CN113308454A

CN113308454A - 一种茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS及其的编码产物和应用

Info

Publication number: CN113308454A
Application number: CN202110564366.1A
Authority: CN
Inventors: 查良平; 彭华胜; 单婷玉; 吴君贤; 徐睿; 尹旻臻
Original assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Current assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2041-05-24
Also published as: CN113308454B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种茅苍术倍半萜合酶基因Alβ‑FS及其的编码产物和应用，该基因的cDNA长度为1647bp，编码548个氨基酸，蛋白分子量大小为63.56KDa。本发明所提供的Alβ‑FS基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。通过构建pET21a‑Alβ‑FS原核表达载体，在大肠杆菌体内验证Alβ‑FS的催化功能，结果证明Alβ‑FS酶具有催化合成β‑法尼烯的功能。茅苍术萜类合酶基因Alβ‑FS是茅苍术倍半萜生物合成途径关键酶，为明确茅苍术倍半萜成分生物合成途径的分子机制奠定基础。

Description

一种茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS及其的编码产物和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS及其的编码产物和应用。

背景技术

茅苍术Atractylodes lance(Thunb.)DC.系菊科苍术属多年生草本植物，2020年版《中国药典》记载茅苍术的干燥根状茎做苍术入药，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目的功效。茅苍术可用于治疗湿阻中焦、风湿痹病、眼目昏涩等，为中医常用药材之一。茅苍术在中国分布广泛，主产于江苏、安徽、湖北、河南、四川、山东等地区。江苏茅山地区为其历史道地产区，以产于茅山一带质量最优，茅苍术之名由此而来。

现代药理研究表明，茅苍术具有治疗胃溃疡、抗炎、抗病毒、保肝、降血糖等多种生物活性。茅苍术全株都具有挥发性成分，但主要积累在根状茎中，其功效与挥发油成分密切相关。茅苍术中的化学成分复杂多样，包括倍半萜类及苷类、聚乙炔烯类、三萜类、有机酸类、多糖等。其中倍半萜类主要包括茅术醇、苍术酮、β-桉叶醇、β-石竹烯、β-法尼烯等，聚乙炔烯类则主要为苍术素等。

萜类化合物是茅苍术中重要的一类次生代谢产物，倍半萜合酶(sesquiterpenesynthase,)是催化萜类化合物生物合成过程的关键酶。因此研究茅苍术萜类合酶基因的功能及其序列特征，为初步揭示茅苍术萜类合酶基因的生物学功能，为进一步探索茅苍术倍半萜的生物合成机理奠定基础。

鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。

发明内容

本发明的目的在于研究茅苍术倍半萜合酶基因在茅苍术挥发性产物合成过程中的功能，提供了一种茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS及其的编码产物和应用。

为了实现上述目的，本发明公开了一种茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还公开了这种茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS编码的产物，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还公开了上述茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS的特异性引物，包含如SEQ IDNo.3所示的上游引物，以及如SEQ ID No.4所示的下游引物。

本发明还公开了上述茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS的重组表达载体，所述重组表达载体为pET-21a-Alβ-FS。

本发明还公开了上述茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS在制备倍半萜类化合物中的应用，包括在细胞中转入所述茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS，在宿主细胞中表达茅苍术倍半萜合酶，茅苍术倍半萜合酶促进倍半萜类化合物的合成。

所述倍半萜类化合物为β-法尼烯。

与现有技术比较本发明的有益效果在于：本发明所提供的茅苍术萜类合酶基因Alβ-FS是首次从茅苍术植物种克隆制备所得。茅苍术萜类合酶(Alβ-FS)是茅苍术倍半萜合成途径的关键调控基因，可用于调节茅苍术的β-法尼烯含量，该酶可以应用于以法尼基焦磷酸(FPP)为底物制备鲨烯的通路。利用本发明所提供的基因可以通过基因工程技术提高茅苍术药效成分β-法尼烯的含量该技术可以用于后续通过菌体系中大量产生β-法尼烯，对于满足β-法尼烯面临的巨大市场需求提供有效方法。

附图说明

图1为茅苍术萜类合酶基因Alβ-FS的琼脂糖凝胶电泳图；

图2～5为茅苍术萜类合酶基因Alβ-FS结构功能域预测分析；

图6为茅苍术萜类合酶基因Alβ-FS系统进化树；

图7为Alβ-FS蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；

图8为Alβ-FS蛋白催化FPP产物的总离子流图；

图9为Alβ-FS蛋白催化FPP产物保留时间27.061min峰的质谱图

图10为β-法尼烯(β-Farnesene)标准品离子流图；

图11为为β-法尼烯(β-Farnesene)标准品质谱图。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

一、茅苍术Alβ-FS基因的克隆

依据茅苍术转录组中Alβ-FS序列设计引物，以茅苍术cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系如下：TransStartFastPfu DNA聚合酶1μL，5×Buffer 10μL，dNTP(2.5mmol/L)4μL，模板cDNA 1μL，引物各1μL，无菌水32μL。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环后72℃延伸5min，4℃保存。获得茅苍术Alβ-FS基因克隆，茅苍术萜类合酶基因Alβ-FS的琼脂糖凝胶电泳如图1所示，目的基因Alβ-FS片段大小约为1700bp，符合预期，其中，M：Marker，泳道1：目的基因。

二、茅苍术Alβ-FS基因的生物信息学分析

本发明所获得的茅苍术萜类合酶基因全长cDNA，Alβ-FS基因的开放阅读框(ORF)的长度为1647bp，如SEQ ID No.1。根据Alβ-FS全长cDNA编码548个氨基酸，如SEQ ID No.2。将Alβ-FS基因序列用NCBI数据库中的BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDStranslation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基酸水平上与其他物种中的FS有较高的同源性，同时具有典型的Isoprenoid_Biosyn_C1superfamily结构域，如图2所示。Alβ-FS蛋白主要由β-螺旋结构组成，如图3所示。Alβ-FS无跨膜结构存在，为膜外蛋白，如图4所示。以4gax.1.A为蛋白模型，Alβ-FS蛋白序列的相似性为60.18％，如图5所示。利用MEGA6.0软件采用邻接法对Alβ-FS氨基酸序列构建系统进化树，如图6所示，显示茅苍术Alβ-FS基因与菊科洋甘菊(Matricaria chamomilla)terpene synthase 1基因亲缘关系较近。

三、茅苍术Alβ-FS的原核表达体系构建

1、选取BamHI作为酶切位点，对Alβ-FS和pET21a载体进行限制性酶切及连接反应，构建pET-21a-Alβ-FS基因表达载体；

2、分别将pET21a空载体和pET21a-Alβ-FS转化至大肠杆Transetta(DE3)的感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基中筛选阳性克隆。挑选阳性单克隆菌落并接种于含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，培养过夜；再将培养液按1:50进行扩大培养，待菌液OD₆₀₀达到0.4-0.6之间时，加入0.4mM的IPTG，于16℃摇床中避光诱导24h，转速设置为200r/min，得到大量表达的茅苍术萜类合酶Alβ-FS的菌液。

3、将诱导表达的菌液在4℃条件下5000×g离心10min，弃去上清，加入5mL BufferA重悬，5000×g离心10min，弃去上清，取出立即置于冰上冷却。加5mL Buffer A重悬，于冰上超声破碎。超声破碎后，4℃，10000×g,离心15min，分别取50μL上清和少量沉淀进行10％SDS-PAGE电泳分析。用90V电压电泳150min，电泳结束后，用考马斯亮蓝R250染色1h，再用脱色液脱色2h至条带清晰，观察结果并扫描保存胶图，如图7所示，其中：M：Protein Marker，1：pET-21a空载体，2：未诱导的Alβ-FS，3：Alβ-FS全菌，4：Alβ-FS上清，5：Alβ-FS沉淀，星号位置为目的蛋白。

四、体外酶功能验证

在1.5mL离心管中配制500μL反应体系(430μL粗酶溶液50μL 100mM Tris-HCl，10μL法呢基焦磷酸三铵盐，10mM MgCl₂和1mM DTT各5μL)，涡旋混匀、离心，30℃水浴2h。再加入500μL正己烷，涡旋、离心，吸取上层正己烷抽提液，重复3次，合并抽提液。真空浓缩至干，加200μL正己烷复溶，转移至内插管中，通过气质联用技术(GC-MS)对催化产物进行检测。具体检测条件如下：GC-MS仪器为7890B-7000B三重四极杆气质联用仪(Agilent，美国)，色谱柱为DB-5MS(60m×0.25mm×0.25μm，氦气流速为1mL/min。色谱条件：50℃保持5min，以10℃/min涨至240℃保持10min。质谱条件：离子源温度150℃，接口温度250℃，电子能量70eV，扫描质量范围50-300aum。样品总离子流图见图8～11，结果发现法尼烯标准品在GC-MS中的保留时间为27.082min，样品在保留时间为27.067min存在特征峰，经NIST MS数据库检索比对，结果显示对应的化合物为β-法尼烯。由此可见，以FPP为底物时，pET-21a-Alβ-FS体外酶催化反应产物经质谱鉴定为倍半萜类物质β-法尼烯，说明Alβ-FS基因编码生成的酶是一种可以催化FPP生成倍半萜物类质β-法尼烯的单功能酶基因。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 安徽中医药大学

<120> 一种茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS及其的编码产物和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1647

<212> DNA

<213> Atractylodes lance (Thunb. ) DC

<400> 1

atgtctactc ttacatgtga ggaagttatt cgccccatta ccaactttcc tccaagcgtt 60

tggggagatc aatttctcat ctacaacgag gaagcagagc gaggcaaggt agaacatatc 120

gtcaaagatt tgaaagaaga agtgcggaaa gatttagtgg cagcactgga tgttccaatg 180

gaacacacga atttgttgaa atcaatcgat acaatccaac gcctaggctt agcctattac 240

tttaaagagg agattgagca aggcttgcaa catgtatatg atacatatgg tgatgaatgg 300

aatggtggta gcccttccct ttggtttcga ctcctgcgac aacaaggctt ttatgtgaca 360

tgcgatattt tcagtaacta taaggatgaa aatggatatt ttaaggaatc cttaacgaac 420

gatgttgaag gcatgcttga gttgtatgag gcaacgtata tgagggtgcc aggtgaagtt 480

gtactagacg atgctcttgt ttttacaaca ccccagcttc acaaaatagc aaaggatcct 540

cttcgaagca actctgctct ttctaccaga atacaggagg cgctaaggct accaaaatgg 600

aaaagttttc cacgactaga gcctttgaac tacattcctt tctaccaaca acaagcttct 660

cataacaaat ctttacttaa acttgccaag ttaggtttca acttgcttca atcattgcac 720

aggaaggagc ttagccaact ttccaagtgg tggaaaggtg tggatgcccc aaacaatata 780

ccttatgcaa gagaccgatt gattgaatgc tactttttgg caaacaatgt ataccatgag 840

ccccgatatt cttctgctcg gattttctta gcaaaactgt ttataatgac gaccatgatt 900

gatgacactt atgatgctta tggtacttac aaagaacttg agtgctttac tgaagcaatt 960

gaaaggtggt cgattacatg cttagatatg cttccggaat acatgaaatt gatataccaa 1020

gaactaatgg gtgtgtatga agaaatggaa gaaatcctgg caaaggaggg aaaagcacat 1080

cgtacaaact atgccaaaga agctatgaaa gtgcttgtta gaagctacat gacagaagcg 1140

aaatggatta atgaggggta catggcatcg aaggaagaac acatggcagt tgcgttagtg 1200

agtggcggaa tgagtttggt tttaacaagt acttttgttg gcctggttga tctgatcaat 1260

gacgagccat taaaatgggc tctcaccata cctccccttt tcaaagcctc aaacgcgatc 1320

tgtaggctca tgaatgatat tgcctcccac aagggggagc aagaaagaaa gcatgtagca 1380

tccagtgtgg aagtctacat gaagcaatat gatgtgacag aagagtatgc ccatggctta 1440

ttgtatcaac aagtcgaaga tgcatggaaa gttataaacc gagagtccct cgtctgtaaa 1500

gatgttccaa ggtctgcaat aatgtgtgtg atcaactttt cacaggttac aagctattta 1560

tataaacatg aagatagttt cacgctcgta ggagaagaac tgatagatca aatcaagtct 1620

ttgttcgttc gtcctatgac tatctga 1647

<210> 2

<211> 540

<212> PRT

<213> Atractylodes lance (Thunb. ) DC

<400> 2

Met Ser Thr Leu Thr Cys Gly Gly Val Ile Ala Pro Ile Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Pro Ser Val Thr Gly Ala Gly Pro Leu Ile Thr Ala Gly Gly Ala

20 25 30

Gly Ala Gly Leu Val Gly His Ile Val Leu Ala Leu Leu Gly Gly Val

35 40 45

Ala Leu Ala Leu Val Ala Ala Leu Ala Val Pro Met Gly His Thr Ala

50 55 60

Leu Leu Leu Ser Ile Ala Thr Ile Gly Ala Leu Gly Leu Ala Thr Thr

65 70 75 80

Pro Leu Gly Gly Ile Gly Gly Gly Leu Gly His Val Thr Ala Thr Thr

85 90 95

Gly Ala Gly Thr Ala Gly Gly Ser Pro Ser Leu Thr Pro Ala Leu Leu

100 105 110

Ala Gly Gly Gly Pro Thr Val Thr Cys Ala Ile Pro Ser Ala Thr Leu

115 120 125

Ala Gly Ala Gly Thr Pro Leu Gly Ser Leu Thr Ala Ala Val Gly Gly

130 135 140

Met Leu Gly Leu Thr Gly Ala Thr Thr Met Ala Val Pro Gly Gly Val

145 150 155 160

Val Leu Ala Ala Ala Leu Val Pro Thr Thr Pro Gly Leu His Leu Ile

165 170 175

Ala Leu Ala Pro Leu Ala Ser Ala Ser Ala Leu Ser Thr Ala Ile Gly

180 185 190

Gly Ala Leu Ala Leu Pro Leu Thr Leu Ser Pro Pro Ala Leu Gly Pro

195 200 205

Leu Ala Thr Ile Pro Pro Thr Gly Gly Gly Ala Ser His Ala Leu Ser

210 215 220

Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Pro Ala Leu Leu Gly Ser Leu His

225 230 235 240

Ala Leu Gly Leu Ser Gly Leu Ser Leu Thr Thr Leu Gly Val Ala Ala

245 250 255

Pro Ala Ala Ile Pro Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gly Cys Thr Pro

260 265 270

Leu Ala Ala Ala Val Thr His Gly Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ala Ile

275 280 285

Pro Leu Ala Leu Leu Pro Ile Met Thr Thr Met Ile Ala Ala Thr Thr

290 295 300

Ala Ala Thr Gly Thr Thr Leu Gly Leu Gly Cys Pro Thr Gly Ala Ile

305 310 315 320

Gly Ala Thr Ser Ile Thr Cys Leu Ala Met Leu Pro Gly Thr Met Leu

325 330 335

Leu Ile Thr Gly Gly Leu Met Gly Val Thr Gly Gly Met Gly Gly Ile

340 345 350

Leu Ala Leu Gly Gly Leu Ala His Ala Thr Ala Thr Ala Leu Gly Ala

355 360 365

Met Leu Val Leu Val Ala Ser Thr Met Thr Gly Ala Leu Thr Ile Ala

370 375 380

Gly Gly Thr Met Ala Ser Leu Gly Gly His Met Ala Val Ala Leu Val

385 390 395 400

Ser Gly Gly Met Ser Leu Val Leu Thr Ser Thr Pro Val Gly Leu Val

405 410 415

Ala Leu Ile Ala Ala Gly Pro Leu Leu Thr Ala Leu Thr Ile Pro Pro

420 425 430

Leu Pro Leu Ala Ser Ala Ala Ile Cys Ala Leu Met Ala Ala Ile Ala

435 440 445

Ser His Leu Gly Gly Gly Gly Ala Leu His Val Ala Ser Ser Val Gly

450 455 460

Val Thr Met Leu Gly Thr Ala Val Thr Gly Gly Thr Ala His Gly Leu

465 470 475 480

Leu Thr Gly Gly Val Gly Ala Ala Thr Leu Val Ile Ala Ala Gly Ser

485 490 495

Leu Val Cys Leu Ala Val Pro Ala Ser Ala Ile Met Cys Val Ile Ala

500 505 510

Pro Ser Gly Val Thr Ser Thr Leu Thr Leu His Gly Ala Ser Pro Thr

515 520 525

Leu Val Gly Gly Gly Leu Ile Ala Gly Ile Leu Ser

530 535 540

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Atractylodes lance (Thunb. ) DC

<400> 3

atgtctactc ttacatgtga ggaag 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Atractylodes lance (Thunb. ) DC

<400> 5

tcagatagtc ataggacgaa cgaac 25

Claims

1.一种茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种如权利要求1所述的茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS编码的产物，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种如权利要求1所述的茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS的特异性引物，其特征在于，包含如SEQ ID No.3所示的上游引物，以及如SEQ ID No.4所示的下游引物。

4.一种含有如权利要求1所述的茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的一种茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pET-21a-Alβ-FS。

6.一种如权利要求1所述的茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS在制备倍半萜类化合物中的应用。

7.如权利要求6所述的一种茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS在制备倍半萜类化合物中的应用，其特征在于，包括在细胞中转入所述茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS，在宿主细胞中表达茅苍术倍半萜合酶，茅苍术倍半萜合酶促进倍半萜类化合物的合成。

8.如权利要求6所述的一种茅苍术倍半萜合酶基因Alβ-FS在制备倍半萜类化合物中的应用，其特征在于，所述倍半萜类化合物为β-法尼烯。