CN103352034A

CN103352034A - 沉香倍半萜合酶蛋白ass4及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN103352034A
Application number: CN2013102940303A
Authority: CN
Inventors: 张争; 魏建和; 梁良; 韩晓敏; 徐艳红; 杨云; 高志晖; 刘洋洋; 孟慧; 陈旭玉
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2013-10-16

Abstract

本发明提供了一种沉香倍半萜合酶蛋白ASS4及其编码基因ASS4，所述蛋白为：（1）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（2）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由（1）衍生的蛋白质。本发明还提供了所述沉香倍半萜合酶蛋白ASS4的制备方法和应用。本发明的沉香倍半萜合酶蛋白ASS4可以用于体外催化沉香倍半萜，将本发明所述基因ASS4转化原核细胞、酵母或更高级的真核细胞，使其具备相应的沉香倍半萜合酶活性，从而实现大批量生产沉香倍半萜，减少珍稀濒危南药白木香资源的破坏，具有重要的经济价值和应用前景。

Description

沉香倍半萜合酶蛋白ASS4及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种沉香倍半萜合酶蛋白ASS4及其编码基因和应用。

背景技术

我国传统名贵药材沉香来自珍稀濒危植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg（中华人民共和国药典编委会.2010.中华人民共和国药典（第一部）.北京：中国医药科技出版社.）。沉香入药在我国传统中医学、藏医学和印度传统医学中已有几千年的历史。香港也因其历史上盛产和出口沉香而得名。由于沉香的高价值（目前特级沉香块国际成交价高达$10000/千克）且国际市场需求极大，长期以来白木香遭到掠夺式过度砍伐，其原始林已经基本破坏殆尽（张争，杨云，魏建和，陈旭玉，孟慧，汪孟曦．白木香枝枯病病原菌的鉴定．中国中药杂志，2013，38（11）82-86．）。

健康白木香树不能产生沉香倍半萜等药效物质，树体必须受到伤害胁迫后才能够产生。虽然目前在海南岛、广东南部基地已建成树龄在8年以上的白木香基地十余个，总规模达10万株以上，但能提供市场的沉香药材还非常少，特别是优质沉香药材极其匮乏（张争，杨云，魏建和，孟慧，汪孟曦，韩晓敏，隋春．白木香茎中内源茉莉酸类和倍半萜类物质对机械伤害的响应．园艺学报，2013b，40(1)：163-168．）。造成该现状的一个主要的技术瓶颈问题就是缺乏稳定、高效的白木香结香技术，难以有针对性地开展大规模、产业化人工生产沉香药材。为加速和提高白木香结香量，自20世纪30年代国内外就开展了大量人工结香技术研究，但因沉香诱导形成机制一直未得到揭示，导致稳定、高效的结香技术一直没有突破（张争，杨云，魏建和，孟慧，隋春，陈怀琼．白木香结香机理研究进展及防御反应诱导结香假说．中草药，2010，41(1)：19-21.）。为解析伤害诱导白木香结香的生物合成途径及分子调控机制，项目组采用高通量RNA-seq测序技术获得了包含8万条伤害、健康白木香转录组文库，并成功地从白木香伤害转录组文库中克隆到2条伤害诱导表达的沉香倍半萜合酶基因部分序列（张争，高志晖，魏建和，徐艳红，李滢，杨云，孟慧，隋春，汪孟曦．三年生白木香机械伤害转录组学研究．药学学报，2012，47(8):1106-1110．）。

自第一个倍半萜合酶－烟草5-epi-aristolochene合酶的基因被克隆以来（Facchini P J,Chappell J.Gene family for an elicitor-inducedsesquiterpene cyclase in Tobacco.Proc Nat Acad Sci.USA,1992,89:11088-11092.），迄今为止，己有30余种植物倍半萜合酶的cDNA被克隆，包括棉花的(+)-δ-杜松烯合酶基因、荷花玉兰β-荜澄茄油萜合酶基因、金合欢烯合酶基因，在美洲油棕和青蒿中克隆到倍半萜合酶基因，在姜和罗勒中克隆到大根香叶烯-D合酶基因等。不同倍半萜合酶（sesquiterpenoid synthase）与焦磷酸金合欢酯（farnesylpyrophosphate,FPP）绑定在一起，经过异构化、离子化，重排等最后形成结构各异的倍半萜类化合物（Degenhardt J,Kollner TG,Gershenzon J.Monoterpene and sesquiterpene synthases and the origin ofterpene skeletal diversity in plants.Phytochemistry,2009,70:1621-1637.）。倍半萜合酶是合成倍半萜类次生代谢最终产物的关键酶，因此倍半萜合酶基因的克隆、分离及特性分析成为了倍半萜生物合成研究的热点和焦点。

发明内容

针对上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种沉香倍半萜合酶蛋白。

本发明的第二个目的在于提供编码所述蛋白的基因。

本发明的目的还在于提供上述蛋白及基因的应用。

本发明的技术方案是：从白木香中分离得到沉香倍半萜合酶基因ASS4，并在原核系统中验证其功能。

本发明提供了沉香倍半萜合酶蛋白ASS4，所述蛋白为：

（1）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（2）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由（1）衍生的蛋白质。

本发明还提供了所述沉香倍半萜合酶蛋白ASS4的编码基因ASS4，优选地，所述基因的cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了含有所述沉香倍半萜合酶基因ASS4的载体。优选地，所述载体为重组表达载体。

进一步优选地，所述重组表达载体为pET-28a-ASS4，所述重组表达载体pET-28a-ASS4的构建方法包括如下步骤：

（1）提取伤害处理后的白木香总RNA，以白木香总RNA为模板，合成cDNA的第一条链；

（2）以cDNA为模板，以引物ASSF和引物ASSR为引导进行PCR，扩增目的基因ASS4；

（3）将目的基因ASS4克隆至pGEM-T-easy载体，获得载体pGEM-T-ASS4；

（4）将载体pGEM-T-ASS4和pET-28a分别用BamHI和XhoI进行双酶切，回收ASS4基因片段和pET-28a载体片段，连接，获得重组表达载体pET-28a-ASS4。

步骤（2）中，PCR反应体系为：

cDNA 3μl

dNTP（2.5mM） 1μl

高保真度的PCR DNA聚合酶（Pfu Ultra Ⅱ Fusion HS DNAPolymerase） 1μl

高保真度的PCR DNA聚合酶缓冲液（Pfu Ultra Ⅱ Fusion HSDNA Polymerase Buffer） 5μl

引物ASS F 1μl

引物ASS R 1μl

ddH₂O 38μl；

ASSF：5’-ggATCCATgTCTTCggCAAAACTAggTTCT-3’（SEQID No.3）；

ASSR：5’-CTCgAgTCAgATTTCAATAgCATgACgCAAC-3’（SEQ ID No.4）。

PCR反应程序为:95℃5min（预变性）；95℃1min（变性），69℃1min（退火每个循环降1℃），72℃2min（延伸），共16个循环；95℃1min，54℃1min，72℃2min，共35个循环；72℃10min。

步骤（3）中，由于PCR中高保真酶Pfu酶扩增片段不带A末端，应使用平末端连接试剂盒先加A末端后再连接。目的基因ASS4平末端DNA片段3′末端加A，具体的反应体系为：

反应条件为72℃，保温30min。

本发明的基因和蛋白质可以从白木香中克隆或分离得到，或者通过DNA或肤合成的方法得到。

本发明还提供了含有所述重组表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞包括重组菌，如大肠杆菌、农杆菌、真菌等。

将本发明基因ASS4与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述重组表达载体导入宿主，得到转ASS4基因的转化体，例如农作物或者树木等植物，使其具备产生沉香倍半萜功能。

本发明还提供了一种制备沉香倍半萜合酶蛋白的方法，其为将上述基因ASS4或含ASS4的重组表达载体转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明所述沉香倍半萜合酶蛋白。

本发明还提供了所述沉香倍半萜合酶基因ASS4在制备沉香倍半萜中的应用。所述应用为将上述基因ASS4或含ASS4的重组表达载体转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明所述沉香倍半萜合酶蛋白，再进一步制备沉香倍半萜。

实验证实：将原核重组表达载体pET-28a-ASS4转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中，IPTG诱导蛋白表达，纯化后，对倍半萜合成底物FPP进行催化，通过GC-MS检测，结果表明本发明的沉香倍半萜合酶可被用于将法尼基焦磷酸催化Cyclohexane,1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-、β-榄香烯(β-elemene)、α-愈创烯(α-guaiene)、α-石竹烯(α-Caryophyllene)和δ-愈创烯(δ-guaiene)等5种倍半萜。

本发明还提供了所述沉香倍半萜合酶基因ASS4在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供了所述沉香倍半萜合酶基因ASS4在提高植物沉香倍半萜合成中的应用。所述应用为将所述基因ASS4或含ASS4的重组表达载体转化植物，使所述植物具备相应的沉香倍半萜合酶活性，从而实现大批量生产沉香倍半萜。

优选地，所述植物为烟草、拟南芥或番茄等。

本发明沉香倍半萜合酶蛋白ASS4可以用于体外催化沉香倍半萜，将本发明所述基因ASS4转化原核细胞、酵母或更高级的真核细胞，包括植物细胞和哺乳动物细胞，植物细胞如烟草、拟南芥、番茄等，使其具备相应的沉香倍半萜合酶活性，从而实现大批量生产沉香倍半萜，减少珍稀濒危南药白木香资源的破坏，具有重要的经济价值和应用前景。

附图说明

图1是白木香总RNA电泳图。

图2是白木香沉香倍半萜合酶ASS4基因的PCR扩增电泳图，其中，M：DL2000；1：PCR产物。

图3是重组表达质粒pET-28a-ASS4诱导表达产物检测，其中，M：Marker；1：pET-28a载体；2、3：IPTG诱导蛋白表达；4：未加IPTG诱导表达。

图4是蛋白纯化产物检测，其中，M：Marker；1：ASS4纯化蛋白。

图5是ASS4蛋白催化FPP产物的总离子流图，其中，Mcounts表示丰度，代表物质的响应值，1：Cyclohexane,1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-；2：β-榄香烯(β-elemene)；3：α-愈创烯(α-guaiene)；4：α-石竹烯(α-Caryophyllene)；5：δ-愈创烯(δ-guaiene)。

图6是Cyclohexane,1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-的质谱图及标准品质谱图，其中，左图为Cyclohexane,1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-的质谱图，右图为标准品质谱图。

图7是β-榄香烯(β-elemene)的质谱图及标准品质谱图，其中，左图为β-榄香烯(β-elemene)的质谱图，右图为标准品质谱图。

图8是α-愈创烯(α-guaiene)的质谱图及标准品质谱图，其中，左图为α-愈创烯(α-guaiene)的质谱图，右图为标准品质谱图。

图9是α-石竹烯(α-Caryophyllene)的质谱图及标准品质谱图，其中，左图为α-石竹烯(α-Caryophyllene)的质谱图，右图为标准品质谱图。

图10是δ-愈创烯(δ-guaiene)的质谱图及标准品质谱图，其中，左图为δ-愈创烯(δ-guaiene)的质谱图，右图为标准品质谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

pGEM-T-easy载体购自Promega公司。

M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit购自宝生物工程（大连）有限公司。

Total RNA Purification Kit试剂盒购自LC Sciences公司。

普通DNA产物纯化试剂盒购自北京天根生化科技（北京）有限公司。

平末端连接试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。

实施例1ASS4的克隆

1.1白木香总RNA的提取及检测

取伤害处理后白木香茎部，液氮研磨成细粉，称取0.5g细粉，依照Total RNA Purification Kit试剂盒方法提取白木香总RNA。具体步骤如下：

（1）取白木香粉末500mg，加入600μl裂解液(Lysis Solution)后混匀样品。

（2）混合均匀后，12000rpm离心2min，将上清液转移到新的离心管中。

（3）加入与上清液等体积（约600μl）的70%的乙醇，充分震荡，涡旋混匀。

（4）将离心柱放入离心管中加入上述液体，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

（5）加入400μl含有DNAseI的洗涤液，12000rpm离心1min，倒掉废液。

（6）重复步骤（5）。

（7）用400μl的洗涤液洗柱子，12000rpm离心1min。重复洗柱一次。

（8）倒掉收集管中废液，将离心柱放回收集管中离心2min，室温下放置一段时间使其变干，弃掉收集管。

（9）将离心柱放入试剂盒中的1.7ml抽提管内，加入50μl抽提液。

（10）12000rpm离心2min。为提高所提取的RNA浓度，将所提RNA重新加入离心柱中，12000rpm离心2min。

采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA，白木香总RNA电泳图如图1所示。采用Nano-Drop2000核酸/蛋白定量仪，检测RNA浓度，剩余RNA置于-80℃保存备用。

1.2cDNA第一条链的合成

以白木香总RNA为模板，参照M-MLV RTase cDNA SynthesisKit说明书的方法合成cDNA的第一条链。

（1）在微量离心管中配制表1所示反应液，全量20μl。

表1

（2）轻柔搅拌混匀。

（3）室温放置10min后，42℃反应1h。

（4）冰中冷却2min。

1.3引物的设计

根据白木香高通量测序结果，运用DNAMAN和Primer5.0软件设计特异引物如下：

ASSF：5’-ggATCCATgTCTTCggCAAAACTAggTTCT-3’（SEQID No.3）；

ASSR：5’-CTCgAgTCAgATTTCAATAgCATgACgCAAC-3’（SEQ ID No.4）。

引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.4RT-PCR扩增及电泳检测

以反转录产物cDNA为模板，以引物ASSF和引物ASSR为引导，进行PCR扩增。反应体系如表2所示：

表2

根据引物合成的退火温度，设置了touch-down PCR程序，保证得到较好的扩增效果。

PCR程序：95℃5min（预变性）；95℃1min（变性），69℃1min（退火每个循环降1℃），72℃2min（延伸），共16个循环；95℃1min，54℃1min，72℃2min，共35个循环；72℃10min。4℃保存。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳图如图2所示。

1.5PCR产物纯化

采用普通DNA产物纯化试剂盒纯化PCR产物，操作步骤如下：

（1）向吸附柱中加入500μl平衡液，12000rpm离心1min，弃掉废液。

（2）在PCR产物中加入5倍PCR反应液体积的结合液，充分混匀。

（3）所得溶液加入吸附柱，放置2min，12000rpm离心60s，倒掉废液。

（4）加入600μl漂洗液，12000rpm，离心60s，倒掉废液。

（5）再次加入600μl漂洗液，12000rpm离心60s，倒掉废液。

（6）12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。放置数分钟，彻底晾干。

（7）将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μl洗脱缓冲液，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集纯化产物溶液。

（8）为了提高DNA的回收量，将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤（7）。

1.6目的片段与pGEM-T-easy载体的连接与转化

由于PCR中高保真酶Pfu酶扩增片段不带A末端，应使用平末端连接试剂盒先加A末端后再连接。

（1）向纯化后的平末端DNA片段3′末端加A，具体的反应体系如表3所示。

表3

（2）反应条件：72℃，保温30min。

（3）pGEM-T-easy载体在冰上融化，短暂离心，避免液体挂在离心管壁上。

（4）按照表4所示内容，在无菌离心管中加入各成分，具体的量根据PCR产物浓度而定，使载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8。将加A末端后的目的片段和pGEM-T-easy载体连接，获得载体pGM-T-ASS4。

表4

（5）轻微混合后，短暂离心。16℃过夜。

（6）转化过程：

（a）向含有Amp抗生素的固体琼脂平板表面加入16μl IPTG（50mg/ml），40μl X-gal（20mg/ml），均匀后避光37℃放置1-2h，使X-gal中的二甲基甲酰胺挥发干净。

（b）转入感受态细胞：

i.取5μl连接产物加入到E.coli TOP10感受态细胞中，轻微混匀，冰浴30min。

ii.42℃水浴90s，冰浴2min。

iii.加入600μl不含抗生物的LB培养基，150rpm，37℃震荡培养45min。

iv.混匀菌液，吸取少量加到含有Amp^r的LB固体琼脂培养基上，涂均。干燥后倒置平板，37℃培养16h。

（7）检测：

将平板上的白色菌落接种于3ml LB（含有终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素）液体培养基中，37℃，200rpm震荡，培养过夜，保存菌种后提取质粒，应用PCR方法鉴定插入片段是否正确。

PCR体系如表5所示：

表5

PCR程序：Lid 114℃，95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃5min，4℃保存。

PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，获得阳性菌液。

1.7测序鉴定：

将阳性菌液送由Invitrogrn Biotechlogy Co.,Ltd英骏公司测序，得到正确的阳性转化子。

沉香倍半萜合酶蛋白ASS4的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码基因ASS4的cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2沉香倍半萜合酶基因ASS4的功能验证

2.1白木香倍半萜合酶基因原核重组表达载体的构建

2.1.1碱裂解法提取质粒

采用TIANGEN公司的高纯度质粒小提中量试剂盒提取质粒，具体操作如下：

（1）向吸附柱中加入500μl的平衡液，12000rpm，离心1min，倒掉废液。

（2）取15ml菌液加入离心管中，12000rpm，离心1min，除净上清。

（3）加入500μl溶液Ⅰ，斡旋悬浮细菌细胞沉淀。

（4）加入500μl溶液Ⅱ，翻转6～8次使菌体充分裂解。

（5）加入700μl的溶液Ⅲ，上下翻转6～8次，充分混匀，出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min。

（6）将上清液分次加入过滤柱，12000rpm，离心2min，收集滤过溶液分次加入吸附柱中。

（7）12000rpm，离心1min，倒掉废液。

（8）加入500μl的去蛋白液，12000rpm，离心1min，倒掉废液。

（9）加入600μl漂洗液，12000rpm离心1min，倒掉废液。

（10）再加入600μl的漂洗液，12000rpm离心1min，倒掉废液。

（11）12000rpm，离心2min，除去吸附柱中残余漂洗液，室温放置晾干，约15min。

（12）将吸附柱置于干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl TB，放置2min，12000rpm，离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。

分别提取pGM-T-ASS4质粒和pET-28a质粒，1%琼脂糖凝胶电泳检测，存于-20℃保存备用。

2.1.2pGEM-T-ASS4和pET-28a载体的酶切

通过Primer5.0和DNAMAN序列分析软件，筛选出pGEM-T-ASS4质粒和pET-28a质粒上均具有的酶切位点，BamHI和XhoI，对质粒进行双酶切，操作如下：

将pGEM-T-ASS4质粒和pET-28a质粒分别用BamHI和XhoI双酶切，双酶切体系如表6所示：

表6

（1）酶切混合物混匀后，30℃酶切3h。酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并回收ASS4基因片段和pET-28a载体片段。

（2）取2μl回收产物用Nano-Drop2000核酸/蛋白定量仪检测产物浓度，并根据浓度设计连接体系。

2.1.3目的片段与载体连接转化

根据载体与目的片段的浓度，使其摩尔比控制在1:3-1:8，反应体系如表7所示：

表7

混匀后置16℃连接过夜。

取5μl连接产物，加到E.coli TOP10感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min。42℃水浴90s，再冰浴2min。向离心管中加入600μl 37℃不含抗生素的LB培养基，150rpm，37℃震荡培养45min。，吸取100μl菌液，加到含有Kan^r的LB固体琼脂培养基上，均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养16h。

挑取单菌落到3ml LB液体培养基，置于37℃ 200rpm摇床过夜。对菌液进行PCR检测，PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。阳性菌液送由上海英潍捷基生物技术有限公司测序，获得正确的转化子。

2.1.4重组质粒pET-28a-ASS4的提取

采用高纯度质粒小提中量试剂盒提取pET-28a-ASS4质粒，方法同上。在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。

2.2白木香倍半萜合酶的表达

2.2.1表达载体pET-28a-ASS4对大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞的转化及蛋白的表达

（1）将阳性克隆质粒pET-28a-ASS4转化到原核表达菌株Eco.liBL21(DE3)pLysS感受态细胞，通过菌落PCR鉴定并筛选阳性单菌落。

（2）取阳性菌液，接种到5ml含Cam^r、Kan^r的LB液体培养基中，于37℃ 250rpm培养基中震荡培养过夜。

（3）取10ml培养物接种到500ml相同的培养基中，在37℃250rpm培养基中震荡培养4h至OD 600为0.5-0.6，加入IPTG至终浓度0.5mM，诱导培养一定时间，4℃ 5000rpm离心10min收集菌体。

（4）将菌体重悬于预冷PBS溶液（150mM NaCl，16mMNa₂HPO₄，4mM NaH₂PO₄，pH7.3）中，超声波破碎菌体，4℃ 5000rpm离心10min，所得上清液进行SDS-PAGE分析。

2.2.2聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）检测

通过聚丙烯凝胶电泳检测蛋白的表达情况，需要配置结构均匀的凝胶。配置胶液时，APS和TEMED最后加入，保证配置过程中出现凝结现象。根据目的蛋白分子量大小选择合适的SDS-PAGE分离胶配制浓度，具体操作步骤如下：

（1）制备分离胶：装配好凝胶模具，将30% Acr-Bis（29:1）、1.5m Tris-HCl（pH8.8）、10%SDS和ddH₂O混合均匀，再加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌均匀，避免产生气泡。在模具中加入适当分离胶溶液，然后再上面覆盖1层水，以保持凝胶表明平整。静置，待出现清晰界面后，胶已聚合。

（2）制备浓缩胶：弃掉分离胶上的水层，将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、0.5m Tris-HCl（pH6.8）、10%SDS和ddH₂O混合均匀，再加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌均匀，避免产生气泡。将配制好的浓缩胶加到分离胶上直至模具顶端。小心插入梳子，避免产生气泡。静置至胶聚合。

（3）移去梳子，加入Tris-甘氨酸缓冲液，冲洗加样孔数次，将电源负极与上槽相连。取15μl破碎后的菌体上清液，加入等体积的2×SDS上样缓冲液。

（4）混匀混合液，煮沸5min，向孔中加入15μl混合液，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，提高电压到120V，继续电泳至溴酚蓝达到凝胶底部；

（5）染色：取下凝胶，加入蒸馏水加热至煮沸为止，弃去蒸馏水。加入快速染色体（主成分为靠马斯亮蓝G-250），加热至沸腾为止，弃去染色液。加入蒸馏水，加热煮沸为止，弃去蒸馏水，重复用蒸馏水煮沸脱色直至背景清晰。

2.2.3原核表达条件优化

影响E.coli中可溶性靶蛋白表达量的因素有温度、抗生素浓度、IPTG终浓度、诱导时间。降低诱导的温度可以提高可溶性靶蛋白的表达量；降低IPTG的浓度以减弱诱导强度，可以提高可溶性蛋白的表达量倍半萜合酶的表达；延长培养的时间可以提高可溶性靶蛋白的表达量。

重组表达质粒pET-28a-ASS4诱导表达产物检测图如图3所示。2.2.4ASS4蛋白的纯化

采用BIO-RAD公司的Profinia Protein Purification System纯化系统，纯化超声后蛋白上清液。纯化后得到的蛋白用SDS-PAGE分析。取5ml提取溶于PBS缓冲液中的ASS4蛋白，用0.22μm过滤膜过滤，放到进样口处，在出样口处放置干净的离心管，选择对应的程序，开始纯化。纯化后产物通过SDS-PAGE检测，检测图如图4所示。

2.3原核表达蛋白酶促反应

2.3.1ASS4蛋白的酶促反应

（1）酶促反应体系如下：总体系为200μl，含有Tris-HCl缓冲液buffer（25mM，pH7.0），10%甘油，100mM MgSO₄，5mM DTT，46μM FPP，50μl蛋白纯化产物。

（2）混匀后在30℃温育1h。

（3）用固相微萃取SPME吸附挥发物质0.5h。

（4）采用气质联用仪对催化产物进行检测。

ASS4蛋白催化FPP产物的总离子流图如图5所示，其中，1：Cyclohexane,1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-；2：β-榄香烯(β-elemene)；3：α-愈创烯(α-guaiene)；4：α-石竹烯(α-Caryophyllene)；

5：δ-愈创烯(δ-guaiene)。

2.3.2气质联用（GC-MS）分析

产物使用美国Varian 450气相与Varian 300质谱联用仪进行分析，色谱柱选用30m×0.25mm×0.25μm VF-5MS石英毛细管柱。GC-MS条件：电离方式EI，电子能量70eV，载气为氦气，流速为1mL/min，进样口温度250℃，起始温度为80℃，以5℃/min升至220℃，保持10min，再以10℃/min升至240℃，保持3min。扫描质量质范围30～500amu。

倍半萜产物：Cyclohexane,1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-的质谱图及标准品质谱图如图6所示（图6中左图为Cyclohexane,1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-的质谱图，右图为标准品质谱图）；倍半萜产物：β-榄香烯(β-elemene)的质谱图及标准品质谱图如图7所示（图7中左图为β-榄香烯(β-elemene)的质谱图，右图为标准品质谱图）；倍半萜产物：α-愈创烯(α-guaiene)的质谱图及标准品质谱图如图8所示（图8中左图为α-愈创烯(α-guaiene)的质谱图，右图为标准品质谱图）；倍半萜产物：α-石竹烯(α-Caryophyllene)的质谱图及标准品质谱图如图9所示（图9中左图为α-石竹烯(α-Caryophyllene)的质谱图，右图为标准品质谱图）；倍半萜产物：δ-愈创烯(δ-guaiene)的质谱图及标准品质谱图如图10所示（图10中左图为δ-愈创烯(δ-guaiene)的质谱图，右图为标准品质谱图）。结果表明本发明的沉香倍半萜合酶可被用于将法尼基焦磷酸催化Cyclohexane,1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-、β-榄香烯(β-elemene)、α-愈创烯(α-guaiene)、α-石竹烯(α-Caryophyllene)、δ-愈创烯(δ-guaiene)等5种倍半萜。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.沉香倍半萜合酶蛋白ASS4，其特征在于，所述蛋白为：

（1）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.权利要求1所述沉香倍半萜合酶蛋白ASS4的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pET-28a-ASS4，其构建方法包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，步骤（2）中，PCR反应体系为：

ASSF：5’-ggATCCATgTCTTCggCAAAACTAggTTCT-3’；

ASSR：5’-CTCgAgTCAgATTTCAATAgCATgACgCAAC-3’。

7.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，步骤（2）中，PCR反应程序为:95℃5min；95℃变性1min，69℃退火1min，72℃延伸2min，共16个循环，其中，每个循环退火步骤温度降1℃；95℃1min，54℃1min，72℃2min，共35个循环；72℃10min。

8.含有权利要求4-7任一项所述重组表达载体的宿主细胞。

9.一种制备沉香倍半萜合酶蛋白ASS4的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求2或3所述基因或权利要求4-7任一项所述重组表达载体转化细菌或真菌，通过发酵生产所述沉香倍半萜合酶蛋白。

10.权利要求2或3所述基因在提高植物沉香倍半萜合成中的应用，其特征在于，所述应用为将权利要求2或3所述基因或权利要求4-7任一项所述重组表达载体转化植物，使所述植物具备相应的沉香倍半萜合酶活性，进一步生产沉香倍半萜。