CN113215184B

CN113215184B - 一种桔梗鲨烯合酶基因PgSQS及其编码的产物和应用

Info

Publication number: CN113215184B
Application number: CN202110613332.7A
Authority: CN
Inventors: 桂双英; 余函纹; 查良平; 彭华胜; 刘梦丽; 李景
Original assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Current assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2041-06-02
Also published as: CN113215184A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种桔梗鲨烯合酶基因PgSQS及其编码的产物和应用；这种基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列相似度大于50％的核苷酸序列，通过在细胞中转入PgSQS基因，在宿主细胞中表达桔梗鲨烯合酶，利用桔梗鲨烯合酶促进三萜类化合物的合成。

Description

一种桔梗鲨烯合酶基因PgSQS及其编码的产物和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种桔梗鲨烯合酶基因PgSQS及其编码的产物和应用。

背景技术

桔梗始载于《神农本草经》，列为下品，味辛，性微温。2020年版《中国药典》记载桔梗来源于桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，有宣肺，利咽，祛痰，排脓的功能。目前，已从桔梗中分离得到三萜皂苷类、黄酮类、聚炔类、酚酸类等百余种化合物。桔梗提取物有抗肿瘤、护肝、抗炎、抗氧化等药理作用。

三萜皂苷是桔梗中主要的活性成分，结构复杂，功效多样。现代药理学研究表明桔梗皂苷具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、保肝等生物活性。从桔梗中分离得到的皂苷类化合物均为齐墩果烷型的五环三萜皂苷。鲨烯合酶(Squalene Synthase,SQS)是桔梗皂苷生物合成途径中的一个关键酶，SQS催化法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate，FPP)生成甾醇、三萜等物质的共同前体鲨烯。SQS作为催化甾醇和三萜类生物合成途径中的重要调节点，其活性直接影响着甾醇、三萜等化合物的生物合成。然而，目前关于桔梗三萜合成途径的鲨烯合酶基因还未被分离和鉴定。

鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。

发明内容

本发明的目的在于解决关于桔梗三萜合成途径的鲨烯合酶基因还未被分离和鉴定的问题，提供了一种桔梗鲨烯合酶基因PgSQS及其编码的产物和应用。

为了实现上述目的，本发明公开了一种桔梗鲨烯合酶基因PgSQS，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列相似度大于50％。

本发明还公开了上述桔梗鲨烯合酶基因PgSQS编码的产物，编码产物的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

编码产物的氨基酸序列与SEQID NO.2所示的氨基酸序列相似度大于50％。

编码产物为与桔梗鲨烯合酶PgSQS氨基酸具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物中的任意一种。

本发明还公开了上述桔梗鲨烯合酶PgSQS的特异性引物，所述包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。

本发明还公开了含有上述桔梗鲨烯合酶PgSQS的表达载体；优选的，所述表达载体为pGEX-4T-1。

本发明还公开了含有上述桔梗鲨烯合酶PgSQS的基因工程。

本发明还公开了上述桔梗鲨烯合酶PgSQS在制备三萜类化合物中的应用。

与现有技术比较本发明的有益效果在于：本发明所提供的桔梗鲨烯合酶PgSQS基因是首次从桔梗植物种克隆制备所得。桔梗鲨烯合酶(PgSQS)是桔梗主要活性成分皂苷类物质生物合成的的关键调控基因，可用于调节桔梗中的桔梗皂苷含量，该酶可以应用于以法尼基焦磷酸(FPP)为底物制备鲨烯的通路。利用本发明所提供的基因可以通过基因工程技术提高桔梗药效成分桔梗皂苷的含量，可用于其大量生成，为制备桔梗的三萜类化合物提供了研究方向。

附图说明

图1为桔梗鲨烯合酶PgSQS的琼脂糖凝胶电泳图；

图2～5为桔梗鲨烯合酶PgSQS结构功能域预测分析；

图6为桔梗鲨烯合酶PgSQS系统进化树；

图7为PgSQS蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；

图8为鲨烯(squalene)标准品离子流图；

图9为鲨烯(squalene)标准品质谱图；

图10为PgSQS蛋白催化法尼基焦磷酸(FPP)产物的总离子流图；

图11为PgSQS催化FPP在保留时间33.839min峰的质谱图；

图12为空载pGEX-4T-1标准品离子流图；

图13为空载pGEX-4T-1在保留时间33.839min峰的质谱图。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

反转录试剂盒PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自TakaraBio公司；无毒型4S Green Plus核酸染料购于上海生工生物工程股份有限公司；切胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit、T载体pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、E.coli Transetta(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；高保真酶Phusion、BamH I等限制性内切酶购自纽英伦(NEB)生物技术北京有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

一、桔梗鲨烯合酶PgSQS基因的克隆

PgSQS的克隆利用正向引物：上游引物：P1：5’ATGGGGAGTTTGGGGGCGATATTGA3’；下游引物：P2：5’TCACAAAGTCACACGAGTACTATTT3'。以桔梗鲨烯合酶PgSQS编码基因全长序列为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为(50μL)：模板cDNA 1μL，引物primer-F和primer-R各2.5μL，Phusion High-Fidelity 25μL，其余反应体积用无菌双蒸水补足。PCR反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸2min，40个循环后72℃延伸5min，4℃保存。如图1所示，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增产物大小在1000bp-2000bp之间，与目的基因长度相符，至此获得了桔梗鲨烯合酶PgSQS基因克隆。

二、PgSQS基因的生物信息学分析

本发明所获得的桔梗鲨烯合酶基因全长cDNA，PgSQS基因的开放阅读框(ORF)的长度为1257bp，详细序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。将PgSQS基因序列用NCBI数据库中的BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索，该基因在氨基酸水平上与其他物种中的SQS有较高的同源性，同时具有典型的Isoprenoid_Biosyn_C1 superfamily结构域，如图2所示；通过在线软件NPS进行蛋白质二级结构分析，PgSQS蛋白的二级结构由α螺旋，延伸链和无规则卷曲构成(图3)；通过在线软件TMHMM进行蛋白序列的跨膜结构域分析，PgSQS具有一个跨膜结构域，位于387-406，如图4所示；通过在线软件Swiss Model预测PgSQS蛋白的三级结构，如图5所示，PgSQS蛋白模型3vj8.1.A，得分为0.79，蛋白序列的相似性为47.89％；通过软件MEGA7构建Neighbor-joining系统进化树，bootstrap重复次数为1000次，如图6所示，桔梗PgSQS与菊科植物母菊序列和菊科植物熊胆草位于同一分支点，其亲缘关系最高。

三、PgSQS基因原核表达载体的构建

以PgSQS基因的cDNA为模板，选择BamHI为单酶切位点，设计特异性上游引物和下游引物(如表1所示)，进行PCR扩增反应，引物中划线部分为酶切位点。

表1特异性上游引物和下游引物

PCR反应体系为(50μL)：模板cDNA 1μL，引物primer-F和primer-R各2.5μL，Phusion High-Fidelity 25μL，其余反应体积用无菌双蒸水补足。PCR反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸2min，40个循环后72℃延伸5min，4℃保存。将扩增后的产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并对其进行切胶回收。对表达载体pGEX-4T-1质粒分别进行BamH I酶切处理，并进行切胶回收。将切胶回收后的目的片段与表达载体pGEX-4T-1用无缝拼接试剂盒在50℃连接30min，将连接产物转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，挑取单克隆进行菌液PCR阳性检验、测序及提取质粒。保存具有正确目标序列的重组质粒pGEX-PgSQS用于表达转化。

四、工程菌的诱导表达

用目标质粒pGEX-PgSQS转化E.coli transetta(DE3)感受态细胞，培养筛选含有pGEX-PgSQS质粒的阳性菌株E.coli transetta(DE3)-PgSQS。该菌株含有可诱导PgSQS重组基因的高效表达。将阳性克隆E.coli transetta(DE3)-PgSQS按照1:100的比例接种于含Amp抗性的LB培养液中，37℃，200rpm振荡培养至A₆₀₀＝0.4～0.6，加入终浓度为0.4mM IPTG于20℃低温诱导过夜，以同样条件处理pGEX-4T-1空载作为空白对照。取1mL菌液离心获取沉淀作为全菌，剩余菌液离心去上清以获得菌体，加3-5mL Buffer A，重悬，加5μL浓度为1M的DTT使其终浓度为1mM，转移至15mL离心管置于超声破碎仪中超声破碎有效时长5min(5s间隔)，25％超声效率，离心管插入装有冰的烧杯中，于冰上操作。超声破碎裂解液于4℃离心15min后获得PgSQS基因的上清与沉淀，进行12％SDS-PAGE电泳分析。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，在分子量约为65kDa处，出现一条明显的特异蛋白质表达条带，与理论值一致(如图7)。其中泳道1为Protein Ruler Marker l，泳道2为含有pGEX-4T-1空载体的E.coli transetta(DE3)全菌；泳道3为未诱导的PgSQS全菌；泳道4为诱导的PgSQS全菌；泳道5为诱导的PgSQS上清。

五、体外酶功能验证

1.纯化蛋白的制备：在工程菌的诱导表达中得到PgSQS上清，吸取1mL上清与已清洗的500μL GST Resin混合于2mL离心管中；放入冰盒中，于定轨振荡器上，120rpm，摇1h以上；4℃，500×g,离心5min弃上清；加入1mL Buffer A重悬，4℃，500×g，离心5min弃上清，重复三次；加入200μL Buffer B洗脱，4℃，500×g，离心5min，存于-80℃冰箱。

2.PgSQS酶功能验证：以FPP为反应底物进行体外酶功能，反应体系为：100mMTris-HCl(pH 7.5)，10mM FPP，10mM MgCl₂，1mM DTT，2％Glycine，3mM NADPHNa₄和375μL酶液。混匀，32℃水浴6h。直接加入1倍体积正己烷，涡悬提取3次(1mL×3次)，合并提取液。真空浓缩至干，加200μL正己烷复溶，取1μL进样，以鲨烯作为标准品。GC-MS检测反应GC-MS分析条件为：120℃，3min；15℃/min升至180℃；25℃/min升至260℃；保持25min。对产物进行定性，结果发现鲨烯标准品在GC中保留时间为33.839min(图8)，具有m/z69[CH₃(CH₃)＝CHCH₂-]+、410[M]+等特征离子峰(图9)。如图10所示，样品在保留时间33.833min存在特征峰，如图11所示，样品特征峰也具有m/z69[CH₃(CH₃)＝CHCH₂-]+、410[M]+等特征离子峰，同样被定性为鲨烯(squalene)。而空载体对照样品中没有检测到相应的特征峰(图12，13)。因此可以认定pGEX-PgSQS具有催化FPP合成鲨烯的活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 安徽中医药大学

<120> 一种桔梗鲨烯合酶基因PgSQS及其编码的产物和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1158

<212> DNA

<213> 桔梗(Platycodon grandiflorum Jacq. A. DC.)

<400> 1

atggggagtt tgggggcgat attgaagcat ccggatgatt tctacccgtt gttgaagcta 60

aaaatggcgg caaagaaagc ggagaagcag atccctccgg agccacactg gggattctgt 120

tactctatgc ttcacaaagt ttctcgaagc ttcgccctcg ttattcaaca gctcggcacc 180

gagcttcgtg acgctgtgtg catcttttat ttggttcttc gagcccttga tactgtcgag 240

gatgatacaa gcatagaaac cgaggttaaa gtacctatcc ttattgcctt tcatcgtcat 300

atctatgatt gtgactggca ctttgcatgt ggtactaagg agtacaaagt tctcatggat 360

cagttccatc atgtttctac tgcctttctg gagcttggaa gcagttatca ggaggcaatt 420

gaggatatta ccatgagaat gggggcagga atggcaaaat ttatatgcaa ggaggtggaa 480

acagttgatg actatgatga atactgtcac tacgtagcgg gacttgttgg attaggcttg 540

tcgaagctct ttcatgcctc tggcaaggaa attttattac cagattctct ctccaattca 600

atgggattgt ttctgcagaa aacaaacatt attcgagatt atctggaaga cataaatgag 660

ataccaaagt cgcgcatgtt ttggcctcgc cagatttgga gtaaatatgt caataaactt 720

gaggacttga agtatgagga aaactcaacc aaggctgtgc agtgcctgaa tgacatggtt 780

acaaatgctt taattcatgt agaagattgt ttgaagtaca tgtctgactt gcgagatcca 840

gcaatcttca agttttgtgc tataccacag atcatgtcaa tcggaacgct agctctatgt 900

tacaataaca ttgaagtctt cagaggggtc gtcaagatga gacgaggtct tactgcaaaa 960

gttatcgacc gaacaaaaac aatggcagac gtttatggtg ctttctacga ttttgcttcc 1020

atgctgaagt ccaaggttga catgaatgat cccaatgcta caaagacact gagtaggctt 1080

gatgcaattc agaaaacttg cagagactcc ggaaccctgg ctaaaaggaa atcttacata 1140

attgagagcg atgcaaaa 1158

<210> 2

<211> 386

<212> PRT

<213> 桔梗(Platycodon grandiflorum Jacq. A. DC.)

<400> 2

Met Gly Ser Leu Gly Ala Ile Leu Lys His Pro Asp Asp Phe Tyr Pro

1 5 10 15

Leu Leu Lys Leu Lys Met Ala Ala Lys Lys Ala Glu Lys Gln Ile Pro

20 25 30

Pro Glu Pro His Trp Gly Phe Cys Tyr Ser Met Leu His Lys Val Ser

35 40 45

Arg Ser Phe Ala Leu Val Ile Gln Gln Leu Gly Thr Glu Leu Arg Asp

50 55 60

Ala Val Cys Ile Phe Tyr Leu Val Leu Arg Ala Leu Asp Thr Val Glu

65 70 75 80

Asp Asp Thr Ser Ile Glu Thr Glu Val Lys Val Pro Ile Leu Ile Ala

85 90 95

Phe His Arg His Ile Tyr Asp Cys Asp Trp His Phe Ala Cys Gly Thr

100 105 110

Lys Glu Tyr Lys Val Leu Met Asp Gln Phe His His Val Ser Thr Ala

115 120 125

Phe Leu Glu Leu Gly Ser Ser Tyr Gln Glu Ala Ile Glu Asp Ile Thr

130 135 140

Met Arg Met Gly Ala Gly Met Ala Lys Phe Ile Cys Lys Glu Val Glu

145 150 155 160

Thr Val Asp Asp Tyr Asp Glu Tyr Cys His Tyr Val Ala Gly Leu Val

165 170 175

Gly Leu Gly Leu Ser Lys Leu Phe His Ala Ser Gly Lys Glu Ile Leu

180 185 190

Leu Pro Asp Ser Leu Ser Asn Ser Met Gly Leu Phe Leu Gln Lys Thr

195 200 205

Asn Ile Ile Arg Asp Tyr Leu Glu Asp Ile Asn Glu Ile Pro Lys Ser

210 215 220

Arg Met Phe Trp Pro Arg Gln Ile Trp Ser Lys Tyr Val Asn Lys Leu

225 230 235 240

Glu Asp Leu Lys Tyr Glu Glu Asn Ser Thr Lys Ala Val Gln Cys Leu

245 250 255

Asn Asp Met Val Thr Asn Ala Leu Ile His Val Glu Asp Cys Leu Lys

260 265 270

Tyr Met Ser Asp Leu Arg Asp Pro Ala Ile Phe Lys Phe Cys Ala Ile

275 280 285

Pro Gln Ile Met Ser Ile Gly Thr Leu Ala Leu Cys Tyr Asn Asn Ile

290 295 300

Glu Val Phe Arg Gly Val Val Lys Met Arg Arg Gly Leu Thr Ala Lys

305 310 315 320

Val Ile Asp Arg Thr Lys Thr Met Ala Asp Val Tyr Gly Ala Phe Tyr

325 330 335

Asp Phe Ala Ser Met Leu Lys Ser Lys Val Asp Met Asn Asp Pro Asn

340 345 350

Ala Thr Lys Thr Leu Ser Arg Leu Asp Ala Ile Gln Lys Thr Cys Arg

355 360 365

Asp Ser Gly Thr Leu Ala Lys Arg Lys Ser Tyr Ile Ile Glu Ser Asp

370 375 380

Ala Lys

385

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 桔梗(Platycodon grandiflorum Jacq. A. DC.)

<400> 3

atggggagtt tgggggcgat attga 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 桔梗(Platycodon grandiflorum Jacq. A. DC.)

<400> 4

tcacaaagtc acacgagtac tattt 25

Claims

1.一种桔梗鲨烯合酶基因PgSQS，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述的桔梗鲨烯合酶基因PgSQS所编码的产物，其特征在于，编码产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种如权利要求1所述的桔梗鲨烯合酶基因PgSQS的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物如SEQ ID NO.4所示。

4.一种包含权利要求1所述的桔梗鲨烯合酶基因PgSQS的重组表达载体。

5.如权利要求1所述的桔梗鲨烯合酶基因PgSQS的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pGEX-4T-1。

6.一种包含权利要求1所述的桔梗鲨烯合酶基因PgSQS的基因工程菌。

7.一种如权利要求1所述的桔梗鲨烯合酶基因PgSQS在制备三萜类化合物中的应用。