CN112779231A

CN112779231A - 龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN112779231A
Application number: CN201911081616.5A
Authority: CN
Inventors: 黄璐琦; 马蕊; 苏平; 崔光红; 郭娟
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2019-11-07
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2039-11-07
Also published as: CN112779231B

Abstract

本发明公开了一种龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3基因及其编码产物与应用。本发明从龙脑樟叶片中克隆得到Ccbdh3基因，该基因是首次从龙脑樟中得到的单萜类成分合成的关键酶基因。通过实验证明：本发明的CcBDH3蛋白能够催化右旋龙脑((+)‑borneol)形成右旋樟脑((+)‑camphor)，能够催化左旋龙脑((‑)‑borneol)形成左旋樟脑((‑)‑camphor)不仅对龙脑樟中的樟脑等单萜类化合物的生物合成具有重要作用，也对于调节和生产植物单萜类化合物具有重要的理论及实际意义。

Description

龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及药用植物基因工程领域，具体涉及龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3基因及其编码产物与应用。

背景技术

樟树(Cinnamomum camphora(L.)presl)为樟科樟属常绿乔木树种，国家Ⅱ级保护植物，是一种集材用、药用、香精香料、油用、风景园林等多用途的经济植物，具有巨大的开发利用价值。樟树有至少5个化学类型，即龙脑型、樟脑型、1.8-桉叶油型、芳樟醇型、异橙花叔醇型等。其中樟脑型—脑樟(Cinnamomum camphora chvar.Camphor)富含樟脑化合物(camphor)。

天然樟脑是我国重要的特产之一，也是我国出口的传统商品。明代李时珍著《本草纲目》中记载：“樟脑出韶州、漳州，状似龙脑，色白如雪，樟树脂膏也。”天然樟脑用于制造赛璐珞和摄影胶片；无烟火药制造中用作稳定剂；医药方面用于制备中枢神经兴奋剂(如十滴水、人丹)和复方樟脑酊等。能防虫、防腐、除臭，具馨香气息，是衣物、书籍、标本、档案的防护珍品。天然樟脑纯度高、比旋度大，在医药等方面的特殊用途难于用合成樟脑完全代替。主要分布在我国的台湾、福建、江西、广东、广西、湖南、湖北、浙江、四川、云南和贵州等省区。另外，樟树植物生长缓慢，再加上这些有效成分在植物体中的含量不多，因而大大限制了它的发展。

樟脑(camphor)，根据旋光性不同可分为右旋樟脑((+)-camphor)，左旋樟脑((-)-camphor)，IUPAC名称1,7,7-三甲基二环[2.2.1]庚烷-2-酮，是一种萜类有机化合物，室温下为白色或透明的蜡状固体。樟脑提炼自樟树干中，树龄越老的的樟树所富含樟脑比例越多。提炼方法为将树干切成小块用水蒸馏，樟脑油受热后随着水蒸汽上升，在接触到预先放置在上方的陶缸冷却后便可形成樟脑。现在世界上使用的樟脑丸多是由化学方式合成，合成樟脑的功效不及天然樟脑，且副作用大。通过探寻和阐释萜类成分在龙脑樟中的生物合成途径及其调控机制，有助于为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分带来广阔的应用空间。

发明内容

本发明的目的是提供龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3基因及其编码产物与应用。

本发明首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质为CcBDH3，来源于龙脑樟树，命名为龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3，是如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

在本发明的实施例中，所述融合蛋白为氨基酸序列是序列3所示的蛋白质。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

与CcBDH3的相关生物材料也在本发明的保护范围之内。

本发明提供的与CcBDH3的相关生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下B1)-B5)任一所示：

B1)序列表中序列1所示的DNA分子；

B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

B3)序列表中序列4所示的DNA分子；

B4)编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子；

B5)在严格条件下与B1)或B2)或B3)或B4)限定的DNA分子杂交，且编码CcBDH3的DNA分子。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

其中，所述核酸分子可以为DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA，所述核酸分子也可以为RNA，如mRNA或hnRNA。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码CcBDH3的核酸分子的表达盒(CcBDH3基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达CcBDH3的DNA，该DNA不但可包括启动CcBDH3转录的启动子，还可包括终止CcBDH3转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明进一步提供了上述蛋白质或其相关生物材料的应用。

所述应用具体如下所示：

(A)上述蛋白质作为单萜合酶的应用；

(B)上述相关生物材料在制备单萜合酶中的应用；

(C)上述蛋白质或相关生物材料在制备或合成萜类化合物中的应用；

(D)上述蛋白质或相关生物材料在催化右旋龙脑形成右旋樟脑中的应用；

(E)上述蛋白质或相关生物材料在催化左旋龙脑形成左旋樟脑中的应用。

上述应用中，所述萜类化合物为单萜类化合物。

所述单萜类化合物为右旋樟脑或左旋樟脑。

本发明制备CcBDH3的方法，包括将CcBDH3的编码基因导入到受体微生物中，得到表达CcBDH3的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到CcBDH3。

上述方法中，所述受体微生物为原核微生物。具体的，所述原核微生物为大肠杆菌。更具体的，所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)。

上述方法中，所述CcBDH3的编码基因可通过表达CcBDH3的编码基因的重组质粒导入到大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)中。所述重组质粒具体可为将序列1第1-864位所示的DNA片段构建至pET32a(+)载体(Novagen公司)的BamHI酶切位点处，且保持pET32a(+)载体其他序列不变得到的重组质粒。

本发明进一步提供了一种萜类化合物的合成方法，包括如下步骤：采用上述蛋白质催化底物合成萜类化合物。

所述方法中，所述萜类化合物为单萜类化合物。

所述单萜类化合物为右旋樟脑或左旋樟脑。

所述底物为右旋龙脑或左旋龙脑。

当底物为右旋龙脑时，合成的萜类化合物为右旋樟脑。

当底物为左旋龙脑时，合成的萜类化合物为左旋樟脑。

上述方法中，在催化过程中还需要加入酶促缓冲液，所述酶促缓冲液中包括磷酸盐缓冲液和NAD⁺；所述磷酸盐缓冲液由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成；

所述NAD⁺在所述酶促缓冲液中的浓度为1mM。

所述催化反应的反应体系pH可为7.0-9.0。所述反应体系pH具体可为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。所述反应体系pH优选为8.5(当所述底物为右旋龙脑时)或8.0(当所述底物为左旋龙脑时)。

所述催化反应的反应温度可为27-37℃。所述催化反应的反应温度具体可为27、30、32、35、37℃。所述反应体系温度优选为30℃(当所述底物为右旋龙脑时)或32℃(当所述底物为左旋龙脑时)。

所述催化反应的反应时间可为1h-16h。所述催化反应的反应时间具体可为1、3、6、12、16h。

所述催化反应的底物浓度可为5-400μM。所述催化反应的底物浓度具体可为5、10、20、40、60、80、100、200、400μM。

本发明从龙脑樟cDNA中克隆得到Ccbdh3基因，该基因是首次从龙脑樟中得到的单萜类成分合成的关键酶基因。通过实验证明：本发明的CcBDH3蛋白能够催化右旋龙脑((+)-borneol)形成右旋樟脑((+)-camphor)，催化左旋龙脑((-)-borneol)形成左旋樟脑((-)-camphor)，不仅对龙脑樟的樟脑等单萜类化合物的生物合成具有重要作用，也对于调节和生产植物单萜类化合物具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为龙脑樟Ccbdh3基因克隆琼脂糖凝胶电泳图。M表示Trans2KDNAMarker(核酸分子量标准，条带由上往下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)。

图2为聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析在大肠杆菌中表达的CcBDH3蛋白。泳道M为蛋白分子量标准，条带由上往下分别为170、130、95、72、55、43KDa；泳道Ccbdh3为重组质粒pET32a::CcBDH3表达的目的蛋白，箭头表示目的蛋白。

图3为标准品(+)-camphor和(-)-camphor及CcBDH3催化底物(+)-borneol和(-)-borneol形成产物的提取离子流图。

图4为标准品(+)-camphor和(-)-camphor的质谱图。图4A为标准品(+)-camphor，图4B为标准品(-)-camphor。

图5为CcBDH3催化底物(+)-borneol和(-)-borneol形成产物的质谱图。图5A为CcBDH3催化底物(+)-borneol生成(+)-camphor的质谱图，图5B为CcBDH3催化底物(-)-borneol生成(-)-camphor的质谱图。

图6为CcBDH3催化反应的时间进程。图6A为CcBDH3催化底物(+)-borneol形成(+)-camphor的时间进程；图6B为CcBDH3催化底物(-)-borneol形成(-)-camphor的时间进程。

图7为CcBDH3表达蛋白酶促反应动力学。图7A为CcBDH3在不同温度下催化底物(+)-borneol形成(+)-camphor的含量变化；图7B为CcBDH3在不同温度下催化底物(-)-borneol形成(-)-camphor的含量变化；图7C为CcBDH3在不同pH值下催化底物(+)-borneol形成(+)-camphor的含量变化；图7D为CcBDH3在不同pH值下催化底物(-)-borneol形成(-)-camphor的含量变化；图7E为CcBDH3在不同底物(+)-borneol浓度下催化形成(+)-camphor的速率变化；图7F为CcBDH3在不同底物(-)-borneol浓度下催化形成(-)-camphor的速率变化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的

High-Fidelity DNAPolymerase高保真酶是NewEngland Biolabs公司的产品；

快速通用植物RNA提取试剂盒是北京华越洋生物科技有限公司的产品；

Bradford法蛋白浓度测定试剂盒是生工生物工程(上海)股份有限公司的产品；

TransScript One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、Trans2K DNA Marker、pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit、大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1和Transetta(DE3)、ProteinIso Ni-NTAResin是北京全式金生物技术有限公司的产品；

蛋白超滤管(Amicon-Ultra-15)是Millipore公司的产品(产品目录号：UFC903024)；

NaCl、DTT、PMSF、Imidazole、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄是生工生物工程(上海)股份有限公司的产品；

Gene JET Gel ExtractionKit胶回收试剂盒是Thermo公司的产品；

PremixedProtein Marker(Low)是Takara公司的产品；

pET32a(+)载体是Novagen公司的产品；

右旋樟脑((+)-Camphor)是Sigma公司的产品，产品目录号为857300，CAS号为464-49-3。左旋樟脑((-)-Camphor)是Sigma公司的产品，产品目录号为21293，CAS号为464-48-2。

实施例1、龙脑樟Ccbdh3基因全长cDNA序列克隆

一、Ccbdh3基因全长cDNA序列克隆

1、总RNA的提取

根据北京华越洋生物科技有限公司快速通用植物RNA提取试剂盒说明书进行操作，提取龙脑樟叶片的总RNA。

2、第一链cDNA的合成

根据北京全式金生物技术有限公司第一链cDNA合成试剂盒TransScript One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix说明书进行操作，反转录反应体系如表1所示。

表1

(1)为获得更高的合成效率，取Total RNA、Anchored Oligo(dT)₁₈Primer、RNase-free Water于PCR管中，混匀，65℃，5min；

(2)在上述PCR管中加入10.0μL 2×TS Reaction Mix、1.0μL

RT/RIEnzyme Mix、1.0μL gDNARemover，轻轻混匀；

(3)按下列条件进行反转录反应：42℃30min，85℃5s；

(4)cDNA样品于-20℃保存。

3、引物的设计

根据龙脑樟叶片转录组数据，获得Ccbdh3基因开放阅读框(ORF)序列，并基于此设计克隆引物CcBDH3-F和CcBDH3-R，引物序列如下：

CcBDH3-F：5’-ATGTCTACCGGCAAGTCTGAGC-3’；

CcBDH3-R：5’-TCATTTCTTAGTGAACACTTCGAGAGC-3’。

4、PCR扩增

以步骤2获得的cDNA为模板，采用高保真酶

High-Fidelity DNAPolymerase、CcBDH3-F和CcBDH3-R引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，结果如图1所示，并对PCR扩增产物进行测序。PCR反应程序如下：

PCR反应程序：98℃预变性1min；98℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 1min，40个循环；72℃延伸7min。

PCR产物加10μL 6×Loading Buffer混匀，跑琼脂糖凝胶电泳(180V，20min)分离DNA条带，紫外灯下将目的条带切下(注意避免长时间暴露在紫外灯下，损害DNA而影响后续实验)，置于2.0mL EP管中，称重。利用Thermo Scientific公司的Gene JET GelExtraction Kit回收目的片段，使用北京全式金生物技术有限公司pEASY-Blunt ZeroCloning Kit克隆载体，将目的片段与载体连接，转化Trans1-T1感受态细胞，涂布LB平板，并阳性克隆PCR鉴定，将出现目的片段条带的菌液，送测序公司进行测序验证。

测序结果表明：PCR扩增产物的序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为Ccbdh3，编码由287个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白命名为CcBDH3，该蛋白的氨基酸序列为序列2。

实施例2、龙脑樟CcBDH3蛋白的获得及其功能分析

一、龙脑樟CcBDH3蛋白的获得

1、重组载体的构建

采用北京全式金生物技术有限公司pEASY-Uni Seamless Cloning and AssemblyKit，将序列1第1-864位所示的DNA片段构建至pET32a(+)载体(Novagen公司)的BamHI酶切位点处，且保持pET32a(+)载体其他序列不变，得到重组质粒pET32a::CcBDH3(已经测序验证)，引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

CcBDH3-F：5’-CCATGGCTGATATCGGAATGTCTACCGGCAAGTCTGAGCT-3’；

CcBDH3-R：5’-ACGGAGCTCGAATTCGGTCATTTCTTAGTGAACACTTCGA-3’。

外源插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的序列4所示的融合基因，编码序列表的序列3所示的融合蛋白。

2、重组菌的获得

将重组质粒pET32a::CcBDH3转化至大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)(购自北京全式金生物技术有限公司)，得到pET32a::CcBDH3重组菌；同时用不含目的基因的pET32a(+)空载体转化大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)作为对照菌。

3、重组蛋白CcBDH3的获得

挑取pET32a::CcBDH3重组菌和对照菌分别接种于2mL的LB液体培养基(含氨苄青霉素100mg/L)中，于37℃振荡培养过夜。次日按1：100稀释加入到200mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时转入18℃振摇1小时，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续于18℃摇床培养24小时诱导目标蛋白表达。将菌液用8000g离心5min，弃上清，收集pET32a::CcBDH3重组菌和对照菌菌体，保存在-80℃冰箱备用。

4、重组蛋白CcBDH3的纯化

提取pET32a::CcBDH3重组菌和对照菌菌体中的蛋白。具体步骤如下：将pET32a::CcBDH3重组菌和对照菌菌体用预冷的5mL磷酸盐缓冲液(20mM咪唑，1mM PMSF，1mM DTT，pH8.0)重悬；置冰浴中超声破菌(30％功率，超声5s，间隔5s，持续10min，重复1次)，12000g，4℃离心30min，分别得到pET32a::CcBDH3重组菌上清和对照菌上清，即为粗蛋白溶液。

按表2配制试剂，进行重组蛋白CcBDH3的纯化。

表2不同浓度蛋白洗脱液配制

具体纯化流程如下：

(1)预冷的5mL Binding buffer(20mM Na₂HPO₄，0.5mM NaCl，10mM imidazole，1mMDTT，1mM PMSF，pH 7.4)重悬pET32a::CcBDH3重组菌；

(2)置冰浴中超声破碎菌液(30％功率，超声10s，间隔10s，持续20min)，4℃，12000g离心30min；

(3)吸取200μLNi-NTAagorose于15mL离心管，用10倍体积的Elution buffer(含20mM咪唑)洗涤，4℃，500g离心5min，弃上清(除尽乙醇)，活化镍柱，重复3次；

(4)上清液(粗蛋白)与活化的镍柱混合，离心管水平放置在冰上，振荡2h，使蛋白与镍柱充分结合；

(5)4℃，500g离心5min，弃上清；

(6)加入5mL Elution buffer(含20mM咪唑)轻轻重悬，4℃，500g离心5min，弃上清，重复3次后转移到1.5mL EP管中；

(7)加入200μL Elution buffer(含50mM咪唑)，用枪头吹打混匀，4℃，500g离心5min，取上清(200μL)加入50μL 50％甘油，-80℃冰箱保存；

(8)加入200μL Elution buffer(含100mM咪唑)，用枪头吹打混匀，4℃，500g离心5min，取上清(200μL)加入50μL 50％甘油，-80℃冰箱保存；

(9)加入200μL Elution buffer(含250mM咪唑)，用枪头吹打混匀，4℃，500g离心5min，取上清(200μL)加入50μL 50％甘油，-80℃冰箱保存；

(10)加入200μL Elution buffer(含500mM咪唑)，用枪头吹打混匀，4℃，500g离心5min，取上清(200μL)加入50μL 50％甘油，-80℃冰箱保存；

(11)对不同浓度梯度的洗脱液进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，将pET32a::CcBDH3纯化蛋白进行SDS-PAGE，结果如图2所示。从图中可以看出，所述重组蛋白CcBDH3大小约为48kDa，大小与预期相符，纯化效果很好。

(12)合并含有目的蛋白的洗脱液，并转移到蛋白超滤管中进行脱盐浓缩，收集纯酶液，置于-80℃冰箱保存。

二、重组蛋白CcBDH3酶促活性分析

1、重组蛋白CcBDH3蛋白浓度测定

根据生工生物工程(上海)股份有限公司Bradford法蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作，测定重组蛋白CcBDH3蛋白浓度为5830.54ug/mL。

2、酶促活性

(1)酶促反应体系的制备

取步骤1定量后的重组蛋白CcBDH3进行酶促反应。根据底物不同分为如下两组，各组酶促反应体系如下：

(+)-Borneol组：

(+)-Borneol组酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0，溶剂为水，溶质及其浓度为：磷酸氢二钠，浓度为35.82g/L；磷酸二氢钠，浓度为15.61g/L)和1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用。

(-)-Borneol组：

(-)-Borneol组酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0，溶剂为水，溶质及其浓度为：磷酸氢二钠，浓度为35.82g/L；磷酸二氢钠，浓度为15.61g/L)和1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用。

(2)GC-MS分析

利用气质联用GC-MS对目标化合物进行检测：GC-MS分析系统为ThermoTRACE1310/TSQ 8000gas chromatograph，进样量1μL，splitless模式，气相色谱柱为Agilent J&W CycloSil-B手性柱(30m×0.25mm×0.25μm)，氦气流速1.0mL/min，进样口温度230℃，离子源温度200℃，升温程序为50℃保持2min，程序升温10℃·min^-1到100℃，2℃·min^-1到140℃，30℃·min^-1到230℃，电子能量70eV，对样品进行50-500m/z范围扫描。

GC-MS分析结果如图3-图5所示图所示：CcBDH3重组蛋白能够催化右旋龙脑((+)-borneol)形成右旋樟脑((+)-camphor)，催化左旋龙脑((-)-borneol)形成左旋樟脑((-)-camphor)。

3、不同反应时间的酶促活性检测

(1)重组蛋白CcBDH3催化底物(+)-borneol时间进程

检测步骤1定量后的的重组蛋白CcBDH3在不同反应时间的酶促活性。根据时间不同分为5组，各组酶促反应体系如下：

t(1h)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应1h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。(前面酶促反应已说明缓冲液浓度，后面是酶活分析，应该可以不用写浓度，表明pH值即可)

t(3h)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应3h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

t(6h)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应6h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

t(12h)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应12h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

t(16h)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应16h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(2)重组蛋白CcBDH3催化底物(-)-borneol时间进程

检测步骤1定量后的重组蛋白CcBDH3在不同反应时间的酶促活性。根据时间不同分为5组，各组酶促反应体系如下：

t(1h)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD+(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应1h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

t(3h)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD+(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应3h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

t(6h)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD+(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应6h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

t(12h)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD+(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应12h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

t(16h)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD+(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应16h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(2)GC-MS分析

利用气质联用GC-MS对各组体系进行目标化合物的检测。检测方法同步骤2中的(2)。

GC-MS分析结果如图6所示，随着酶促反应时间的增长，重组蛋白CcBDH3的对(+)-Borneol和(-)-Borneol的催化产物逐渐增多，在12h之后饱和。

4、不同反应温度的酶促活性检测及酶促动力学分析

(1)重组蛋白CcBDH3在不同温度下催化底物(+)-borneol

检测步骤1定量后的重组蛋白CcBDH3在不同反应温度的酶促活性。根据温度不同分为5组，各组酶促反应体系如下：

T(27℃)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床27℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

T(30℃)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

T(32℃)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床32℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

T(35℃)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床35℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

T(37℃)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床37℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(2)重组蛋白CcBDH3在不同温度下催化底物(-)-borneol

T(27℃)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD+(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床27℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

T(30℃)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD+(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

T(32℃)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD+(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床32℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

T(35℃)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD+(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床35℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

T(37℃)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD+(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床37℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(2)GC-MS分析

GC-MS分析结果如图7所示，在温度30℃条件下，重组蛋白CcBDH3的对(+)-Borneol酶活性最高；在温度32℃条件下，重组蛋白CcBDH3的对(-)-Borneol酶活性最高。

5、不同pH值的酶促活性检测及酶促动力学分析

(1)重组蛋白CcBDH3在不同pH值下催化底物(+)-borneol

检测步骤1定量后的重组蛋白CcBDH3在不同pH值的酶促活性。根据pH不同分为5组，各组酶促反应体系如下：

pH值(pH＝7.0)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

pH值(pH＝7.5)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝7.5)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

pH值(pH＝8.0)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

pH值(pH＝8.5)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.5)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

pH值(pH＝9.0)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝9.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(2)重组蛋白CcBDH3在不同pH值下催化底物(-)-borneol

pH值(pH＝7.0)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

pH值(pH＝7.5)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝7.5)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

pH值(pH＝8.0)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

pH值(pH＝8.5)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.5)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

pH值(pH＝9.0)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、0.1mM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝9.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应10h，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(2)GC-MS分析

GC-MS分析结果如图7所示，在pH＝8.5条件下，重组蛋白CcBDH3的对(+)-Borneol酶活性最高；在pH＝8.0条件下，重组蛋白CcBDH3的对(-)-Borneol酶活性最高。

6、不同底物浓度的酶促活性检测及酶促动力学分析

(1)重组蛋白CcBDH3在底物(+)-borneol不同浓度下的酶促反应

检测步骤1定量后的重组蛋白CcBDH3在不同底物浓度的酶促活性。根据底物浓度不同分为六组，各组酶促反应体系如下：

(+)-Borneol(5μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、5μM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.5)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(+)-Borneol(10μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、10μM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.5)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(+)-Borneol(20μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、20μM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.5)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(+)-Borneol(40μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、40μM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.5)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(+)-Borneol(100μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、100μM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.5)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(+)-Borneol(200μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、200μM底物右旋龙脑((+)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.5)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床30℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(2)重组蛋白CcBDH3在底物(-)-borneol不同浓度下的酶促反应

检测步骤1定量后的重组蛋白CcBDH3在不同底物浓度的酶促活性。根据底物浓度不同分为七组，各组酶促反应体系如下：

(-)-Borneol(5μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、5μM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床32℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(-)-Borneol(40μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、40μM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床32℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(-)-Borneol(60μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、60μM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床32℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(-)-Borneol(80μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、80μM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床32℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(-)-Borneol(100μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、100μM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床32℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(-)-Borneol(200μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、200μM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床32℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(-)-Borneol(400μM)：酶促反应总体系为200μL，是将10μg重组蛋白CcBDH3、400μM底物左旋龙脑((-)-Borneol)和磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，1mM NAD⁺(Sigma，3483-12-3)混匀得到的体系，放置摇床32℃，150rpm反应30min，之后用200μL正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(2)GC-MS分析

GC-MS分析结果如图7所示。

6、酶促动力学分析

GC-MS分析结果如表3所示，CcBDH3纯化蛋白(重组蛋白CcBDH3)催化右旋龙脑的米氏常数K_m为25.1±3.8μM，最大反应速度V_max为108.3±5.3nkat/mg，催化常数K_cat为5.4×10^-3/s，表观二级速度常数K_cat/K_m为2.2×10^-4(s^-1/μM)。CcBDH3纯化蛋白(重组蛋白CcBDH3)催化左旋龙脑的米氏常数K_m为36.9±5.8μM，最大反应速度V_max为41.0±1.8nkat/mg，催化常数K_cat为2.1×10^-3/s，表观二级速度常数K_cat/K_m为5.6×10^-5(s^-1/μM)。

表3重组蛋白CcBDH3不同底物动力学比较

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> 龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3及其编码基因与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 864

<212> DNA

<213> 龙脑樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 1

atgtctaccg gcaagtctga gctttctacc tccaacaatc tgcttcttcc ccaccaaagg 60

ttggaaggga aggtggcact agtaacaggt ggggcctccg gcatcggcga aagcattgcg 120

agtctcttcc agcagcatgg cgcgaaggtc tgtgtggtgg acttgcaaga tgaactgggc 180

cggcaggtct gtgactctct cggtggtgac tcaaatgctt gctacatcca cggcgatgtc 240

acggtggaag acgacttgcg cagggctgtc gaattcaccg tcgagaagtt tgggacactc 300

gatatcatgg tcaacaatgc cggcatcagc ggcacgcctg gcatcgacat ccgctatgct 360

gacatcggcg agttccagcg agtgttcgac gtgaactgca aggctgtctt catgggcatg 420

aagtatgcgg cccaagtcat gatccccaga gggaaggggt ccatagtgtc gcttgctagt 480

gtagcgagcc aagtgggagg gatcggccca catgcctaca cagcgtccaa acatgctgta 540

gttgggctta cgaagaatgt ggccgccgag ctgggcctgt atggaattcg agtgaattgt 600

gtgtcgccgt atgcagtgcc cacaagcctg gccatgcccc acttgcctga aggggaggcc 660

aaagatgatg cattagaggg ctttttggcg ttcgcagaga gaaatgggaa ccttaagggt 720

gcgagactga tgcccaagga tgtagctaat gctgtgcttt acttggctag tgatgaggcc 780

cagtatgtaa gtgggcttaa cctggttgtg gatggggggt tcactgctgt gaaccacgct 840

ctcgaagtgt tcactaagaa atga 864

<210> 2

<211> 287

<212> PRT

<213> 龙脑樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 2

Met Ser Thr Gly Lys Ser Glu Leu Ser Thr Ser Asn Asn Leu Leu Leu

1 5 10 15

Pro His Gln Arg Leu Glu Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Gly Ala

20 25 30

Ser Gly Ile Gly Glu Ser Ile Ala Ser Leu Phe Gln Gln His Gly Ala

35 40 45

Lys Val Cys Val Val Asp Leu Gln Asp Glu Leu Gly Arg Gln Val Cys

50 55 60

Asp Ser Leu Gly Gly Asp Ser Asn Ala Cys Tyr Ile His Gly Asp Val

65 70 75 80

Thr Val Glu Asp Asp Leu Arg Arg Ala Val Glu Phe Thr Val Glu Lys

85 90 95

Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Val Asn Asn Ala Gly Ile Ser Gly Thr

100 105 110

Pro Gly Ile Asp Ile Arg Tyr Ala Asp Ile Gly Glu Phe Gln Arg Val

115 120 125

Phe Asp Val Asn Cys Lys Ala Val Phe Met Gly Met Lys Tyr Ala Ala

130 135 140

Gln Val Met Ile Pro Arg Gly Lys Gly Ser Ile Val Ser Leu Ala Ser

145 150 155 160

Val Ala Ser Gln Val Gly Gly Ile Gly Pro His Ala Tyr Thr Ala Ser

165 170 175

Lys His Ala Val Val Gly Leu Thr Lys Asn Val Ala Ala Glu Leu Gly

180 185 190

Leu Tyr Gly Ile Arg Val Asn Cys Val Ser Pro Tyr Ala Val Pro Thr

195 200 205

Ser Leu Ala Met Pro His Leu Pro Glu Gly Glu Ala Lys Asp Asp Ala

210 215 220

Leu Glu Gly Phe Leu Ala Phe Ala Glu Arg Asn Gly Asn Leu Lys Gly

225 230 235 240

Ala Arg Leu Met Pro Lys Asp Val Ala Asn Ala Val Leu Tyr Leu Ala

245 250 255

Ser Asp Glu Ala Gln Tyr Val Ser Gly Leu Asn Leu Val Val Asp Gly

260 265 270

Gly Phe Thr Ala Val Asn His Ala Leu Glu Val Phe Thr Lys Lys

275 280 285

<210> 3

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Met Ser Thr Gly Lys Ser Glu Leu Ser Thr Ser Asn

165 170 175

Asn Leu Leu Leu Pro His Gln Arg Leu Glu Gly Lys Val Ala Leu Val

180 185 190

Thr Gly Gly Ala Ser Gly Ile Gly Glu Ser Ile Ala Ser Leu Phe Gln

195 200 205

Gln His Gly Ala Lys Val Cys Val Val Asp Leu Gln Asp Glu Leu Gly

210 215 220

Arg Gln Val Cys Asp Ser Leu Gly Gly Asp Ser Asn Ala Cys Tyr Ile

225 230 235 240

His Gly Asp Val Thr Val Glu Asp Asp Leu Arg Arg Ala Val Glu Phe

245 250 255

Thr Val Glu Lys Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Val Asn Asn Ala Gly

260 265 270

Ile Ser Gly Thr Pro Gly Ile Asp Ile Arg Tyr Ala Asp Ile Gly Glu

275 280 285

Phe Gln Arg Val Phe Asp Val Asn Cys Lys Ala Val Phe Met Gly Met

290 295 300

Lys Tyr Ala Ala Gln Val Met Ile Pro Arg Gly Lys Gly Ser Ile Val

305 310 315 320

Ser Leu Ala Ser Val Ala Ser Gln Val Gly Gly Ile Gly Pro His Ala

325 330 335

Tyr Thr Ala Ser Lys His Ala Val Val Gly Leu Thr Lys Asn Val Ala

340 345 350

Ala Glu Leu Gly Leu Tyr Gly Ile Arg Val Asn Cys Val Ser Pro Tyr

355 360 365

Ala Val Pro Thr Ser Leu Ala Met Pro His Leu Pro Glu Gly Glu Ala

370 375 380

Lys Asp Asp Ala Leu Glu Gly Phe Leu Ala Phe Ala Glu Arg Asn Gly

385 390 395 400

Asn Leu Lys Gly Ala Arg Leu Met Pro Lys Asp Val Ala Asn Ala Val

405 410 415

Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ala Gln Tyr Val Ser Gly Leu Asn Leu

420 425 430

Val Val Asp Gly Gly Phe Thr Ala Val Asn His Ala Leu Glu Val Phe

435 440 445

Thr Lys Lys

450

<210> 4

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gaatgtctac cggcaagtct gagctttcta cctccaacaa tctgcttctt 540

ccccaccaaa ggttggaagg gaaggtggca ctagtaacag gtggggcctc cggcatcggc 600

gaaagcattg cgagtctctt ccagcagcat ggcgcgaagg tctgtgtggt ggacttgcaa 660

gatgaactgg gccggcaggt ctgtgactct ctcggtggtg actcaaatgc ttgctacatc 720

cacggcgatg tcacggtgga agacgacttg cgcagggctg tcgaattcac cgtcgagaag 780

tttgggacac tcgatatcat ggtcaacaat gccggcatca gcggcacgcc tggcatcgac 840

atccgctatg ctgacatcgg cgagttccag cgagtgttcg acgtgaactg caaggctgtc 900

ttcatgggca tgaagtatgc ggcccaagtc atgatcccca gagggaaggg gtccatagtg 960

tcgcttgcta gtgtagcgag ccaagtggga gggatcggcc cacatgccta cacagcgtcc 1020

aaacatgctg tagttgggct tacgaagaat gtggccgccg agctgggcct gtatggaatt 1080

cgagtgaatt gtgtgtcgcc gtatgcagtg cccacaagcc tggccatgcc ccacttgcct 1140

gaaggggagg ccaaagatga tgcattagag ggctttttgg cgttcgcaga gagaaatggg 1200

aaccttaagg gtgcgagact gatgcccaag gatgtagcta atgctgtgct ttacttggct 1260

agtgatgagg cccagtatgt aagtgggctt aacctggttg tggatggggg gttcactgct 1320

gtgaaccacg ctctcgaagt gttcactaag aaatga 1356

Claims

1.蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下B1)-B5)任一所示：

B1)序列表中序列1所示的DNA分子；

B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

B3)序列表中序列4所示的DNA分子；

B4)编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子；

4.权利要求1所述的蛋白质在作为单萜合酶中的应用。

5.权利要求2或3所述的生物材料在制备单萜合酶中的应用。

6.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在如下1)-3)中任一种中的应用：

1)制备或合成萜类化合物；

2)催化右旋龙脑形成右旋樟脑；

3)催化左旋龙脑形成左旋樟脑。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

所述萜类化合物为单萜类化合物；

进一步地，所述单萜类化合物为右旋樟脑或左旋樟脑。

8.制备权利要求1所述蛋白质的方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入到受体微生物中，得到表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到权利要求1所述的蛋白质。

9.一种萜类化合物的合成方法，包括如下步骤：采用权利要求1所述的蛋白质催化底物合成萜类化合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

所述方法中，所述萜类化合物为单萜类化合物；

进一步地，所述单萜类化合物为右旋樟脑或左旋樟脑；所述底物为右旋龙脑或左旋龙脑。