CN113846083B - 一种除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体公开了一种除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1及其编码基因与应用。本发明从除虫菊中克隆得到大根香叶烯D合成酶的基因，将该大根香叶烯D合成酶的基因在体外进行表达纯化后，经纯化后的大根香叶烯D合成酶能特异性的以FPP为前体物质合成大根香叶烯D，可用于大根香叶烯D的大规模生产；因此，在大根香叶烯D合成技术领域具有良好的应用前景。

Description

一种除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1及其编码基因与应用。

背景技术

白花除虫菊(Tanacetum cinerariifolium，又名除虫菊)是一种菊科匹菊属多年生观赏兼抗虫植物，其花头中富含的除虫菊酯具有杀虫高效、杀虫广谱和环境无残留以及不易产生耐药性等优点，因此成为国际上公认的安全无污染植物源杀虫剂，并且除虫菊是目前世界上唯一集约化种植的生物农药-除虫菊酯的植物源。除此之外，除虫菊花朵还大量合成一些倍半萜类的挥发性物质参与到植物与昆虫的互作中，其中，大根香叶烯D(GD)作为一种倍半萜类物质，广泛存在于各种植物、微生物，以及海洋生物中，是一些酯类和萜类物质的重要前体，其不仅具有抗菌活性，还可作为氨基糖苷类和氮唑类的辅助试剂，同时也具有广泛的抗虫和杀虫作用。除虫菊作为古老的抗虫植物，对其生物活性物质的功能研究及开发利用显得尤为重要。

自然界中，GD具有300多种同分异构形式，其中(-)-GD作为一种信号分子，能够吸引夜间有效传粉者-夜蛾类昆虫，促进植物的传粉过程。目前，市场上的大根香叶烯D主要来源于植物提取。由于植物生长周期长，且提取工艺复杂，因此提取的产品面临成本高，纯度低的问题。由于昆虫对挥发物信号的识别通常是单一且特异的，而植物提取的产品通常是多种异构体的混合形式，其纯度很难满足人们对其功能的开发和利用。因此，开发制备单一且特异性的大根香叶烯D的合成方法尤为重要。近年来，随着分子生物学技术的发展，人们已经从一些植物中克隆得到大根香叶烯D合成酶的基因，将该大根香叶烯D合成酶的基因在体外进行表达纯化后，能特异性的以FPP为前体物质合成大根香叶烯D，但关于除虫菊中的大根香叶烯D合成酶的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对以上现有技术中的不足，提供一种除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1及其编码基因与应用。本发明从除虫菊中克隆得到大根香叶烯D合成酶的基因，将该大根香叶烯D合成酶的基因在体外进行表达纯化后，经纯化后的大根香叶烯D合成酶能特异性的以FPP为前体物质合成大根香叶烯D，可用于大根香叶烯D的大规模生产。

本发明的一个目的在于提供一种除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1。

所述除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供一种除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1的编码基因。

所述除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，与本发明所述的除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1氨基酸序列具有50％以上相似性的序列，或与其具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物，例如，将氨基酸序列经过一个或多个取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列也属于本发明的保护范围。与本发明所述的除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1的编码基因的核苷酸序列具有50％以上相似性的序列也属于本发明的保护范围。

本发明也提供了一种重组表达载体，包含上述除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1的编码基因。

本发明还提供了一种宿主细胞，由上述重组表达载体转化获得。

进一步地，所述宿主细胞选自酵母、藻类、霉菌和细菌中的一种。

更进一步地，所述细菌选自大肠杆菌Top10或大肠杆菌BL21(DE3)中的一种。

本发明的又一个目的在于提供一种制备上述除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1的方法，包括如下步骤：

S1、利用PCR技术扩增如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

S2、将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列克隆至载体质粒中，构建含有除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1基因的表达载体；

S3、将所述表达载体转入宿主细胞中获得重组菌体，所述重组菌体依次经过扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎菌体和蛋白纯化过程得到除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1。

进一步地，步骤S2中，所述表达载体为pET6xHN-C。

进一步地，步骤S3中，所述蛋白纯化过程是用Ni-NTA亲和层析色谱柱进行纯化。

本发明的最后一个目的在于提供上述除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1在制备大根香叶烯D中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明从除虫菊中克隆得到大根香叶烯D合成酶的基因，将该大根香叶烯D合成酶的基因在体外进行表达纯化后，经纯化后的大根香叶烯D合成酶能特异性的以FPP为前体物质合成大根香叶烯D，可用于大根香叶烯D的大规模生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明GDS基因3个剪切体的转录本相似性比对分析结果图；

图2为本发明GDS不同剪切体与植物中其他物种的氨基酸结构比对分析结果图；

图3为本发明除虫菊GDS基因克隆结果分析图；

图4为本发明TcGDS1、TcGDS2和TcGDS3单个或组合瞬时转化烟草叶片挥发物的测定结果图；

图5为本发明目的蛋白TcGDS1的SDS-PAGE检测结果图；

图6为本发明TcGDS1酶活性检测分析结果图；

图7为本发明除虫菊大根香叶烯D旋光异构体的鉴定结果图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

其他常规试剂和设备，如无特别说明，均可市售获得；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1除虫菊GDS基因的克隆和序列分析

RNA提取：采取除虫菊(种植于华中农业大学花卉基地)幼嫩叶片，迅速置于液氮中保存，按照TRIzol RNA提取试剂盒步骤进行RNA提取，然后用反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。

cDNA合成：取1μl总RNA，按照TransScript II One-Step一步法试剂盒(全式金生物技术有限公司，北京)操作说明进行反转录，上述实验操作过程使用的离心管、pcr管、枪头均是去RNAase耗材。具体操作按表1.1体系加入下列各成分：

表1.1 RNA反转录体系

除虫菊GDS基因序列的克隆：以除虫菊花头的cDNA序列为模板，设计特异引物，利用高保真酶进行PCR扩增，扩增体系如表1.2所示，扩增程序如表1.3所示，所述引物序列如下所示：

GD-F-orf-F：AATCAGACTTTCGATATAATGGCT(SEQ ID NO.3)；

GD-F-orf-R：ACGCTTTCCCTATAAGTCACAG(SEQ ID NO.4)。

表1.2 GDS基因PCR扩增体系

表1.3 PCR扩增程序

对上述扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用EasyPure Quick GelExtraction Kit试剂盒(全式金生物技术有限公司)进行纯化回收，然后进行酶连反应，反应体系如表1.4所示：

表1.4 pCloneEZ-TOPO载体连接体系

从-80℃冰箱取出大肠杆菌DH5α感受态，迅速放入冰中，待感受态即将完全融化时，加入5μl上述连接产物，轻轻拨打管底混匀，冰上静置30min，42℃水浴45s，迅速放回冰上，静置2min；向离心管中加入450μl标准的LB培养基，混匀后37℃，200r/min，复苏60min；5000r/min，离心2min，收集菌体，留取100μl上清，用移液器枪轻轻吸打混匀，并涂布接种含相应抗生素的LB固体培养基上，将接种后的培养基在37℃恒温箱中过夜培养，次日挑取单克隆进行阳性检测。

除虫菊GDS基因序列的比对分析：利用DNAMAN软件(LynnonBiosoft，USA)和GenBank数据库中的NCBI BLAST程序对测序后的序列信息进行比对分析；利用DNAMAN和CLUSTAL_X version 1.83对不同物种的GDS氨基酸序列进行比对分析。

经过测序和比对分析，如图1所示，除虫菊GDS基因有3个不同的ORF序列：分别为TcGDS1，长度为1650bp；TcGDS2长度为1396bp；TcGDS3，长度为1301bp；如图2和图3所示，其中TcGDS1作为完整转录本，翻译549Aa，编码的蛋白大小为77kD；TcGDS2在1146-1399bp发生缺失，提前终止，翻译394Aa，编码的蛋白大小为47kD；TcGDS3在285-633bp发生缺失，提前终止，翻译108Aa，编码的蛋白大小为13kD；将不同剪切体表达的氨基酸序列与植物中其他物种的GDS进行对比，发现TcGDS1和TcGDS2编码的氨基酸序列具有保守的DDXXD结构域，而TcGDS3对应的氨基酸序列不具备该结构域。

实施例2除虫菊GDS基因瞬时转化烟草

农杆菌的培养：将含有融合载体及空载的农杆菌接种于LB固体培养基(含50mg/Lkana)，在28℃恒温箱培养两天活化，进行阳性检测后，挑阳性单克隆于10ml的LB液体培养基(含50mg/L kana)中过夜初摇；次日，吸取1ml初摇的菌液于50ml LB液体培养基(含50mg/L kana，20μmol/L AS，20mmol/L MES)中再次摇菌至OD₆₀₀＝0.6，然后收集农杆菌。

农杆菌的收集与重悬：将OD₆₀₀＝0.6的农杆菌装入50ml灭菌的离心管中，4000r/min，10℃，离心15min，收集菌体；用配好的重悬液重选收集的农杆菌至OD₆₀₀＝0.6，然后在28℃恒温箱中静置2h(期间晃动1至2次，防治菌体沉积)，用于注射烟草叶片。

重悬液的配置：500ml无菌水中分别加入MES母液(1mol/L，抽滤灭菌)至终浓度为10mmol/L、AS母液(10mmol/L，抽滤灭菌)至终浓度为20μmol/L、MgCl₂母液(1mol/L，高温灭菌)至终浓度为10mmol/L、最后加入高温灭菌的1mol/L NaOH调pH至5.6，充分混匀备用(以上操作均在无菌条件下进行，各成分用量可根据浓度和pH进行调整)。

瞬时转化本式烟草：用体积为1ml的无菌注射器将重悬好的菌液从本式烟草叶片的背面注入，每棵烟草注射2-3片完全展开的嫩叶；每个目标基因和空载至少注射6棵长势相近的本式烟草，用于挥发物的检测。注射完后做好标记，在植物培养室黑暗条件下培养60h进行挥发物的检测。在注射烟草叶片时，除了用含有单个基因的菌液注射烟草叶片外，还进行了基因的组合注射烟草，具体组合方式为：TcGDS1+TcGDS2；TcGDS1+TcGDS3；TcGDS1+TcGDS2+TcGDS3。

代谢物测定：将注射了相关载体并暗培养60h后的烟草叶片剪下放入容积为20ml密闭的玻璃瓶中(玻璃瓶提前洗干净并烘干)平衡10min，然后用固相微萃取(Solid PhaseMicroextraction，SPME)萃取头从上部盖子插入，吸附30min后直接用于GC-MS分析检测。采用手动进样方式，GC-MS分析仪器(日本岛津；手性色谱柱(Agilent，USA；30m×0.25mm×0.25μm))和程序如下：

GC的设置：进样口温度为200℃，进样方式为不分流，升温程序起始温度为40℃，保持3.5min；10℃/min的升温速率升温至100℃，保持3min；然后以5℃/min的速率升温到230℃，保持5min，总程序时间为46.5min。

MS的设置：接口温度为220℃，载入气体为氦气，流速为1.2ml/min，离子源温度为220℃，EI电离模式，电子能量为70ev，扫描范围为40-450amu。

如图4所示，结果发现，瞬时转化了TcGDS1基因的烟草叶片挥发物中能够检测到大根香叶烯D的存在，而对照组以及瞬时转化了TcGDS2和TcGDS3的烟草叶片挥发物中并没有检测到大根香叶烯D，这表明瞬时转化的TcGDS1能够在烟草叶片内合成大根香叶烯D，并能够从烟草叶片中释放到外界环境中，而瞬时转化的TcGDS2和TcGDS3不能在烟草叶片中催化合成大根香叶烯D。为了进一步分析TcGDS2和TcGDS3是否具备其他的功能或者对TcGDS1有其他作用，随后进行了组合菌液瞬时转化烟草的实验，分析组合菌液注射烟草的叶片挥发物成分，结果发现，注射含有TcGDS1组合菌液的烟草叶片挥发物中均有检测到大根香叶烯D，且并没有出现其他新的物质。因此，初步判断只有TcGDS1能够催化合成大根香叶烯D，而TcGDS2和TcGDS3不具备催化合成大根香叶烯D的功能。

实施例3除虫菊TcGDS1融合蛋白的诱导表达及纯化

除虫菊TcGDS1基因原核表达载体构建：将实施例1扩增克隆得到的除虫菊TcGDS1基因的cDNA全长序列用带EcoRI(GAATTC)(Fermentas，Thermo Fisher Scientific Inc,USA)酶切位点的引物，以高保真酶进行扩增，pET6xHN-C载体采用表2中的体系进行酶切。然后用同源重组的方法将回收的ORF片段正确克隆到载体pET6xHN-C(Clontech，www.clontech.com)上，该载体含有(His)6-tag标签用于后期重组蛋白的纯化，然后提取重构好的载体质粒并转化大肠杆菌DE3细胞，挑单克隆测序确定没有发生移码突变，用于后期原核表达实验。所述引物序列如下所示：

pet-C-GDS1-F：TCTAAGCTTGCGAATTCTGCTTTAAGAGAAAATGAAATTATTCG(SEQ IDNO.5)

pet-C-GDS1-R：GCGGCCGCCAGAATTTATACTCATAGCATGAACGAAATG(SEQ ID NO.6)

表2 EcoR I酶切体系

大肠杆菌的培养及诱导：将含有融合表达载体以及空载的大肠杆菌DE3细胞接种于LB固体培养基(含50mg/L Amp)上在37℃恒温箱过夜培养活化；随后挑取单克隆于10mlLB液体培养基(含50mg/L Amp)中37℃过夜初摇；之后，取初摇后的菌液于50ml LB液体培养基(含50mg/L Amp)中继续37℃摇至OD₆₀₀＝0.6；取出1ml菌液于1.5ml离心管中冰上保存，作为未诱导对照，其余菌液加入IPTG(最终浓度为mM)诱导剂，30℃诱导5～7h后，3000rpm离心15min回收菌体。

蛋白的提取和纯化：按照HisTALON^TM Gravity Column Purification Kit UserManual(Clontech，www.clontech.com)操作说明进行菌液裂解、蛋白提取和纯化；具体操作方法步骤如下：每毫克收集的菌体(OD₆₀₀＝0.6，1ml菌液约有2mg菌)加入20μl TractorBuffer，每2ml Tractor Buffer加入1μl DNAse(1u/μL)，重悬菌体后冰浴45-60min；4℃，12000r/min离心20min，取上清至干净的离心管中；保存部分上清液进行SDS-PAGE分析。其余放置冰上用于蛋白纯化(提取之后要在2-4h内进行纯化)。

重力流柱纯化：将重力柱和所有缓冲液平衡至工作温度，打开重力柱之前，要完全悬浮基质(防止顶盖附近的树脂损失)，整个纯化过程在4℃进行，同时去除所有溶剂中的气体。平衡：用5-10倍柱体积(5ml)的平衡缓冲液(Equilibration Buffer)平衡层析柱；上样：将澄清的样品加到柱中，1ml/管收集组分(为了防止沉淀堵塞层析柱，过柱子的样品最好过0.45μM的滤膜过滤)；用8倍柱体积的平衡缓冲液(Equilibration Buffer)洗柱，然后用7倍柱体积的Wash buffer洗柱(含10mM咪唑的Equilibration Buffer)；(注：Wash buffer的制备：660μl的Elution buffer和9.34mL的Equilibration buffer混合)；用大约5-8倍柱体积的Elution buffer(含15mM咪唑)洗脱，1ml/管收集组分；通过测量洗脱组分在280nm处的吸收值或Bradford方法检测蛋白质的洗脱，收集的组分进行SDS-PAGE分析。为了后续试验不受影响，通过PD-10柱过滤去除纯化的蛋白溶液中过量的咪唑，加入20ml EquilibrationBuffer或者20mM MES，0.3M NaCl pH 5.0洗柱，以备多次纯化相同的蛋白。为了增加保存时间(大于1周)，每次使用之后用5倍柱体积的水洗柱，然后装满20％乙醇，盖上底盖和顶盖封闭后，存于4℃。

SDS-PAGE分析：向纯化蛋白中加入5×SB buffer，95℃加热6min。制备SDS-PAGE蛋白胶，缓慢向电泳槽中加入4ml分离胶缓冲液，立即加入1mL双蒸水，20min后，待分离胶缓冲液凝固后，倒出双蒸水，用滤纸吸干水分；缓慢继续加入1ml浓缩胶缓冲液，凝固后备用。将纯化蛋白点样，180V跑胶40min，小心将PAGE胶取下，用蒸馏水浸泡10min后，加入固定液固定1h，倒掉固定液，加入染色液染色1h，倒掉染色液，加入脱色液脱水至胶呈现透明，观察及拍照。结果见图5所示，M为蛋白marker，泳道1为空载；泳道2为未诱导破壁上清液；泳道3为诱导破壁上清液；泳道4为纯化目标蛋白。

除虫菊TcGDS1融合蛋白的体外酶促反应：利用Bradford方法测定纯化蛋白的浓度，酶促反应方法如下：加28μg纯化蛋白于100μl的反应体系中，加入100μl正己烷覆盖吸收反应中产生的挥发物，30℃孵育1h；反应结束后，涡旋震荡结束反应，之后6000r/min离心10min，分离有机相和水相，取1μl有机相进行GC-MS检测分，检测方法同实施例2中一致；结果见图6，从图中可以看出，纯化得到的蛋白能高效催化底物FPP产生目标物质大根香叶烯D(GD)，进一步表明除虫菊TcGDS1具有催化合成大根香叶烯D的功能。

实施例4除虫菊GD旋光异构体的鉴定

将除虫菊叶片置于液氮速冻，充分研磨后称取200mg除虫菊叶片粉末，加入到含有1ml正己烷的1.5ml棕色进样瓶中充分震荡混匀，4℃过夜浸提，然后用无水硫酸钠过滤水分，装入新的进样瓶中，取1μl提取液用于GC-MS分析检测，GC-MS分析仪器和程序实施例2；结果见图7，从图中可以看出，通过与已报道的加拿大一枝黄花提取物进行比较分析，发现除虫菊中只含一种结构形式的大根香叶烯D，为左旋异构体(-)-Germacrene D(GD)，并且与体外酶活检测的结果一致。

以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1及其编码基因与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1650

<212> DNA

<213> 除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)

<400> 1

atggctttaa gagaaaatga aattattcga cccaaagcga attttcatcc aagcgtttgg 60

ggagatcaat ttctcgttta tgaagagccg gaagatcagg ttgaggtaga aaagatggtt 120

gagggtttaa gagaagaagt gaggaaagaa atagtggcgg ctttggatga tccgtcaaag 180

cataccgatt tgttgatact agttaatgaa gtccagcgcc tcggcatagc ctactatttt 240

gaagaggaga ttgagcgagc cttgaagcat atttatgata catacggtga tcattggaag 300

ggtggtagcg cgccactttg gtttcggctc cttcgacaac aaggcttcta tgtttcatgt 360

gatatattca atcaatacaa ggataacaca gggtctttta aggaatcctt aaccaatgat 420

gttcatggca tgcttgagtt gtatgaggca gcatatatga gggttgatgg tgaagtaata 480

ttagatgatg ctcttgtttt tacaaaaact catcttgata agatatcaaa ggattctatt 540

cgatgcaact caactctttc taagtacata caagactcac tagagcgacc tatacgtaaa 600

aggttaccca gagtagatgc attgcactac atacctttct atgaacaaca agtgtctcat 660

aataagtcgt tactaaggct ttcgaagtta gggttcaact tgctacaatc catgcacaag 720

aaagagctta gcgaactgtt caagtggtgg aaacattttg atgttccaaa gaacatacct 780

tacatgagaa atagatttgt cgagaactac ttttgggcat tgggtgcata ctttgagcca 840

caatattctc gtgctaggat cttcttaaca aaagtgtttg catttgcaac aatgctagat 900

gacacttatg atgcgtacgg tatttacgaa gaacttgaga tcttcaccca agcagttgaa 960

aggtggtcac ttagctgctt ggatgcactc ccccattaca tgaaactaat atacaaaggc 1020

ctcttggatt tgtatgaaga aatggaggac attatggcaa aggaggcaac accaactcat 1080

gttaaatatg ctaaagaggc gatgaaagag ttcatcggaa gttatatgac agaagcaaga 1140

tggaaacatg aaggatatgt gccaactaca gaggagcaca aatcagttac atttgttagt 1200

tccgggtaca aaatgcttac aattgccagt tttgttggca tgggtgatat agcatcagaa 1260

gattcattca agtgggctct ttctaatcct ccactcatca aagcttcatg ttccatttgt 1320

aggatgatgg acgacgttgt tggtcacaag gaagagaaag aaagagttgg agggcatgtt 1380

gcatcctctg tagattccta catgaagcag cacgatgtca cagaggagtg tgtttatgat 1440

ttgttcaaca cactagttga agatgcgtgg aaagctctaa accgggagtc actaatatgc 1500

aaagaaattc caatgcttct caagatgcgt gtgatcaact tgacatgctt tatcgatacc 1560

ttgtataaat atgaagatac cttcacaaat gtcgggccag aactcataga ttgtatcaaa 1620

tttcatttcg ttcatgctat gagtatatga 1650

<210> 2

<211> 549

<212> PRT

<213> 除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)

<400> 2

Met Ala Leu Arg Glu Asn Glu Ile Ile Arg Pro Lys Ala Asn Phe His

1 5 10 15

Pro Ser Val Trp Gly Asp Gln Phe Leu Val Tyr Glu Glu Pro Glu Asp

20 25 30

Gln Val Glu Val Glu Lys Met Val Glu Gly Leu Arg Glu Glu Val Arg

35 40 45

Lys Glu Ile Val Ala Ala Leu Asp Asp Pro Ser Lys His Thr Asp Leu

50 55 60

Leu Ile Leu Val Asn Glu Val Gln Arg Leu Gly Ile Ala Tyr Tyr Phe

65 70 75 80

Glu Glu Glu Ile Glu Arg Ala Leu Lys His Ile Tyr Asp Thr Tyr Gly

85 90 95

Asp His Trp Lys Gly Gly Ser Ala Pro Leu Trp Phe Arg Leu Leu Arg

100 105 110

Gln Gln Gly Phe Tyr Val Ser Cys Asp Ile Phe Asn Gln Tyr Lys Asp

115 120 125

Asn Thr Gly Ser Phe Lys Glu Ser Leu Thr Asn Asp Val His Gly Met

130 135 140

Leu Glu Leu Tyr Glu Ala Ala Tyr Met Arg Val Asp Gly Glu Val Ile

145 150 155 160

Leu Asp Asp Ala Leu Val Phe Thr Lys Thr His Leu Asp Lys Ile Ser

165 170 175

Lys Asp Ser Ile Arg Cys Asn Ser Thr Leu Ser Lys Tyr Ile Gln Asp

180 185 190

Ser Leu Glu Arg Pro Ile Arg Lys Arg Leu Pro Arg Val Asp Ala Leu

195 200 205

His Tyr Ile Pro Phe Tyr Glu Gln Gln Val Ser His Asn Lys Ser Leu

210 215 220

Leu Arg Leu Ser Lys Leu Gly Phe Asn Leu Leu Gln Ser Met His Lys

225 230 235 240

Lys Glu Leu Ser Glu Leu Phe Lys Trp Trp Lys His Phe Asp Val Pro

245 250 255

Lys Asn Ile Pro Tyr Met Arg Asn Arg Phe Val Glu Asn Tyr Phe Trp

260 265 270

Ala Leu Gly Ala Tyr Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Arg Ala Arg Ile Phe

275 280 285

Leu Thr Lys Val Phe Ala Phe Ala Thr Met Leu Asp Asp Thr Tyr Asp

290 295 300

Ala Tyr Gly Ile Tyr Glu Glu Leu Glu Ile Phe Thr Gln Ala Val Glu

305 310 315 320

Arg Trp Ser Leu Ser Cys Leu Asp Ala Leu Pro His Tyr Met Lys Leu

325 330 335

Ile Tyr Lys Gly Leu Leu Asp Leu Tyr Glu Glu Met Glu Asp Ile Met

340 345 350

Ala Lys Glu Ala Thr Pro Thr His Val Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Met

355 360 365

Lys Glu Phe Ile Gly Ser Tyr Met Thr Glu Ala Arg Trp Lys His Glu

370 375 380

Gly Tyr Val Pro Thr Thr Glu Glu His Lys Ser Val Thr Phe Val Ser

385 390 395 400

Ser Gly Tyr Lys Met Leu Thr Ile Ala Ser Phe Val Gly Met Gly Asp

405 410 415

Ile Ala Ser Glu Asp Ser Phe Lys Trp Ala Leu Ser Asn Pro Pro Leu

420 425 430

Ile Lys Ala Ser Cys Ser Ile Cys Arg Met Met Asp Asp Val Val Gly

435 440 445

His Lys Glu Glu Lys Glu Arg Val Gly Gly His Val Ala Ser Ser Val

450 455 460

Asp Ser Tyr Met Lys Gln His Asp Val Thr Glu Glu Cys Val Tyr Asp

465 470 475 480

Leu Phe Asn Thr Leu Val Glu Asp Ala Trp Lys Ala Leu Asn Arg Glu

485 490 495

Ser Leu Ile Cys Lys Glu Ile Pro Met Leu Leu Lys Met Arg Val Ile

500 505 510

Asn Leu Thr Cys Phe Ile Asp Thr Leu Tyr Lys Tyr Glu Asp Thr Phe

515 520 525

Thr Asn Val Gly Pro Glu Leu Ile Asp Cys Ile Lys Phe His Phe Val

530 535 540

His Ala Met Ser Ile

545

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcagactt tcgatataat ggct 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgctttccc tataagtcac ag 22

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctaagcttg cgaattctgc tttaagagaa aatgaaatta ttcg 44

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcggccgcca gaatttatac tcatagcatg aacgaaatg 39

Claims (10)

1.一种除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1的编码基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于，由权利要求3所述的重组表达载体转化获得。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自酵母、藻类、霉菌和细菌中的一种。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述细菌选自大肠杆菌Top10或大肠杆菌BL21(DE3)中的一种。

7.一种制备权利要求1所述的除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、利用PCR技术扩增如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

S2、将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列克隆至载体质粒中，构建含有除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1基因的表达载体；

S3、将所述表达载体转入宿主细胞中获得重组菌体，所述重组菌体依次经过扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎菌体和蛋白纯化过程得到除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1。

8.如权利要求7所述的制备除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1的方法，其特征在于，步骤S2中，所述表达载体为pET6xHN-C。

9.如权利要求7所述的制备除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1的方法，其特征在于，步骤S3中，所述蛋白纯化过程是用Ni-NTA亲和层析色谱柱进行纯化。

10.权利要求1所述的除虫菊大根香叶烯D合成酶TcGDS1在制备大根香叶烯D中的应用。