において花の分裂組織発生をモジュレートすることを含む。本発明の方法は、プロモーター配列が構造遺伝子に機能を発揮するように結合していることを必要とする。花の発生の誘導が望まれる場合は、プロモーターは誘導性のプロモーターである。例えば、植物細胞と植物とを先に述べたように生産し、LEAFYをコードする核酸に結合したプロモーターを適当な誘導物質と接触させることにより、モジュレートされた花の分裂組織発生を誘導する。そのような誘導性のプロモーターは先に記載したが、これらのプロモーターは好ましくは化学的手段により誘導可能なものである。今回の実施例は花のモジュレート遺伝子(LEAFY)の構成的な発現が開花を促進することを示すものであるが、この系は開花が阻害されるように改変することもできる。例えば、花のモジュレート遺伝子の優性でネガティブのものを構成的に発現することができる。優性でネガティブの突然変異体は、正常な内因性のタンパク質の機能を妨げる活性を有するタンパク質である。即ち、遺伝子の作用を、その構造遺伝子自体またはそのＲＮＡを不活性化することなくブロックすることができる。この戦略は転写因子について成功している(例えば、Attardiら，Proc ． Natl．Acad．Sci．USA，90:10563，1993; Lloydら，Nature，352:635，1991; Lo geatら，EMBO J．10:1827，1991: Mantovaniら，J．Biol．Chem.，269:20340，1 994; Ransoneら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:3806，1990; Richardsonら，Mech．Dev.，45:173，1994; Tsaiら，Genes Dev.，6:2258，1992)。LEAFYタンパク質は転写因子となり得、これは核に局所化してin vitroでＤＮＡに結合することができることによる。同様に、APETALA1を含むその他の花のモジュレート遺伝子の殆どは、MADSＤＮＡ結合ドメインとともに既知の転写因子をコードする( 例えば、Mandelら，Nature，360:273，1992)。上記の開示は本発明を一般的に記載するものである。より完全な理解は以下の具体的な実施例を参照することにより得られるであろう。これらの実施例は説明の目的だけで記載するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例異所性のLEAFY(LFY)発現の効果を研究するため、LFYコード領域がカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)由来の構成的35Sプロモーターの制御下にあるキメラ遺伝子を構築した(Odell，J.T.ら，Nature，313:810，1985)。例示として、キメラ35S::LFY遺伝子をアラビドプシス属(Arabidopsis)及び遠く関連するタバコ植物にT-ＤＮＡ媒介形質転換によってに導入した。他の例は、LFYで形質転換したポプラ木(aspen tree)を示す。トランスジェニック植物において観察された表現型効果は、LFYが花の発生の開始に必要なばかりでなく、十分でもあることを示している。実施例1 形質転換ベクターの構築タバコの形質転換のためにpDW146ベクターを使用した。アラビドプシス属の形質転換のためにpDW151ベクターを使用した。両方のベクターは、シロイヌアラビドプシス属(Arabidopsis thaliana)由来のLEAFY(LFY)遺伝子の全オープンリーディングフレーム(Weigel，D.ら，Cell，69:843，1992)と、開始コドンの21bp上流域と停止コドンの195bp下流域を含む(ｃＤＮＡ配列については、Weigelら，上出参照；受託番号M91208でGenBankに寄託されたゲノム配列)。5'末端に、Bgl2部位をポリメラーゼ連鎖反応により加えた(Saikiら，Science 239:487，1988)。3'末端で、ゲノムScaI部位をクローニング工程において除去し、その直後にpBluescr ipt KS＋クローニングベクターに由来するAsp718部位が続く(図1)。図1は、35S::LFYベクターの構築のためのpDW139の親プラスミドの概略図を示す。LEAFY(LFY)のオープンリーディングフレームには斜線を付す。5'及び3'非翻訳領域は点を付す。 pDW146を構築するため、ベクターの同じ部位を使用して、LFY配列を有している1.5 kb Bgl2/Asp718断片を二成分T-ＤＮＡ形質転換ベクターpMON530に挿入した(Rogersら，Meth．Enzymol.，153:253，1987)。このベクターは、転写開始部位を含む、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの0.3 kb断片を含む発現カセット(Guilleyら，Cell，30:763，1982); Odellら,上出)；いくつかの独特な制限部位を含むマルチリンカー；及びTiプラスミドT-ＤＮＡノパリンシンターゼ遺伝子由来の機能性ポリアデニル化シグナル("3'nos"; [Bevanら，Plant Ce ll，1:141，1983])を含む。 pDW151を構築するために、pDW139のAsp718部位をクレノー酵素で充填し(Sambr ookら，Molecular Cloning 第２版（Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory，1989）、Bgl2リンカーを付加した。得られたBgl2断片を、CaMV35S プロモーター3'nos形質発現カセットを含む形質転換ベクター、pCGN18(Jackら， Cell，76:703，1994)のBamHI部位に挿入した。 YEBの代わりにＬＢ培地(Sambrookら,上出)を使用したことを除いて、上記したような凍結-解凍法を用いて(Hofgen と Willmitzer，Nucl．Acids Res.，16:987 7，1988)、大腸菌から単離したpDW146及びpDW151プラスミドＤＮＡをアグロバクテリウムスメファシエンス株LBA4404(Oomsら，Plasmid，7:15，1982)またはASE( Fraleyら，Biotechnology 3:629，1985)中にそれぞれ形質転換した。実施例2 トランスジェニックタバコ植物の作出トランスジェニックタバコ植物を作出するために、無菌的に成長させたタバコ株Nicotiana tabacum var．Xanthiの葉の切片にLBA4404/pDW146を感染させ、植物を記載されたように再生した(Horschら，Science，227:1229，1985)。形質転換された植物についての選択には200μg/mlのカナマイシンを使用した。カナマイシン耐性の再生された植物を土壌に移し、種子を一次的な形質転換体から採取した。図2は、35S::LFYタバコ植物の早期開花表現型を示す。左のパネルは、無関係な構築物(GUSリポーター伝子に融合したLFYプロモーター)で形質転換した対照植物を示す。中央及び右のパネルは、35S::LFY導入遺伝子を有している2種の独立に誘導されたT₂植物を示す(系146.21，146.26)。示した植物は、5週齢のものである。対照において葉の多量の成長が見られたのに対し、実験植物は頂生花を形成する前に2枚真性葉しか形成しなかったことが指摘される。挿入された写真は、右に示した植物の花の芽の上部外観を示す。芽はまだ開いていない。詳細に分析された32のトランスジェニックタバコ系において、27は一次形質転換体(T₂世代)の子孫で同様の劇的な表現型を示す。トランスジェニック植物は、頂生花を形成する前に、胚の葉（子葉）に加えて、1対だけの真性の葉を形成する(図2)。野生型タバコ植物も頂生花を形成するが、開花の前に20〜25対の葉を形成する。このように、構成的LFY形質発現はシュート分裂組織の花の分裂組織への早熟な転換を引き起こす。トランスジェニック植物の組織学的切片は、頂端分裂組織が、少なくとも発芽後5日の早期に、形質転換されていない植物のものとは形態学的に異なることを示している(図3)。これらの変化の結果、形質転換された植物が2週間後に視覚により観察される花の芽を形成するが、正常なタバコ植物は約3〜5ヵ月後に初めて花をつける(正確な時間は環境的要因、例えば光の強さ、肥料、植物が成長した鉢の大きさ等に依存する)。図3は、35S::LFYタバコ植物における頂端分裂組織の早熟な拡大を示す。パネル(A)は対照であり、図2において記載した無関係な構造物で形質転換されたものである。パネル(B)は実験植物を示し、35S::LFY構築物で形質転換されたものである。植物は発芽の5日後に採取し、固定し、パラフィンに埋め込み、切片にした。三角形は分裂組織の幅を示す。35S::LFY分裂組織側部で生じている葉原基が、対照分裂組織上のものと比較して遅れていることが指摘される。寸法を示す棒は50μmである。 35S::LFYタバコ植物の早熟な花は、器官の実体と器官の数において異常である。花の芽は小さい葉のような器官に囲まれており、花弁は不在であるか、がく片様(sepaloid)である。おしべと心皮は形態上正常であるが、それらの数は野生型とは異なっており、殆どの場合多くなっている。2つの真性の葉の葉腋からは二次シュートも花も発生しないが、偶発的なシュートが胚軸から生じることはあり得る。実施例3 トランスジェニックアラビドプシス属植物の作出 pDW151を減圧浸潤(vacuum infiltration)(Bechto1dら，C.R．Acad．Sci.，316 :1194，1993)によってアラビドプシス属に導入した。生態型Wassilewskija(Ws-O )及びNossen(No-O)の成体のシロイヌアラビドプシス属植物の葉にASE/pDW151を浸潤させ、種子を浸潤した植物から収穫した。50μg/mlのカナマイシンを補充したＭＳ培地(Murashigeと Skoog，Physiol．Plant，15:473，1962)上で種子を成長させた。形質転換した植物は、カナマイシンを含む培地で成長する能力によって同定した。この方法を使用して、27のトランスジェニック35S::LFYアラビドプシス属植物が単離され、その21が本質的に35S::LFYタバコ植物において観察されたものに非常に似た同じ劇的な表現型を示した。形質転換実験には、組織培養より優れた新しい方法とカルスからの植物の再生を利用し、直接トランスジェニック種子の作出を可能とした(Bechtoldら，C.R． Acad．Sci.，316:1194，1993)。この方法においては、成体植物の葉に、T-ＤＮＡプラスミドを有するアグロバクテリウム属細胞の懸濁物を減圧浸潤させた。アグロバクテリウム属細胞を植物中で増殖させると、それらはそこで配偶子生産細胞前駆体を含む宿主細胞へT-ＤＮＡを移す。種子を浸潤した植物から収穫し、抗生物質を含む培地で増殖させて形質転換体を選択した。数百から数千のうちの1 つという少数の種子がT-ＤＮＡで安定に形質転換されていた(単一のアラビドプシス植物は、数千の種子を生産することができる)。アラビドプシス属中の35S::LFY表現型についての以下の説明は、第一世代形質転換体の分析に基づく。これらの形質転換体は種子から生育されたので、組織培養から再生されたものとは異なり、その後の世代において表現型は有意に変化しない。同じ方法により4つの他の構築物を使用して形質転換体を作出したが、いずれも35S::LFY構築物で観察された表現型を生じなかった。図4は、35S::LFYアラビドプシス属植物の早期開花表現型を示す。パネル(A)は対照植物であり、無関係な構築物で形質転換した。ロゼット葉(rl)は子葉(cot) よりかなり大きい。パネル(B)は35S::LFY形質転換体(系151.106)を示す。最初の 2枚のロゼット葉(rl)は子葉より小さい。2つの茎葉(cl)となるようなものとともに小さいシュートが形成された。花芽はまだ開いていない。17日齢の両方の植物をカナマイシン含有培地上で1週間選択したが、これはそれらの発生をいくらか遅らせるようである。図5は、35S::LFYアラビドプシス属植物における全てのシュートの花への転換を示す。パネル(A)は、約6週齢の成熟したアラビドプシス属植物(Nossen生態型) の外観を示す。不確定なシュートが全てのロゼット葉及び茎葉の葉腋から発生していることが指摘される。これらのシュートは花を形成し始める前に2、3の葉を有する。パネル(B)は野生型アラビドプシス花序の上部外観を示し、シュート分裂組織の不確定性を示している。花は、葉序輪生体に発生し、最も若い花が中心に最も近い。パネル(C)〜(E)，35S::LFY植物(Nossen生態型において形成)、3週齢。パネル(C)、単弁花を有する置換シュート(三角形)(系151.201)。子葉を示す (cot)。パネル(D)、主要なシュート上での一次頂生花の発生(1°)、及び茎葉(cl )の葉腋中での２次単弁花の発生(2°)。カールしたロゼット葉(rl)の葉腋から生じている単弁頂生花は、三角形によって示す(系151.209)。パネル(E)、(D)に示した一次及び二次花の異なる角度でのクローズアップ。一次頂生花が異常であることが指摘される。おしべ群(g)は心皮を含み、概ね正常に見える。おしべ(st) の数は減少しており、花弁及びがく片は存在しない。葉、がく片及び心皮様の特徴をもつ単一の最初の旋毛器官をアスタリスクにより示す。 35S::LFYアラビドプシス属植物は野生型植物より早期に開花する。野生型植物における少くとも8枚と比較して2〜5枚のみのロゼット葉しかなく、段階12の花芽は発芽後17日の早期に見られる(図4)。段階12の花の形成に2週間かかるので(S mythら、Plant Cell，2:755，1990)、開花は発芽後2、3日以内に始まらなければならない。これは植物が約2週齢のときにはじめて開花が始まる野生型よりもかなり早い。タバコとは異なり、アラビドプシス属は開いた花序を有し、これは植物が死亡するまでシュート頂端分裂組織が未分化のままであることを意味する。 35S::LFY植物はより早期に開花するだけでなくそれらの主軸も単弁花で終わり、 tfl突然変異体表現型と類似している(図1を参照)。このように、LFYの異所性の発現は、不確定なシュート分裂組織の確定した花の分裂組織への形質転換を引き起こす。tfl突然変異体表現型とは対照的に、一次頂生花が発達する前に正常な側生花は形成されない(図4B及び5D)。35S::LFY植物においては葉の葉腋からさらに頂生花が発生し、二次シュート分裂組織の形質転換も示している(図5C及び5D) 。驚くべきことに、大部分の35S::IFY植物は、野生型の茎葉(茎)に似た１、２枚の葉を有する小さいシュートを形成する(図4B及び5D)。比較のため、図5Aに全ての葉の葉腋から生じている不確定なシュートを有する成熟したアラビドプシス属植物の正常な構造を示す。早期開花表現型及びシュートの花分裂組織への形質転換は、LFY活性が分裂組織の実体を決定するのに十分であることを示している。しかし、シュート分裂組織が花の分裂組織に変換される前に葉を形成するので、シュート分裂組織が発芽の直後にLFY活性に応答することを妨げる別の因子があるようである。 35S::LFY植物は、栄養発生のロゼット相をスキップすると思われる胚花(emf) 突然変異体(Sungら，Science，258:1645-1647，1992)を含む、アラビドプシス属について記載された他のどの早期開花突然変異体よりも早く開花するようである。残念ながら、emf突然変異体における開花開始の正確な時間は報告されていないが、Sungら(上出)により示されたデータによれば、植物が少くとも9日齢になるまでは花の原基が形成されず、emf突然変異体が35S:LFY表現型とは異なるものであることが示されている。emf突然変異体は発芽後に休止し、その後花序の形成に直接進むようである。個々の35S::LFYアラビドプシス属植物の表現型そのものは変化する。観察された大部分の花は野生型の花と実質的に同一である(図5D及びE)。さらに分析するのに非常に重要なことは、おしべと雌しべとに受精能力があることである。外部器官が葉状であることまたは不在であり花弁が減少していることにおいて、主要な頂生花が異常であることが多く、これは35S::LFYタバコ植物の頂生花において見られた効果に似ている(図5E)。さらに、心皮は融合していないものであり得、おしべの数は６である野生型の数より低くなり得る。アラビドプシス属からのLEAFY遺伝子がタバコにおける開花を改変することができるという所見は、LEAFY機能のモードが顕花植物において十分に保存されており、アラビドプシス遺伝子が多種多様な顕花植物で機能する可能性があることを意味している。アラビドプシス属とタバコとは、双子葉植物綱において2つの非常に異なる亜綱に属している。アラビドプシス属は、サルナシ亜綱(Dilleniid ae)内のフウチョウソウ目(Capparales)に属しているアブラナ科(Brassicaceae) 内の属である。タバコ(Nicotiana tabacum)は、キク亜綱(Asteridae)のナス目(S olanales)内のナス科(Solanacea)に属している。サルナシ亜綱は、離弁花亜綱(M agnoliidae、双子葉植物の最も原始的な亜綱)に密接に関係がある。これに対し、キク亜綱(Asteridae)は双子葉植物の最も進んだ亜綱である(Cronquist，A.，A n Integrated System of Classification of Flowering Plants，1981（New Yor k: Columbia University Press)。アラビドプシス属とタバコとが属している2つの科、アブラナ科とナス科は、経済的重要性が高い大きな科である(Heywood，V.H.（Flowering Plants of the World，1993，(New York: Oxford University Press))。アブラナ科の範囲内の主要な作物は、脂肪種子ナタネ、キャベツ及びその近親類、例えば、アブラナ属の植物、カリフラワー、ブロッコリー、中国キャベツ等である。ナス科は、人類に役立っている最も重要なものの一つであり、ジャガイモ、トマト、ナス、パプリカ、唐辛子、ピーマンのような多くの重要な野菜及び果実を包含する。最近の研究により、アラビドプシス属の花のモジュレート遺伝子に近い同族体が単子葉植物中に存在することが明らかにされている。例えば、APETALA1及びLE AFY遺伝子の同族体がトウモロコシにおいて同定されている(Veitら，Plant Cell ，5:1205，1993; Weigelと Meyerowitz，In Molecular Basis of Morphogenesis ，pp91-105，1993，(New York: Wiley-Liss)。実施例4 ポプラシュートの変換 LFYの構成的な発現がアラビドプシス属の栄養相の間に早熟な開花を誘発することができることから、他の種についても同様に調べた。構成的なLFY発現の効果を、多年生木で、天然では８〜20年後にのみ開花する親種由来の親木、雑種ポプラで調べた(Schreiner，E.J.，in USDA Agriculture Handbook，450: Seeds o f Woody Plants in the United State（Schopmeyer，C.S.編）pp．645-655（U.S .Government Printing Office，Washington D.C.，1974）。35S::LFYポプラ植物は、茎分節のアグロバクテリウム属媒介形質転換とその後の組織培養中でのトランスジェニックシュートの再生によって得た(Nilsson，O.ら，Transgen．Res.， 1:209，1992)。雑種ポプラはこれまでに記載されたようにして形質転換した(Nilsson，O.ら，上出)。ノーザンブロット分析により測定されたLFY ＲＮＡ発現のレベルは35S:: LFYアラビドプシス属のものに近いものであった。栄養葉の数は、異なる再生シュートの間で変化した。栄養葉のより多い数を有するものは根を形成し、温室に移動できた。個々の花を温室に移した一次形質転換体、または増加穴開け機で地面から1.5 mのレベルから抜いたコアの年輪を数えることにより樹齢を決定した木から、Carlshem(Umea(スウェーデン))で1995年の春に集めた尾状花序から取った。花をホルムアルデヒド/酢酸/エチルアルコールに固定し、写真を取る前にエチルアルコールで清浄にした。図6は、アラビドプシス属LFYの構成的発現がポプラシュートを花に変換することを示している。パネルa及びbは、組織培養で成長した５月齢の雑種ポプラ(Pop ulous tremula x tremuloides)のシュートを示す。パネルaは35S::LFY形質転換体を示す。葉の葉腋における孤立側方花(lf)及び異常な頂生花(tf)を示す。パネルbは非トランスジェニック対照を示す。矢印は葉の葉腋を示し、ここから通常は次の年に側方栄養シュートが出てくる。組織培養から再生されたポプラ植物は、最初の成長サイクルの間に種子から成長した植物と同じ幼体表現型を示すことが指摘される(Nilsson，O.,上出)。パネルCは、温室へ移した７月齢35S::LFY形質転換体の葉腋において形成された孤立雄花の拡大した外観である。パネルdは、パネルeにおいて示した野生型尾状花序から取った雄花の拡大した外観を示す。包葉(b)が野生型花を有していることが指摘される。パネルeは、雑種ポプラの親種のうちの1つであるP．tremulaの15年齢の木から取られた雄尾状花序のクラスターを示す。約中の赤い色素が見える。寸法を示す棒はa，b，5 mm; c，d，1 mm ; e，20 mmである。 35S::LFYポプラシュートを再生することにより、正常な葉の葉腋において孤立花が最初に形成した(図6a，e)。しかし栄養葉の数は限定されており、シュート分裂組織は異常な頂生花の形成において未成熟な状態で消費される(図6a)。非トランスジェニック対照ではそのような効果が観察されなかったことから(図6b)、早熟な花の発生は35::LFY形質転換体に特異的である。さらに、スウェーデン大学農学部で過去6年間に種々の構築物により生成されたトランスジェニックポプラの1,500以上のその他の系では早熟な花の発生が一つも見られなかった(Nilsso n O.ら，1992,上出; Nilsson，O．博士論文，Swedish University of Agricultu ral Sciences，1995)。野生型アラビドプシス属とポプラとはかなり異なり、一方は草本であり、もう一方は木であるが、35S::LFYポプラの全体的表現型は35S::LFYアラビドプシス属のものに非常に似ている。両方の種の野生型植物において、通常は花は花序シュート上の側位において形成される。ポプラにおいては、これらの花序シュートは尾状花序と呼ばれ、成体の木の葉腋から生じる(図6d，e)。35S::LFYアラビドプシス属と35S::LFYポプラの両方において、栄養葉の葉腋においてシュートの代わりに孤立花が形成される。またアラビドプシス属におけるのと同様に、トランスジェニックポプラの二次シュートは一次シュートよりもさらに激しく影響を受ける。ポプラ(poplar)からの明白なLFYオルトログが記載されており(Strauss，S.H. ら，Mole．Breed，1:5，1995)、これはタバコLFYと同様に(Kelly，A.ら，Pl．Ce ll,7:225，1995)、栄養段階の間にすでに発現される。栄養発現は、LFY活性がこれらの種において花の発生を誘導するのに十分でないことを示唆し得るが、ポプラ(poplar)と同じ属のものであるアスペン(aspen)における今回の結果は、35S:: アラビドプシス属LFY構築物で形質転換されたときに非常に早期に開花するタバコに拡張される所見(実施例１〜３を参照)にはあてはまらないことが示されている。これらの種における35S::LFYの効果についての1つの可能な説明は、導入遺伝子が内因性の遺伝子より高い有効なレベルで中で発現されるということである。タバコにおいては、シュート分裂組織(これは最終的に花の分裂組織に変換されて頂生花を形成する)の中央の内因性の遺伝子の発現は比較的低く(Kelly，A.J .ら，上出)、AP1のようなその他の遺伝子が非トランスジェニックタバコ中の花の分裂組織実体の主要なレギュレーターであると考えられる。実施例5 APETALA1 によるLEAFY活性の媒介 LFYに加えて、遺伝子AP1、CAL、APETALA2(AP2)及び非通常花器官(UFO)における突然変異がアラビドプシス属の花の分裂組織の実体に影響することが知られているが(Mandel，M.A.ら，Nature，360：273，1992; Irish，V.F．& Sussex I.M. ，Pl．Cell，2:741，1990; Jofuku，K.D.ら，Pl，Cell，6，1994; Levin J.Z．& Meyerowitz，E.M．Pl．Cell 7:529，1995)、lfy突然変異が一般的に最も強い作用を有し、これだけが少くとも2、3の花からシュートへの完全な形質転換を定常的に引き起こすものである。全ての5つの遺伝子における突然変異も花の器官の実体に影響を及ぼすが、分裂組織の実体及び器官の実体の欠陥は、少くともある場合においては、分離可能である(Bowman，J.L.ら，Development，119:721，199 3; Jack，T.ら，Cell，76:703，1994)。何らかのその他の遺伝子が35S::LFYの効果を分裂組織の実体に媒介するのに必要であるかを調べるため、あるいは、それらの不活性化が35S::LFY花の花器官の実体に単に影響するだけであるかどうかを調べるため、35S::LFY導入遺伝子を種々の突然変異体バックグラウンドに交配した。 35S::LFY形質転換体(系DW151.117，Wassilewskija生態型)を、ap1-1(Landberg erecta生態型)(Irish，F.V．& Sussex，I.M．Pl Cell 2:741，1990)に交配した。トランスヘテロ接合体F₁子孫をap1-1に戻し交雑するか、自家受精させた。自家受精したF₂子孫のcal遺伝子型は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって決定した(Kempin，S.A.ら，Science，267:552，1994)。図7は35S::LFY表現型が、ap1突然変異によって部分的に抑制されることを示す。パネルaは、erecta突然変異を有する５週齢植物を示す。35S::LFY AP1⁺植物(左) は、細長い一次シュートを持たない。一次シュートは、35S::LFYap1植物においてよく発生したが（中央）、一次シュートはやはり未成熟な状態で終わり、非トランスジェニックap1植物(右)のものより短い。パネルb〜dは、35S::LFYap1植物の詳細な外観を示す。パネルbは、パネルaで矢印によって示した側生シュートの拡大した外観を示す。パネルcは、ロゼット葉の葉腋に出てきているシュートを示す。パネルdは、頂生花(tf)を有する一次シュートの上部外観を示す。パネルc 及びdは４週齢植物からのものである。ap1効果は、cal-1突然変異によってさらに増強されるが、35S::LFYap1表現型に質的な変化はない。 ap2-1、ap2-2及びufo-2突然変異は、付加的表現型のみを引き起こし、35S::LF Y植物におけるシュートから花への転換には有意に影響を及ぼさなかった。これに対し、ap1-1突然変異は、35S::LFY表現型を顕著に抑制したが、頂生花はやはり形成された(図7)。一次及び二次シュートの両方が影響を受けたが、最も強い効果は側位において観察された(図7b，c)。35S::LFYAP1⁺植物のロゼット葉の葉腋において発生する孤立花は、35S::LFY ap1植物においては平均で10の節を有する複合シュートになる(図7c)。これらの観察により、LFYがAP1(lfy突然変異体で早期に生じる花においては活性化されなかった)を誘発できることが確認されただけではなく、LFYとAP1との組み合わさった活性が、シュート分裂組織を花の分裂組織に形質転換することにおいてLFY単独の活性よりも有効であることも確認された。総合すると、これらの結果により、花の分裂組織実体の遺伝子に応答する能力は徐々に獲得されることが示唆される。幼体分裂組織においては、反応能は低いようであり、シュートの発生よりも花の発生を促進するためにはLFY及びAP1の両方が必要である。反応能は生活環において後に増加し、花の発生を誘発するのに LFY単独で十分になる。まとめ本発明は、LFYまたはAP1のような単弁花分裂組織実体遺伝子の構成的な発現が、短命な草本であるアラビドプシス属と多年生の木であるポプラのような異なる植物において早熟な花の発生を誘発することができることを示している。この結果は花の発生と花の誘導との理解に寄与するだけではなく、より短い開花時間は世代時間を短縮し、繁殖プログラムを加速することを可能とするので、興味深くもある。現代の作物品種は育種による継続的な改良の結果であり、2つの最近開発された技術が育種をさらにより重要なものにしている。最初の技術は分子マッピングであり、これにより所望の形質をコードしている遺伝子をゲノム中で迅速に配置することができる。農業上重要な品種へのそのような形質の導入は、これらの形質の実際の発現について試験する代わりに、現在では結合した分子マーカーをモニターすることによって大いに助力されている。二番目の技術は、設計された病原体耐性のような種々の形質を与える雑種遺伝子による植物の形質転換である。しかし容易に形質転換できる植物品種の数が限定されることが多く、導入遺伝子を所望のバックグラウンドに移入するのに大規模な戻し交雑が必要であるので、この領域における進歩は遅れていた。いずれの場合においても、マーカーを使用した育種及び導入遺伝子移入、早熟な開花の誘導による世代時間の短縮は有用であろう。これまでの記載は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実際に、当業者は、本明細書で教示に基づいて過度の実験をすることなく容易に別の態様を考え実施することができるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ゲノム中に少なくとも１の異種核酸配列を含み、モジュレートされた花の分裂組織の発生を示すことを特徴とする遺伝子改変植物。２．モジュレートが発生の促進である請求項1記載の植物。３．モジュレートが発生の阻害である請求項1記載の植物。４．核酸配列が、機能を発揮するようにプロモーターに結合した少くとも1の構造遺伝子からなる核酸配列を含む請求項1記載の植物。５．構造遺伝子がLEAFYタンパク質またはその相同体をコードする請求項4記載の植物。６．APETALA1タンパク質またはその相同体をコードする構造遺伝子をさらに含む請求項5記載の植物７．構造遺伝子がAPETALA1タンパク質またはその相同体をコードする請求項4記載の植物。８．プロモーターが構成的プロモーターである請求項4記載の植物。９．プロモーターが誘導可能なプロモーターである請求項4記載の植物。 10．核酸がさらに選択可能なマーカーを含む請求項4記載の植物。 11．植物が双子葉植物である請求項1記載の植物。 12．植物が単子葉植物である請求項1記載の植物。 13．請求項1記載の植物から得た植物細胞。 14．請求項1記載の植物から得た植物組織。 15．ゲノム中に少なくとも１の異種核酸配列を含み、モジュレートされた花の分裂組織の発生を示すことを特徴とする植物へと発芽して生育する種子。 16．機能を発揮するようにプロモーターに結合した、花の分裂組織発生をモジュレートするタンパク質をコードしている少くとも1の構造遺伝子からなる核酸配列を含むベクター。 17．ベクターが、T-ＤＮＡ由来のベクターからなる請求項16記載のベクター。 18．構造遺伝子がLEAFYタンパク質をコードする請求項16のベクター。 19．APETALA1タンパク質をコードする構造遺伝子をさらに含む、請求項18記載のベクター。 20．構造遺伝子がAPETALA1タンパク質をコードする請求項16記載のベクター。 21．プロモーターが構成的プロモーターである請求項16記載のベクター。 22．プロモーターが誘導可能なプロモーターである請求項16記載のベクター。 23．プロモーターが化学的手段により誘導される請求項22記載のベクター。 24．早期の花の分裂組織の発生を示すことを特徴とする遺伝子改変植物を作出する方法であって、モジュレートされた花の分裂組織の発生のためのタンパク質をコードする少なくとも１つの構造遺伝子からなる核酸配列を含むベクターと植物細胞とを接触させる工程と（ここで前記遺伝子は機能を発揮するようにプロモーターに結合して形質転換植物細胞を得ることができる）、前記形質転換植物細胞から植物を作出する工程と、そして、前記の早期の花の分裂組織の発生を示す植物を選択する工程とを備える前記方法。 25．接触工程が物理的手段によるものである請求項24記載の方法。 26．接触工程が化学的手段によるものである請求項24記載の方法。 27．植物細胞が、プロトプラスト、配偶子産生細胞及び完全な植物に再生する細胞からなる群から選択される請求項24記載の方法。 28．プロモーターが構成的プロモーターである請求項24記載の方法。 29．プロモーターが誘導可能なプロモーターである請求項24記載の方法。 30．請求項24記載の方法により作出された植物。 31．請求項24記載の方法により作出された植物から得た植物組織。 32．植物細胞における花の分裂組織の発生をモジュレートする方法であって、植物細胞を請求項16記載のベクターと接触させて形質転換植物細胞を得る工程と、前記形質転換植物細胞を植物成長条件下で成長させる工程と、そして早期の花の分裂組織の発生を誘導するのに十分な条件と時間の下で、植物において早期の花の分裂組織の発生を誘導する工程とを備える前記方法。 33．ゲノム中に花の分裂組織実体タンパク質をコードする少なくとも１の異種核酸配列を含み、花の分裂組織の発生が阻害されていることを特徴とする遺伝子改変植物。