CN113186210A

CN113186210A - 一种茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1及其编码的产物和应用

Info

Publication number: CN113186210A
Application number: CN202110564389.2A
Authority: CN
Inventors: 查良平; 彭华胜; 吴君贤; 尹旻臻; 徐睿; 方清影
Original assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Current assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2021-07-30

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1及其编码的产物和应用，这种基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，通过在细胞中转入AlSQS1基因，在宿主细胞中表达茅苍术鲨烯合酶，利用茅苍术鲨烯合酶促进甾醇类化合物的合成；这种茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1及其编码的产物和应用，通过基因工程技术提高茅苍术药效成分β‑谷甾醇的含量。

Description

一种茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1及其编码的产物和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1及其编码的产物和应用。

背景技术

2020版《中国药典》中记载菊科植物茅苍术Atractylodeslancea(Thunb.)DC.是苍术的药用植物来源之一，入药部位为其根状茎，有祛风、散寒、燥湿健脾、明目等功能。江苏茅山(句容、金坛等地)一带是茅苍术历史道地产区，茅苍术之名由此而来。由于市场对茅苍术的需求与日俱增，导致茅山苍术的野生资源数量锐减，野生茅苍术资源处于濒危状态。

萜类化合物是茅苍术的主要化学成分之一，种类繁多、结构多样、药理活性广泛。目前发现苍术属植物中倍半萜类化合物具有抗炎、抗肿瘤、保护神经系统、保肝、抗菌、抗病毒等药理作用。茅苍术化学成分具有多样性，目前已报道的成分有多糖、黄酮、生物碱、萜类、木质素、甾醇及挥发油等，其中甾醇类成分主要为β-谷甾醇。β-谷甾醇是一种植物甾醇，据多项研究表明β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗抑郁、抗脱发等生物活性。β-谷甾醇为三萜类成分，其生物合成途径中的一个关键酶为鲨烯合酶。鲨烯合酶(SqualeneSynthase，SQS)催化两个分子的法尼基焦磷酸(FPP)生成鲨烯，它在三萜和甾醇的生物合成中起着关键作用。由于鲨烯合酶催化的底物FPP处于异类戊二烯代谢途径中的分支点，因此鲨烯合酶的活性能够直接影响甾醇和三萜等类异戊二烯化合物的生物合成。所以对茅苍术鲨烯合酶(AlSQS)基因进行研究，能够为通过基因工程技术提高茅苍术活性成分β-谷甾醇的含量提供重要技术支持。但是本领域目前尚未有关于茅苍术鲨烯合酶基因及其编码的氨基酸序列的相关研究。

鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。

发明内容

本发明的目的解决如何通过茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS及其编码的氨基酸序列制备鲨烯合酶的问题，提供了一种茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1及其编码的产物和应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

所述基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

其中，当所述基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列时，该基因cDNA的开放阅读框长度为1257bp。

本发明还提供了一种上述基因编码产物，所述产物为RNA、多肽或蛋白质中的任意一种，所述产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，在不影响其活性的前提下，取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列，该突变序列也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种含有上述茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1的重组表达载体；所述重组表达载体为质粒pGEX-4T-1。

本发明还提供了一种含有上述茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1的宿主细胞；所述宿主细胞为组培获得的茅苍术愈伤组织、茅苍术植株的细胞、E.colitransetta(DE3)细胞中的任意一种。

所述宿主细胞含有所述茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1或其重组表达载体。本发明所提供的基因AlSQS1，连接于可以引导外源基因在植物表达中的表达载体制备得到基因AlSQS1的重组表达载体。优选的情况下，所述表达载体为质粒pGEX-4T-1。本发明的基因AlSQS1在构建到表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导性启动子均可，同时必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定和筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择标记，通常可使用的标记是对抗生素抗性酶的基因和生物安全标记，也可以是GUS、GFP等可以产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。

本发明还公开了一种上述茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1的特异性引物，包括如SEQID NO.3所示的上游引物，以及如SEQ ID NO.4所示的下游引物。所述特异性引物对可以通过聚合链式反应(PCR)扩增得到基因AlSQS1的核苷酸序列。

本发明还公开了上述茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1及其编码的产物在制备甾醇类或三萜类化合物中的应用。所述应用包括在细胞中转入AlSQS1基因，在宿主细胞中表达茅苍术鲨烯合酶，利用茅苍术鲨烯合酶促进甾醇类或三萜类化合物的合成。

所述甾醇类化合物为β-谷甾醇。

与现有技术比较本发明的有益效果在于：本发明所提供的茅苍术鲨烯合酶(AlSQS1)基因是首次从茅苍术植物种克隆制备所得。茅苍术鲨烯合酶(AlSQS1)是茅苍术甾醇和三萜合成途径的关键调控基因，可用于调节茅苍术的β-谷甾醇含量，该酶可以应用于以法尼基焦磷酸(FPP)为底物制备鲨烯的通路。利用本发明所提供的基因可以通过基因工程技术提高茅苍术药效成分β-谷甾醇的含量，可用于其大量生成，有助于优质茅苍术的基因工程育种。

附图说明

图1为茅苍术萜类合酶基因AlSQS1的琼脂糖凝胶电泳图；

图2～5为茅苍术萜类合酶基因AlSQS1结构功能域预测分析；

图6为茅苍术萜类合酶基因AlSQS1系统进化树；

图7为AlSQS1蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；

图8为鲨烯(squalene)标准品离子流图；

图9为鲨烯(squalene)标准品质谱图；

图10为AlSQS1蛋白催化法尼基焦磷酸(FPP)产物的总离子流图；

图11为AlSQS1催化FPP在保留时间33.888min峰的质谱图；

图12为空载pGEX-4T-1标准品离子流图；

图13为空载pGEX-4T-1在保留时间33.888min峰的质谱图。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

反转录试剂盒PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自TakaraBio公司；无毒型4S Green Plus核酸染料购于上海生工生物工程股份有限公司；切胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit、T载体pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、高保真酶TransStartFastPfu Fly DNA Polymerase(含2.5mM dNTPs)、E.coliTransetta(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；BamH I等限制性内切酶购自纽英伦(NEB)生物技术北京有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

一、茅苍术鲨烯合酶AlSQS1基因的克隆

AlSQS1的克隆利用正向引物：上游引物：ALSQS1-F：5'-ATGGGGAGTTTAAAGGCAGTGTTGA-3'；下游引物：ALSQS1-R：5'-TTACAAACTAACTTTCATTTTATTT-3'。以茅苍术鲨烯合酶AlSQS1编码基因全长序列为模板进行PCR扩增。扩增体系如下：5×Buffer 10μL，dNTP(2.5mmol·L^-1)4μL，引物primer-F和primer-R各1μL，TransStartFastPfu Fly DNA Polymerase 1μL，模板1μL，其余用无菌双蒸水补足。反应条件：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环后72℃延伸5min，4℃保存。至此获得了茅苍术鲨烯合酶AlSQS1基因克隆。

二、AlSQS1基因的生物信息学分析

本发明所获得的茅苍术鲨烯合酶基因全长cDNA，AlSQS1基因的开放阅读框(ORF)的长度为1257bp，详细序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。将AlSQS1基因序列用NCBI数据库中的BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索,该基因在氨基酸水平上与其他物种中的SQS有较高的同源性，同时具有典型的Isoprenoid_Biosyn_C1superfamily结构域，如图2所示；AlSQS1蛋白二级结构由α螺旋，延伸链和无规则卷曲，如图3所示；如图4所示，AlSQS1具有一个跨膜结构域，位于386-408aa；利用Swiss Model预测蛋白质的三级结构，如图5所示，AlSQS1蛋白模型3weg.1.A，得分为0.61，蛋白序列的相似性为47.89％；用MEGA6软件构建Neighbor-joining系统进化树，如图6所示，茅苍术AlSQS1序列与菊科植物黄花蒿序列位于同一分支点，其亲缘关系最高。

三、AlSQS1基因原核表达载体的构建

以AlSQS1 cDNA为模板，设计特异性上游引物和下游引物(如表1所示)，进行PCR扩增反应，引物中划线部分为酶切位点。

表1引物序列

引物名称	序列名称	碱基序列(5’→3’)
			AlSQS1-F	SEQ ID NO.3	<u>CGGATCTGGTTCCGCGTGGA</u>ATGGGGAGTTTAAAGGCAGTGT
AlSQS1-R	SEQ ID NO.4	<u>CGACCCGGGAATTCCGGGGA</u>TTACAAACTAACTTTCATTTTA

以重组质粒为模板，进行PCR扩增。将扩增后的产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并对其进行切胶回收。对切胶回收后的产物与表达载体pGEX-4T-1质粒分别进行BamH I酶切处理，并进行切胶回收。将切胶回收后的目的片段与表达载体pGEX-4T-1用无缝拼接试剂盒在50℃连接30min，将连接产物转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，挑取单克隆进行菌液PCR阳性检验、测序及提取质粒。

四、工程菌的诱导表达

用目标质粒pGEX-ALSQS1转化E.coli transetta(DE3)感受态细胞，培养筛选含有pGEX-ALSQS1质粒的阳性菌株E.colitransetta(DE3)-ALSQS。取转化表达菌液按照1:100的比例加到含Amp抗性的LB培养液中，37℃，200rpm振荡培养至A₆₀₀＝0.4～0.6，加入终浓度为0.4mM IPTG于16℃低温诱导过夜，以同样条件处理pGEX-4T-1空载作为空白对照。取1mL菌液离心获取沉淀作为全菌，剩余菌液离心去上清以获得菌体，加3-5mL Buffer A，重悬，加5μL浓度为1M的DTT使其终浓度为1mM，转移至15mL离心管置于超声破碎仪中超声破碎有效时长5min(5s间隔)，25％超声效率，离心管插入装有冰的烧杯中，于冰上操作。超声破碎裂解液于4℃离心15min后获得AlSQS1基因的上清与沉淀，进行12％SDS-PAGE电泳分析。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，在分子量约为68kDa处，出现一条明显的特异蛋白质表达条带，与理论值一致(如图7)。其中泳道1为Protein Ruler Marker l，泳道2为含有pGEX-4T-1空载体的E.coli transetta(DE3)全菌；泳道3为未诱导的AlSQS1全菌；泳道4为诱导的AlSQS1全菌；泳道5为诱导的AlSQS1上清。

五、体外酶功能验证

1.纯化蛋白的制备：在工程菌的诱导表达中得到AlSQS1上清，吸取1mL上清与已清洗的500μL GST Resin混合于2mL离心管中；放入冰盒中，于定轨振荡器上，120rpm，摇1h以上；4℃，500×g，离心5min弃上清；加入1mL Buffer A重悬，4℃，500×g，离心5min弃上清，重复三次；加入200μL Buffer B洗脱，4℃，500×g，离心5min，存于-80℃冰箱。

2.AlSQS1酶功能验证：以FPP为反应底物进行体外酶功能，反应体系为:100mMTris-HCl(pH 7.5)，10mM FPP，10mM MgCl₂，1mM DTT，2％Glycine，3mM NADPH-Na4及475μL酶液。混匀，水浴32℃，6h。直接加入1倍体积正己烷，涡悬提取3次(1mL×3次)，合并提取液。真空浓缩至干，加60μL正己烷复溶，取1μL进样，以鲨烯作为标准品。GC-MS检测反应GC-M S分析条件为：120℃3min，15℃/min升至180℃，25℃/min升至260℃，保持25min，对产物进行定性，结果如图8～13所示，结果发现鲨烯标准品在GC中保留时间为32.889min，样品在保留时间为32.888min存在特征峰，而空载体对照样品中没有检测到相应的特征峰，再对样品产物中的特征峰进行GC–MS分析定性为鲨烯(squalene)，同时有m/z69[CH₃(CH₃)＝CHCH₂-]⁺、410[M]⁺等特征离子峰，因此可以认定pGEX-ALSQS具有催化FPP合成鲨烯的活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 安徽中医药大学

<120> 一种茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1及其编码的产物和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1257

<212> DNA

<213> Atractylodeslancea(Thunb.) DC

<400> 1

atggggagtt taaaggcagt gttgaagcat ccggacgatt tttacccgtt gttgaagctg 60

aagatggcgg cgaagaaggc ggagaaacag atcccggcgg agccacattg gggattctgt 120

tactctatgc ttcataaggt ttctagaagc ttcgcactcg ttattcaaca gctccaaccc 180

cagcttcgtg acgctgtgtg cattttttat ttggttcttc gcgctcttga cactgtcgag 240

gatgatacaa gtatagatgc tgatatcaaa gtacccattt tgatcgcctt tcatgagcat 300

atctatgatc gtgactggca cttcgcatgt ggtacaaagg aatacaaagt tctaatggac 360

cagttccatc atgtttctac tgcctttctg gagcttaaca aaagttatca ggatgcaatt 420

aaggatataa ccatgagaat gggtgcaggg atggcaaaat ttatatgtaa agaggttgag 480

acaattgatg attatgacga gtattgtcat tatgttgcgg gacttgttgg attagggttg 540

tcgaagctct tctatgcctc aggcacagaa attttgtttc cggattctct ctcaaattca 600

atgggtttat ttctccagaa aacaaacatc attagagatt atctggagga tataaatgag 660

atacccaagt cacgcatgtt ttggcctcgt gagatctgga gtaaatatgt gaacaaacta 720

gaggacctta agtacgaaga gaactccgag aaggccgttc agtgcctcaa tgatatggtg 780

acaaatgctt tgattcacat tgaagactgt ttgaaatata tgtccgactt gcgtgatcca 840

gctatcttca agttttgtgc tataccgcag atcatggcaa ttggaacact agctttatgt 900

tacaacaata ttgaagtttt caggggtgtc gtgaaaatga gacgtggtct tactgcaaaa 960

gtaattgata ggactaagac aatggcagat gtgtacagtg ctttttacga cttttcttcg 1020

atgctcaagt ccaaggttga catgaatgat ccaaatgcca gaacaacaat cagcaggata 1080

gaagcagctc agaaaatttg cagggactct ggcactctta acaataggaa atcctacatt 1140

gttaagggag agtcaagcta cagtccggct ctgattgctt tggttttcat tatactggca 1200

atcatttacg cgtatctgac tgctaatcga ccaaataaaa tgaaagttag tttgtaa 1257

<210> 2

<211> 418

<212> PRT

<213> Atractylodeslancea(Thunb.) DC

<400> 2

Met Gly Ser Leu Leu Ala Val Leu Leu His Pro Ala Ala Pro Thr Pro

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Met Ala Ala Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Pro

20 25 30

Ala Gly Pro His Thr Gly Pro Cys Thr Ser Met Leu His Leu Val Ser

35 40 45

Ala Ser Pro Ala Leu Val Ile Gly Gly Leu Gly Pro Gly Leu Ala Ala

50 55 60

Ala Val Cys Ile Pro Thr Leu Val Leu Ala Ala Leu Ala Thr Val Gly

65 70 75 80

Ala Ala Thr Ser Ile Ala Ala Ala Ile Leu Val Pro Ile Leu Ile Ala

85 90 95

Pro His Gly His Ile Thr Ala Ala Ala Thr His Pro Ala Cys Gly Thr

100 105 110

Leu Gly Thr Leu Val Leu Met Ala Gly Pro His His Val Ser Thr Ala

115 120 125

Pro Leu Gly Leu Ala Leu Ser Thr Gly Ala Ala Ile Leu Ala Ile Thr

130 135 140

Met Ala Met Gly Ala Gly Met Ala Leu Pro Ile Cys Leu Gly Val Gly

145 150 155 160

Thr Ile Ala Ala Thr Ala Gly Thr Cys His Thr Val Ala Gly Leu Val

165 170 175

Gly Leu Gly Leu Ser Leu Leu Pro Thr Ala Ser Gly Thr Gly Ile Leu

180 185 190

Pro Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Met Gly Leu Pro Leu Gly Leu Thr

195 200 205

Ala Ile Ile Ala Ala Thr Leu Gly Ala Ile Ala Gly Ile Pro Leu Ser

210 215 220

Ala Met Pro Thr Pro Ala Gly Ile Thr Ser Leu Thr Val Ala Leu Leu

225 230 235 240

Gly Ala Leu Leu Thr Gly Gly Ala Ser Gly Leu Ala Val Gly Cys Leu

245 250 255

Ala Ala Met Val Thr Ala Ala Leu Ile His Ile Gly Ala Cys Leu Leu

260 265 270

Thr Met Ser Ala Leu Ala Ala Pro Ala Ile Pro Leu Pro Cys Ala Ile

275 280 285

Pro Gly Ile Met Ala Ile Gly Thr Leu Ala Leu Cys Thr Ala Ala Ile

290 295 300

Gly Val Pro Ala Gly Val Val Leu Met Ala Ala Gly Leu Thr Ala Leu

305 310 315 320

Val Ile Ala Ala Thr Leu Thr Met Ala Ala Val Thr Ser Ala Pro Thr

325 330 335

Ala Pro Ser Ser Met Leu Leu Ser Leu Val Ala Met Ala Ala Pro Ala

340 345 350

Ala Ala Thr Thr Ile Ser Ala Ile Gly Ala Ala Gly Leu Ile Cys Ala

355 360 365

Ala Ser Gly Thr Leu Ala Ala Ala Leu Ser Thr Ile Val Leu Gly Gly

370 375 380

Ser Ser Thr Ser Pro Ala Leu Ile Ala Leu Val Pro Ile Ile Leu Ala

385 390 395 400

Ile Ile Thr Ala Thr Leu Thr Ala Ala Ala Pro Ala Leu Met Leu Val

405 410 415

Ser Leu

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Atractylodeslancea(Thunb.) DC

<400> 3

atggggagtt taaaggcagt gttga 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Atractylodeslancea(Thunb.) DC

<400> 4

ttacaaacta actttcattt tattt 25

Claims

1.一种茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1，其特征在于，该基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种如权利要求1所述的茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1所编码的产物，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1所编码的产物，其特征在于，所述产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种如权利要求1所述的茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1的特异性引物，其特征在于，包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物，以及如SEQ ID NO.4所示的下游引物。

5.一种含有如权利要求1所述的茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1的重组表达载体。

6.如权利要求5所述的茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1的重组表达载体，其特征在于，所述表达重组表达载体为质粒pGEX-4T-1。

7.一种含有如权利要求1所述的茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1的宿主细胞。

8.如权利要求7所述的含有茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1重组表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为组培获得的茅苍术愈伤组织、茅苍术植株的细胞、E.colitransetta(DE3)细胞中的任意一种。

9.一种如权利要求1所述的茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1和其编码产物在制备甾醇类或三萜类化合物中的应用。

10.如权利要求9所述的一种的茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS1和其编码产物的应用，其特征在于，所述甾醇类化合物为β-谷甾醇。