CN115044575A - 一种高效杜松烯合成酶变体及其基因元件 - Google Patents

一种高效杜松烯合成酶变体及其基因元件 Download PDF

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强耀锋
李庆廷
张鹏
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Abstract

本发明提供一种高效杜松烯合成酶变体及其基因元件，属于酶工程领域。其氨基酸序列为序列1，氨基酸序列1中存在以下任一突变：P29K，W256P,D311S，F458P，I469L。本发明提供了更加高效的杜松烯合成酶及其基因元件。

Description

一种高效杜松烯合成酶变体及其基因元件
技术领域
本发明设计一种高效杜松烯合成酶变体及其基因元件，属于酶工程领域。
背景技术
杜松烯是一种在植物，特别是精油类植物中广泛含有的倍半萜类化合物，其天然存在于杜松、丁香、烟草、树棉、青蒿、茶叶、玫瑰、紫茎泽兰等等。杜松烯其具有新鲜的木质香气和草本香气，其是红茶、绿茶、松油、玫瑰精油丁香油、白兰叶油等许多香料原料中的重要萜类香气物质。但从生理机制上说，杜松烯是植物细胞自身进化过程中发展出的抗虫防御素，只有在发生食草动物及节肢动物照成的植物机体损伤诱导条件下，才会短时提高表达水平，在正常条件下植物细胞中表达量与丰度均极低，因此其难以从天然的植物来源进行规模化富集及提纯(DOI:10.1111/nph.16925)。
因此，利用合成生物学手段，将杜松烯合成途径转入酵母、大肠杆菌等工程菌株平台中，通过生物发酵方式生产被认为是稀有萜类合成的新的来源方法。萜类化合物的生物通用前体合成途径有两条，一条是甲基磷酸赤藓糖途径(MEP，Methyl-D-Erythritol-4-Phospha Pathway)，另一条是MVA途径(MVA，Mevalonate Pathwayba)，这两条途径都能提供萜类化合物最关键的前体代谢物异戊烯焦磷酸(IPP)，并且在此基础上进一步形成倍半萜类的共同直接前体法尼基焦磷酸(FPP,Farnesyl Pyrophosphate)
(DOI:10.1016/j.ymben.2017.08.005)。然后再经由共同前体法尼基焦磷酸通过不同的倍半萜合成酶合成各色各样的倍半萜化合物。因此，在倍半萜生物合成领域中，一个高效的合成萜类前体戊烯焦磷酸或者法尼基焦磷酸的底盘细胞，以及获得一个高效的特定倍半萜合成酶基因元件。通过以上两部分的的组合，即可以获得可合成特定倍半萜的微生物细胞工厂。然后，在现有技术中，已经发现的杜松烯合成酶其催化效率比较低，已经成为了杜松烯生物合成的限速步骤了。
因此，本发明意在通过人工设计和组合突变方式提供一种更加高效的杜松烯合成酶及其基因元件。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种高效杜松烯合成酶变体及其基因元件，以解决现有技术的上述技术问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种高效杜松烯合成酶变体，其氨基酸序列为序列1，氨基酸序列1中存在以下任一突变：P29K，W256P,D311S，F458P，I469L。
作为优选的，所述的杜松烯合成酶变体为同时具有P29K，W256P，F458P三种的组合突变体。
更为优选的，所述的杜松烯合成酶变体同时具备P29K，W256P,D311S，F458P，I469L五种组合突变。
本发明专利申请还提供一种高效杜松烯合成酶变体的基因元件，其具有包含P29K，W256P,D311S，F458P，I469L任一突变的氨基酸序列1所对应的核苷酸基因序列片段。
作为优选的，所述的杜松烯合成酶变体的基因元件，同时具有P29K，W256P，F458P突变的组合突变体任一突变的氨基酸序列1所对应的核苷酸基因序列片段。
本发明所提供的杜松烯合成酶Cad1的原始基因来源于木棉(Gossypiumhirsutum)，所述的杜松烯合成酶Cad1，其蛋白氨基酸序列如序列1所示，共554个氨基酸，该基因序列也可以从NCBI基因数据库中获得(NCBI Reference Sequence:NP_001313854.1)。
本发明通过人工设计和组合突变方式提供一种更加高效的杜松烯合成酶及其基因元件。
附图说明
图1法尼基焦磷酸通过杜松烯合成酶Cad1催化形成杜松烯
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例进一步阐述本发明的技术特征。
实施例1Cad1重组酶的表达与提纯
将氨基酸序列1，按照大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，同时在优化后的杜松烯合成酶基因序列的尾端融合了His-tag蛋白标签基因序列片段(参照DOI：10.1590/S0100-879X2004000800001，所述的融合标签添加方式)，然后合成并亚克隆至大肠杆菌表达载体pET30a(+)，形成pET30a-Cad1表达质粒，并被转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)pLysS((Novagen)中。Cad1酶蛋白的表达通过添加1mM异丙基硫代-β-半乳糖苷添来诱导酶的表达。在诱导表达之后，重组杜松烯合成酶基因蛋白利用亲和色谱柱进行富集与纯化(His-Tag Protein Purification Column(Pre-packed,5x 5ml)，AminTrap，Abcam公司生产)。
实施例2Cad1酶突变体的构建与表达
Cad1酶突变体的点突变采用经典的Site Directed Mutagenesis法进行定点突变(参考：史坦福大学手册Site Directed Mutagenesis Protocol(AML Version 1.2)，https://web.stanford.edu/～loening/protocols/Site_Directed_Mutagenesis.pdf)。定点突变位点的引物设计则按照自动化突变位点引物设计网站(http://bioinformatics.org/primerx)的操作说明及步骤设计突变位点的反向引物，突变PCR采用翌圣生物的Hieff
Figure BDA0003714116980000041
快速克隆技术的定点突变系统试剂盒及说明书所记录的扩增步骤，对实施实例1中所构建的pET30a-Cad1表达质粒进行定点突变扩增，获得定点突变后pET30a-Cad1。组合突变的构建则是在一个突变位点的基础上按照上述方法进一步构建下一个突变位点(步骤参照：L Zheng,U Baumann,and JL Reymond.An efficient one-stepsite-directed and site-saturation mutagenesisprotocol.Nucl.Acids Res.,32:e115,2004.)。所有突变酶均按照实施实例1转化入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)pLysS中进行表达，并用利用亲和色谱柱进行富集与纯化备用。
实施例3重组酶的酶活测定
所有Cad1重组酶及其突变体重组酶的酶活测试反应缓冲体系为：25mM HEPES-Na盐，pH 7.5、15mM MgCl 2和5mM DTT，反应体积为1mL。以1g/L FPP mM铵盐，作为反应底物，加入50mg重组酶，反应1h后，加入50mM EDTA 50μL终止反应，通过LC-M/MS以外标法对反应生成的杜松烯进行量化测量，结果如表2.1所示。
表3.1所构建的突变酶及其酶活(负突变仅列举部分)
Figure BDA0003714116980000051
实施例4组合突变重组酶的酶活
按照实施实例2所述方法构建，由若干个阳性突变组成的组合突变，在重组酶表达后，按照实施实例3所诉酶活测定方法进行酶活测定。其结果如表4.1所示。
表4.1组合突变酶活检测结果
Figure BDA0003714116980000052
Figure BDA0003714116980000061
Figure BDA0003714116980000071
Figure BDA0003714116980000081
序列表
<110> 上海龙殷生物科技有限公司
<120> 一种高效杜松烯合成酶变体及其基因元件
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 554
<212> PRT
<213> 木棉(Gossypium hirsutum)
<400> 1
Met Ala Ser Gly Val Ser Gly Met Pro Ser Ser Ser Pro Leu Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Met Ala Pro Leu Ala Ala Pro Gly Pro Ser Ile Thr
20 25 30
Gly Ala Pro Pro Leu Ala Cys Pro Ala Leu Ala Ile Ala Ala Gly Thr
35 40 45
Gly Leu Ala His Gly Gly Leu Leu Gly Gly Val Ala Leu Met Ile Val
50 55 60
Ala Pro Met Ala Ala Ser Thr Leu Leu Leu Ala Pro Ile Ala Ser Val
65 70 75 80
Gly Gly Leu Gly Val Ser Thr His Pro Thr Leu Gly Ile Gly Ala Gly
85 90 95
Leu Gly Ala Ile Thr His Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Leu Thr
100 105 110
Thr Thr Ser Leu Ala Pro Ala Leu Leu Ala Gly His Gly Pro His Val
115 120 125
Ser Cys Ala Val Pro Ala Leu Pro Leu Ala Gly Gly Gly Ala Pro Leu
130 135 140
Ser Ser Val Thr Ser Ala Val Ala Gly Leu Leu Gly Leu Thr Gly Ala
145 150 155 160
Ser Thr Leu Ala Val His Gly Gly Ala Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ser
165 170 175
Pro Thr Ser Ala His Leu Ser Leu Ala Val Ala Ser Leu Ala His Pro
180 185 190
Leu Ser Gly Gly Val Ser His Ala Leu Leu Gly Ser Ile Ala Ala Gly
195 200 205
Leu Pro Ala Val Gly Ala Ala His Thr Leu Ser Val Thr Gly Ala Ile
210 215 220
Gly Ser His Ala Leu Val Leu Leu Gly Pro Ala Leu Ile Ala Pro Ala
225 230 235 240
Met Val Gly Leu Leu His Ala Leu Gly Leu Ser Gly Ile Ser Ala Thr
245 250 255
Thr Leu Ala Leu Ala Pro Gly Ala Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Ala
260 265 270
Val Val Gly Gly Thr Pro Thr Ile Ser Gly Val Thr Pro Gly Pro Gly
275 280 285
Thr Ser Leu Gly Ala Leu Met Leu Thr Leu Val Ile Ala Met Ala Ser
290 295 300
Ile Val Ala Ala Thr Thr Ala Ser Thr Ala Thr Thr Gly Gly Leu Ile
305 310 315 320
Pro Thr Thr Ala Ala Ile Gly Ala Thr Ala Ile Leu Cys Ile Ala Gly
325 330 335
Leu Pro Gly Thr Met Leu Pro Ser Thr Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr
340 345 350
Gly Gly Met Gly Gly Leu Val Ala Gly His Gly Ala Gly Thr Ala Val
355 360 365
Gly Thr Ala Leu Ala Ala Met Ile Ala Leu Ala Gly Ser Thr Leu Val
370 375 380
Gly Ala Ala Thr Thr Leu Gly Ala Thr Leu Pro Ser Pro Gly Gly Pro
385 390 395 400
Leu Ala Ala Ala Leu Pro Thr Cys Gly Thr Ala Met Leu Ala Ile Thr
405 410 415
Ser Pro Val Gly Met Gly Ala Ile Val Thr Pro Gly Thr Pro Leu Thr
420 425 430
Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ile Ile Gly Ala Ser Thr Ile Ile Cys Ala
435 440 445
Pro Met Ala Ala Val Thr Gly His Leu Pro Leu His Ala Ala Gly Ala
450 455 460
Ala Cys Ser Ala Ile Gly Cys Thr Met Gly Gly Thr Gly Val Thr Ala
465 470 475 480
Gly Gly Ala Thr Ala Val Pro Ala Leu His Val Gly Ser Ala Thr Leu
485 490 495
Ala Val Ala Gly Gly Pro Leu Leu Pro Thr Gly Met Pro Thr Gly Val
500 505 510
Leu Ala Ala Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Met Ala Val Leu Thr Ala
515 520 525
Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Val Gly Leu Ala Ala Leu Gly Gly Ile
530 535 540
Thr Ser Leu Leu Ile Gly Pro Ile Ala Leu
545 550

Claims (6)

1.一种高效杜松烯合成酶变体，其特征在于：其氨基酸序列为序列1，氨基酸序列1中存在以下任一突变：P29K，W256P,D311S，F458P，I469L。
2.根据权利要求1所述的一种高效杜松烯合成酶变体，其特征在于：所述的杜松烯合成酶变体为同时具有P29K，W256P，F458P三种的组合突变体。
3.根据权利要求1所述的一种高效杜松烯合成酶变体，其特征在于：所述的杜松烯合成酶变体同时具备P29K，W256P,D311S，F458P，I469L五种组合突变。
4.权利要求1-3任意之一所述高效杜松烯合成酶变体，其特征在于：本发明所提供的杜松烯合成酶Cad1的原始基因来源于木棉(Gossypium hirsutum)，所述的杜松烯合成酶Cad1，其蛋白氨基酸序列如序列1所示，共554个氨基酸，该基因序列也可以从NCBI基因数据库中获得(NCBI Reference Sequence:NP_001313854.1)。
5.一种高效杜松烯合成酶变体的基因元件，其特征在于：具有包含P29K，W256P,D311S，F458P，I469L任一突变的氨基酸序列1所对应的核苷酸基因序列片段。
6.根据权利要求5所述的一种高效杜松烯合成酶变体的基因元件，其特征在于：同时具有P29K，W256P，F458P突变的组合突变体任一突变的氨基酸序列1所对应的核苷酸基因序列片段。
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