CN115851789A

CN115851789A - 一种生产吉玛烯a的萜类合酶及其应用

Info

Publication number: CN115851789A
Application number: CN202211215640.5A
Authority: CN
Inventors: 罗红梅; 郭妙弦; 陈泓宇; 董树廷; 武新玲
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2023-03-28

Abstract

一种生产吉玛烯A的萜类合酶及其应用。本发明涉及了一个吉马烯A合酶AarTPS34基因及其编码产物与应用。本发明从艾叶片中克隆得到AarTPS34基因，AarTPS34基因是首次从艾中得到的倍半萜类化合物吉马烯A生物合成的关键酶基因。通过实验证明：本发明的AarTPS34蛋白能够催化前体物质法尼基焦磷酸FPP生成倍半萜类化合物吉马烯A，吉马烯A是抗癌活性成分β‑榄香烯的合成前体，研究吉马烯A对艾叶药材的品质提高和生产植物单萜类化合物具有重要的理论及实际意义。

Description

一种生产吉玛烯A的萜类合酶及其应用

技术领域

本发明涉及药用植物分子生物学和基因工程技术领域，更具体地说是涉及一种生产吉玛烯A的萜类合酶及其应用。

背景技术

艾(Artemisia argyi)为菊科蒿属药用植物，全草入药，有温经散寒、止血消炎、止咳平喘、安胎、抗过敏等功效，艾叶晒干捣碎得“艾绒”，可制艾条，供艾灸用。此外艾全草可驱虫，其薰烟可用作房间消毒。艾具有极高的经济及药用价值。研究发现挥发油是艾的主要药效物质基础，具有广谱抗菌性、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、镇痛、平喘、免疫调节等能力，主要组成成分为单萜、倍半萜及其衍生物，萜类物质由植物中较为保守的萜类合酶(Terpenesynthase,TPS)催化合成。利用生物工程技术将萜类合酶基因进行异源表达，可定向催化获得大量目标萜类化合物，从而获得具有开发价值或实际用途的萜类产物。

萜类合酶吉马烯A合酶(Germacrene A synthase,GAS)是催化前体物质法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate,FPP)生成倍半萜类化合物吉马烯A的关键酶，产物吉马稀A在体外可以通过简单Cope重排直接获得β-榄香烯。而β-榄香烯是一种具有高效、低毒、广谱抗癌活性的天然萜类化合物。榄香烯口服乳和注射液药物作为国家二类新药在临床上已经取得了显著的疗效。目前β-榄香烯的生产主要以植物提取和化学合成为主，步骤繁琐且易对环境造成污染。因此利用生物工程技术将吉马烯A合酶进行异源表达，构建微生物工厂，具有极大的应用前景。

AarTPS34是艾萜类合酶基因家族中的成员，属于TPS-b亚家族。研究发现，AarTPS34在异源生物合成体系中催化合成倍半萜类化合物吉马烯A，具有底物特异性和产物专一性，被鉴定为吉马烯A合酶。

因此，如何利用AarTPS34基因，将其构建表达载体，并在生物体中合成半萜类化合物吉马烯A是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效合成吉马烯A的吉马烯A合酶基因AarTPS34的基因、其编码的蛋白质及其编码产物与应用。

本发明首先提供了一种核苷酸，来源于菊科蒿属植物艾，为如下1)或2)或3)任意一种的核苷酸：

A1)所述核苷酸为AarTPS34基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示；

A2)或，与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有85％-99％同一性的序列，其编码的蛋白质具有催化生成樟脑的功能；

A3)或，由SEQ ID NO.1所示的序列通过取代和/或缺失，或增加/减少一个或多个核苷酸而获得的序列，其编码的蛋白质具有催化生成吉马烯A的功能；

A4)或，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列产生不同的转录本或者同源基因序列。

其次，本发明提供了一种蛋白质，所述蛋白质来源于菊科蒿属植物艾，命名为艾吉马烯A合酶AarTPS34，为如下1)或2)或3)任意一种的蛋白质：

B1)所述蛋白质为AarTPS34，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

B2)或，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有85％-99％同一性的序列，所述蛋白质具有催化生成吉马烯A的功能；

B3)或，由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列通过取代和/或缺失，或增加/减少一个或多个氨基酸而获得的序列，所述蛋白质具有催化生成吉马烯A的功能；

B4)或，与SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端或C端连接标签得到的融合蛋白质。

上述蛋白质，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

本发明提供上述AarTPS34相关生物材料为下述中的任何一项：

C1)一种含有所述的分离的核酸分子的表达盒；

C2)或，一种重组载体，含有A1)、A2)、A3)任意一项所述的核酸分子；

C3)或，一种宿主细胞，含有A1)、A2)、A3)任意一项所述的核酸分子；

C4)或，一种宿主细胞，含有B1)、B2)、B3)相关任意一项所述的分离的蛋白质；

C5)或，一种宿主细胞，含有C2)所述的任意一种重组载体；

C6)一种转基因植物，含有A1)、A2)、A3)相关任意一项所述的核酸分子；

C7)一种转基因植物，含有B1)、B2)、B3)相关任意一项所述的分离的蛋白质；

C8)一种转基因植物，含有C2)所述的任意一种重组载体；

C9)一种转基因植物，其含有C3)、C4)、C5)所述的任意一种宿主细胞。

本发明进一步提供了上述核苷酸、蛋白质或其相关生物材料的应用。具体应用为下述中的任何一项：

D1)上述蛋白质作为吉马烯A合酶的应用；

D2)上述相关生物材料在制备吉马烯A合酶中的应用；

D3)上述蛋白质或相关生物材料在制备或合成吉马烯A的应用；

D4)上述蛋白质或相关生物材料在FPP形成吉马烯A的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

基于艾全基因组及不同器官/组织转录组差异表达分析以及与已知功能的吉马烯合酶GS蛋白构建系统发育进化树分析，筛选出可能参与吉马烯A合成的AarTPS34的编码基因。

将上述A1)-A4)所述的核苷酸序列与表达载体重组后导入到受体微生物中，表达载体具体为pET-28a，受体微生物具体为大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达AarTPS34蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到AarTPS34蛋白。

通过

Ni NTA树脂纯化AarTPS34蛋白，在缓冲液中进行AarTPS34蛋白体外酶促反应，通过固相微萃取技术和气质联用(GC-MS)技术检测AarTPS34基因在原核表达体系体外的催化产物，获得催化产物樟脑。

本发明从艾中克隆得到AarTPS34即艾吉马烯A合酶，该基因是首次从艾中得到的吉马烯A生物合成的关键酶基因。通过实验证明本发明的AarTPS34能够催化FPP形成吉马烯A，研究吉马烯A对艾叶药材的品质提高和生产植物单萜类化合物具有重要的理论及实际意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为AarTPS34在原核体内表达体系中GC-MS检测的催化产物；

图2附图为AarTPS34在原核体外表达体系中GC-MS检测的催化产物；

图3附图为AarTPS34在原核表达体系中催化产物的质谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 AarTPS34的基因克隆及其编码蛋白质序列

依据艾基因组中的AarTPS34序列设计引物，引物碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。以艾cDNA为模板进行扩增，获得长度为1683bp的核苷酸序列，如SEQ IDNO.1。根据全长cDNA序列翻译后获得AarTPS34编码的氨基酸序列，如SEQ ID NO.2。

实施例2 AarTPS34基因的原核体内表达体系构建及催化产物检测

1)选取BamH I/EcoR I作为酶切位点，对pET-28a载体进行酶切，使用无缝克隆试剂盒将目的基因片段AarTPS34连接至酶切载体中，构建pET-28a-AarTPS34基因表达载体；

2)分别将pET-28a空载体(对照)和pET-28a-AarTPS34转化至BL21感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有50mg/L Kana(卡那霉素)的平板筛选阳性克隆。挑选单菌落接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，培养过夜后，按1:100转接进行扩大培养，待菌液的OD₆₀₀达到0.6时，加入0.5mM的IPTG，于16℃摇床中，避光诱导16h，转速为110r/min；

3)取5mL诱导后菌液置于20mL顶空瓶中，萃取温度为60℃，萃取时间约为30min，以固相微萃取柱(PDMS/DVB，100μm)进行萃取；

4)GC-MS仪器为Agilent 7890b-5977a(HP-5MS：30m×0.25mm×0.25μm)，直接由固相微萃取柱不分流进样。色谱条件：40℃保持1min，以5℃/min涨至240℃保持5min，氦气流速1ml/min，进样口温度250℃。质谱条件：离子源温度230℃，scan模式采集40-550m/z，电子轰击电离源能量70eV。GC-MS检测结果：相对于对照菌株(pET-28a空载体转化的菌株)，含pET-28a-AarTPS34的菌株在20.3min出现单一产物β-榄香烯，如图1所示。说明AarTPS34在原核表达体系中，仅以大肠杆菌内源FPP为底物，专一性合成β-榄香烯直接前体物质吉马烯A(吉马烯A在GC-MS进样口高温下发生cope重排生成β-榄香烯)，表明AarTPS34为吉马烯A合酶。

实施例3 AarTPS34基因的原核体外表达体系构建及催化产物检测

1)收集实施例2中诱导后的菌液和pET-28a空载体菌液，7000rpm/min冷冻离心10min得到菌体沉淀，使用5ml细胞裂解液和2μL 50mg/ml蛋白酶抑制剂重悬菌体，低温下超声破碎菌体后，7000rpm/min冷冻离心3min得到样品上清蛋白和对照上清蛋白。

2)样品上清蛋白用结合缓冲液(20mM Tis-HCl pH＝8.0，10mM Imidazole，0.5MNaCl)稀释，将其挂于

Ni NTA上；用结合缓冲液洗脱杂蛋白后，用含有50、150、200、300、500mM Imidazole的洗脱缓冲液梯度洗脱目的蛋白，通过SDS-PAGE电泳检测，得到最优Imidazole洗脱浓度下的纯化蛋白AarTPS34。使用BCA检测试剂盒测定纯化蛋白浓度。AarTPS34体外酶活性的测定在含有10μg纯化蛋白质，10μg法尼基焦磷酸(FPP)/香叶基焦磷酸(GPP)/香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)，30mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，5mM二硫苏糖醇(DTT)，25mM氯化镁(MgCl₂)的1ml Tis-HCl(100mM，pH＝8.0)缓冲液中进行。将混合物在30℃下孵育1小时，然后通过实施例2所述固相微萃取GC-MS方法检测挥发性产物。

3)GC-MS检测结果：相对于对照蛋白(pET-28a空载体上清蛋白)，AarTPS34仅在FPP作为底物的体外酶促反应中于20.3min出现单一产物β-榄香烯，如图2所示。说明AarTPS34在原核表达体系中具有底物特异性和产物专一性，表明AarTPS34有望开发为高效专一合成β-榄香烯的直接前体吉马烯A的功能蛋白。

本发明基于艾基因组信息对TPS家族成员AarTPS34进行基因克隆、功能验证及产物检测，发现AarTPS34在原核表达体系中以特异性底物FPP，专一性催化合成吉马烯A。本发明为利用生物工程技术生产AarTPS34催化的目标化合物提供可选择的有效方法，同时也为构建β-榄香烯的直接前体吉马烯A的高效异源合成平台提供研究基础。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种分离的核酸分子，其特征在于，其包含选自以下的序列：

1)所述核苷酸为AarTPS34基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示；

2)或，与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有85％-99％同一性的序列，其编码的蛋白质具有催化生成吉马烯A的功能；

3)或，由SEQ ID NO.1所示的序列通过取代和/或缺失，或增加/减少一个或多个核苷酸而获得的序列，其编码的蛋白质具有催化生成吉马烯A的功能；

4)或，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列产生不同的转录本或者同源基因序列。

2.一种分离的蛋白质，其特征在于，其包含选自以下的序列：

1)所述蛋白为AarTPS34蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2)或，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有85％-99％同一性的序列，所述蛋白质具有催化生成吉马烯A的功能；

3)或，由SEQ ID NO.2所示的序列通过取代和/或缺失，或增加/减少一个或多个氨基酸而获得的序列，所述蛋白质具有催化生成吉马烯A的功能；

4)或，与SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端或C端连接标签得到的融合蛋白质，所述蛋白质具有催化生成吉马烯A的功能。

3.与权利要求1、2所述的核苷酸、蛋白质相关的生物材料，其特征在于，所述相关生物材料为如下任何一项所示：

A1)一种含有权利要求1所述的分离的核酸分子的表达盒；

A2)或，一种重组载体，包含权利要求1所述的核酸分子；

A3)或，一种宿主细胞，包含权利要求1所述的核酸分子或权利要求2任一项所述的分离的蛋白质或含有所述的分离的核酸分子的表达盒或包含所述的重组载体；

A4)或，一种转基因植物，包含权利要求1所述的核酸分子或权利要求2所述的蛋白质或所述表达盒或所述的重组载体或所述的宿主细胞。

4.权利要求1-3任意一条所述的核苷酸序列、蛋白质序列或相关生物材料在法尼基焦磷酸FPP为底物下，催化生成吉马烯A的应用。

5.制备权利要求2所述的蛋白质方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的核苷酸序列与表达载体重组后导入到受体微生物中，得到表达权利要求3中所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到权利要求2所述的蛋白质。

6.一种制备吉马烯A的方法，其特征在于：所述方法包括用权利要求2所述的蛋白质催化FPP。