CN113430186A - 一种来自真菌中药的果糖激酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来自真菌中药的果糖激酶及其编码基因和应用。所述真菌中药果糖激酶其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因核苷酸序列如SEQID NO:2所示。所述真菌中药果糖激酶参与D‑果糖‑6‑磷酸出发合成虫草多糖主要前体单糖D‑果糖。本发明从原理上对真菌中药中华被毛孢多糖生物合成代谢途径进行了详细研究，包含本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节D‑果糖生物合成基因的表达，赋予宿主D‑果糖的高表达性，为扩大D‑果糖及其衍生物的产量提供了有效途径，具有重大应用前景。

Description

一种来自真菌中药的果糖激酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种来自真菌中药的果糖激 酶及其编码基因和应用。

背景技术

中医药是中华民族的瑰宝，是我国独特的卫生资源，也是世界传统医学的重 要组成部分。2015年，屠呦呦教授因在青蒿素治疗疟疾研究中的杰出贡献而荣 获“诺贝尔生理或医学奖”，中医药发挥了独特的现代医学价值，在国际上引起了 广泛关注。

茯苓、冬虫夏草(中华被毛孢)、僵蚕、香菇、木耳以及蝉花等作为我国传 统的真菌中药材，已经从中检测出多糖、萜类、核苷类、甾醇类等多种功能活性 组分，具有优质的创制新药应用前景。真菌中药因其丰富的物种资源，以及多样 的功能活性成分，俨然已成为我国创制新药的源泉之一。多糖作为真菌中药中的 一种主要活性成分，具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等生物活性。真菌中药多糖 在抗氧化、免疫调节及抗肿瘤方面具有较好的效果以及广阔的临床应用前景。

真菌中药冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)是中华被毛孢(Hirsutella sinensis)寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialusarmoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。 中华被毛孢被证实是冬虫夏草菌的唯一正确无性型菌株，其有效活性成分与野生 冬虫夏草高度相似，可以替代其入药。现代药理学已证实，真菌中药中华被毛孢 具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等 广泛的生物活性。

真菌中药中华被毛孢含有丰富的多糖，其含量为干重的3～8％左右，多糖通 常来自基质或菌丝。真菌中药多糖是一种具有生物活性的生物分子，由果糖、甘 露糖、葡萄糖等不同比例的单糖组成，具有广泛的理化性质，其免疫调节和抗肿 瘤活性已引起科学界的广泛关注。具有临床应用价值的真菌中药多糖因具有广泛 的生物学特性，已被应用于许多特殊的领域。真菌中药多糖同样具有抗癌作用， 可以增强身体的免疫系统。因此，随着对真菌中药多糖的市场需求增加，而野生 药材对多糖的供应较少，这使得真菌中药中华被毛孢越来越广泛地用于医药健康 产品中。

由于多糖及其类似物具有重要药理作用，国内外也有大量文献报道了多糖的 提取、提纯等工艺，但鲜有对多糖生物合成相关功能基因的报道。此外，对于具 有更显著生物活性的真菌中药中华被毛孢多糖，也还只停留在提取、代谢产物成 分分析和功效的研究上(例如：端木加敏.中国被毛孢胞内多糖的分离纯化与初 步结构分析[D].上海师范大学,2012；刘金花,李富奎,贾得儒,等.中国被毛孢 发酵虫草菌丝体多糖的提取、纯化及其理化性质[J].食品与发酵工业,2014, 40(003):222-226.)。而对其生物合成代谢途径中相关基因和蛋白的研究还很少。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种来自真 菌中药的果糖激酶。

本发明的第二个目的在于提供所述真菌中药果糖激酶的编码基因。

本发明的第三个目的在于提供所述真菌中药果糖激酶及其编码基因的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明基于基因组与转录组测序初步得到了真菌中药果糖激酶，进一步通过 对真菌中药中华被毛孢参与D-果糖-6-磷酸出发合成虫草多糖主要前体单糖D-果 糖的果糖激酶(fructokinase，EC:2.7.1.4)及其编码基因进行深入研究，提供了 真菌中药中华被毛孢参与D-果糖-6-磷酸出发合成虫草多糖主要前体单糖D-果糖 的果糖激酶、编码基因及其应用。

本发明首先提供一种真菌中药果糖激酶，其氨基酸序列为下A)或B)：

A.如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

B.以上A经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而获得，与 A所限定的氨基酸序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％或99％同源性的仍具有相同功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。

本发明涉及一种来自真菌中药中华被毛孢的D-果糖-6-磷酸出发合成虫草多 糖主要前体单糖D-果糖的果糖激酶，所述酶具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列 70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同源性，优 选其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示(记为fru蛋白)；该酶可催化D-果糖-6- 磷酸制备D-果糖。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO:1所示氨基 酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只 要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在70％、75％、80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上，均属于本发明保护范围之列。 具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变 体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用 亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

由D-果糖-6-磷酸生物合成D-果糖的路径如下所示：

因此本发明还提供所述真菌中药果糖激酶在生物催化D-果糖-6-磷酸制备D- 果糖中的应用。

进一步地，所述应用为将真菌中药果糖激酶、真菌中药果糖激酶体外重组蛋 白或真菌中药果糖激酶的重组菌发酵培养获得的湿菌体经细胞破碎后的破碎混 合液为催化剂，以D-果糖-6-磷酸为底物，制备D-果糖。

本发明还提供一种真菌中药果糖激酶的编码基因，其核苷酸序列为下列A) 至C)中的任意一种：

A.如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

B.与A所限定的核苷酸杂交，且编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸的核苷 酸序列；

C.与A所限定的核苷酸序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％或99％同源性，且编码由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸的核苷 酸序列。

本发明还涉及上述酶的编码基因，即果糖激酶基因，所述基因具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％ 或99％以上同源性，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示(记为fru基因)。 由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQID NO:2所示多核苷酸的变体，只要其与 该多核苷酸具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％ 以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一 个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体 或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的， 等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或 插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

所述的基因可用于构建能够生物催化D-果糖-6-磷酸制备D-果糖的基因工程 菌用于直接催化或分离纯化得到充足蛋白，以用于进一步催化D-果糖-6-磷酸制 备D-果糖，提高D-果糖或其衍生物的产量。

本发明还提供含有所述编码基因的重组表达载体。

本发明还提供含有所述重组表达载体的重组菌。

本发明还提供所述编码基因、所述重组表达载体或所述重组菌在构建能够生 物催化D-果糖-6-磷酸制备D-果糖的基因工程菌或真菌中药果糖激酶重组蛋白中 的应用。

进一步地，所述应用为构建含有所述真菌中药果糖激酶基因的重组表达载体， 将重组表达载体转化至宿主表达菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培 养液分离纯化获得含有真菌中药果糖激酶的菌体细胞或再分离纯化得到真菌中 药果糖激酶重组蛋白。

本发明的要点在于提供SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:2所 示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和 核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说 均是显而易见的。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种真菌中药中华被毛孢果糖激酶及其编码，所述真菌中药中 华被毛孢果糖激酶其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因核苷酸序列 如SEQ ID NO:2所示。所述真菌中药中华被毛孢果糖激酶参与D-果糖-6-磷酸出 发合成虫草多糖主要前体单糖D-果糖。本发明从原理上对D-果糖-6-磷酸出发合 成虫草多糖主要前体单糖D-果糖代谢途径进行了详细研究，含括了重要环节：D-果糖-6-磷酸生物合成D-果糖，包含本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA 可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节D-果糖生 物合成基因的表达，赋予宿主D-果糖的高表达性，为扩大D-果糖或其衍生物多 糖的产量提供了有效途径，具有重大应用前景。

附图说明

图1为真菌中药中华被毛孢果糖激酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图。

图2为重组表达质粒pET-28a/fru物理图谱。

图3为果糖激酶SDS-PAGE图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1真菌中药中华被毛孢总RNA的提取

利用TRIzol试剂提取真菌中药中华被毛孢的总RNA，具体步骤为：①液氮 研磨：反复加入液氮充分研磨1g新鲜菌体至粉末状，分装到预冷的1.5mL离心 管中，加入1mLTRIzol试剂混匀，冰上静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。 ②RNA分离：加入0.2mL氯仿后用力震荡混匀15s，冰上静置2～3min，12000rpm、 4℃离心15min，分层，取上层水相。③RNA沉淀：加入500μL异丙醇后在冰上 静置10min，12000rpm、4℃离心10min，弃上清。④RNA洗涤：加入1mL 75％ (v/v)乙醇，将沉淀悬起，冰上静置10min，7500rpm、4℃离心15min；重复上 面洗涤步骤。⑤溶解RNA：将离心管置于冰上敞开干燥5～10min，加适量DEPC 水溶解。

实施例2真菌中药中华被毛孢RNA样品的测序

提取样品的总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入 fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段(150～700bp)，以mRNA为模板， 用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后合成第二条cDNA链，再经过 QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接 测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建 好的测序文库用Illumina GA IIx进行测序。

实施例3真菌中药中华被毛孢RNA短读序列的组装

使用短reads组装软件SOAPdenovo(Li,Zhu et al.De novo assembly of humangenomes with massively parallel short read sequencing[J].Genome Res,2010,20:265-272.)做转录组从头组装。采用paired-end reads对Scaffold做补洞处理，最 后得到含N最少，两端不能再延长的Unigene序列。其次，将Unigene序列与蛋 白数据库Swiss-Prot、nr、COG和KEGG做blastx比对(evalue<0.00001)，取比 对结果最好的蛋白确定Unigene的序列方向。如果不同库之间的比对结果有矛盾， 则按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的优先级确定Unigene的序列方向。

实施例4真菌中药中华被毛孢Unigene的功能注释

功能注释信息给出Unigene的蛋白功能注释、Pathway注释、COG功能注释 和GeneOntology(GO)功能注释。通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据 库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(evalue<0.00001)，得到跟给定Unigene具有 最高序列相似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。根据KEGG 注释信息能进一步得到Unigene的Pathway注释。对所有Unigene做GO功能分 类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。

实施例5真菌中药中华被毛孢多糖生物合成途径的分析

根据KEGG代谢途径注释中的果糖和甘露糖代谢途径(map00051)，已注释 的酶是已检测到的真菌中药中国被毛果糖和甘露糖代谢途径相关酶类，检测到了 从D-果糖-6-磷酸出发合成虫草多糖主要前体单糖D-果糖的果糖激酶1个 Unigene。通过NCBI中的ORFFinder软件在线检测，找出了这个基因的开放阅 读框(SEQ ID NO:2)并得到了相应的蛋白质序列(SEQ ID NO:1)。

实施例6真菌中药中华被毛孢果糖激酶fru基因引物设计

运用GENE RUNNER引物设计软件根据预测得到的基因开放阅读框DNA 序列设计引物，用于克隆真菌中药中华被毛孢合成代谢虫草多糖主要前体单糖 D-果糖的果糖激酶基因(SEQ ID NO:2)，引物由苏州泓迅生物科技有限公司合 成，引物序列如下所列：

fru基因：正向引物5’ATA GAA TTC ATG GCG GAA CCA GGG 3’

反向引物5’AGG AAG CTT TCA GGA GGC TCT CCG 3’

fru基因长度为987bp。

实施例7真菌中药中华被毛孢cDNA第一链的制备

按照实施例1所提供的方法对真菌中药中华被毛孢进行总RNA的提取，得 到总RNA后按下述进行真菌中药中华被毛孢cDNA第一链的合成，用于后续各 基因克隆实验。

采用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)从TotalRNA 中反转录合成cDNA第一链，实验步骤如下：

①在Microtube管中配制下列混合液。

②变性、退火操作有利于模板RNA的变性以及反转录引物和模板的特异性 退火，可提高反转录反应效率，所以在PCR仪上进行变性、退火反应，条件设 置如下：65℃，5min。

③退火结束后离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管 底部。

④在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

⑤在PCR仪上按下列条件进行反转录反应。

42℃ 15～30min

70℃ 15min

一般情况，在真核生物mRNA 3’末端都有一个PolyA结构，A碱基的数量 在十至几百个不等，利用这一结构可以利用Oligo(dT)引物，在反转录酶的作用 下，以mRNA为模板合成cDNA第一链。本发明采用由TaKaRa独自开发的dT 区域的序列为引物，如果获得的mRNA完整性较好，那么通过逆转录过程可以 得到物种中所有酶蛋白编码基因的cDNA第一链。

实施例8真菌中药中华被毛孢合成代谢虫草多糖主要前体单糖D-果糖的果糖激酶fru基因的克隆、表达以及蛋白活力的检测

1、果糖激酶fru基因的PCR扩增

以实施例7中得到的cDNA第一链为模板，用实施例6中合成的fru基因引 物5’-ATAGAA TTC ATG GCG GAA CCA GGG-3’、5’-AGG AAG CTT TCA GGA GGC TCT CCG-3’进行PfuDNA聚合酶PCR扩增反应，反应条件设置如下：

Pfu PCR扩增反应体系：

Pfu DNA Ploymerase PCR扩增条件：

2、果糖激酶fru基因PCR产物凝胶电泳检测

具体检测方法为：①将配制好的0.9％的琼脂糖凝胶用微波炉加热使其溶解 均匀；②取15mL凝胶，待凝胶冷却至50℃左右时，加入1μL染色液Gold view， 混合均匀后倒入电泳凝胶板上，除去气泡后插入点样梳；③凝胶凝固后，小心取 出点样梳，将胶板放入电泳槽中，在电泳槽中加入TAE电泳缓冲液；④取5μL 样品然后加入6×Loading Buffer 1.5μL和ddH₂O 4μL混合后用移液枪上样，上样 量为10μL；⑤连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色； ⑥开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm；⑦当样品跑过胶板的2/3时可 终止电泳；⑧切断电源后，将凝胶取出放入凝胶成像仪中观察、拍照。

转录组测序预测果糖激酶fru基因的大小为978bp，琼脂糖凝胶电泳结果表 明已成功扩增出了果糖激酶fru基因，实际大小与预测大小一致，见图1，测序 显示序列与SEQID NO:2一致。

3、果糖激酶fru基因PCR产物的加碱基A处理以及纯化

由于Pfu DNA聚合酶PCR产物末端为平端，所以在胶回收后还需进行加碱 基A处理、纯化后才可用于T载体连接。胶回收产物加碱基A体系如下：

PCR仪中72℃加A碱基20min，最后用AxyPrep PCR清洁试剂盒纯化。

4、果糖激酶fru基因与克隆载体的连接

克隆载体pMD18-T Vector购自TaKaRa公司(TaKaRa code D101A)，将果 糖激酶fru基因与克隆载体连接构建重组质粒pMD18-T/fru连接体系和连接条件 如下：

连接体系：

连接条件：16℃，16h；灭活：65℃，15min。

5、果糖激酶fru重组质粒pMD18-T/fru的转化

将重组质粒pMD18-T/fru转入大肠杆菌E.coli JM109中构建分别携带果糖 激酶fru基因的重组菌E.coli JM109/pMD18-T/fru。具体步骤为：①将10μL反应 体系转至感受态细胞E.coli JM109中，冰浴30min；②热击：42℃，90s；③冰 浴：2-3min；④加入800μL液体LB，37℃，250rpm，1h；⑤涂布平板(含Amp 抗性)；⑥37℃培养箱培养过夜。

6、果糖激酶E.coli JM109/pMD18-T/fru阳性重组菌的筛选

菌落PCR可不必提取基因组DNA，而直接以菌体热解后暴露的DNA为模 板进行PCR扩增，该方法操作简便、快捷、可以快速鉴定菌落是否为含有目的 质粒的阳性菌落，在转化鉴定中较为常见。实验中，将接种到液体培养基中对应 的单菌落进行菌落PCR，以验证是否转入目的基因。首先，用牙签挑取单菌落 加入含50μL无菌水的1.5mL离心管中，沸水浴30min，然后离心以上清液作为 模板，进行PCR扩增，PCR程序设定为Taq酶扩增一般程序。最后采用0.9％的 琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物。

7、果糖激酶重组质粒pMD18-T/fru的测序

对菌落PCR检测出的阳性重组菌液体LB培养基培养过夜后，取4mL菌液 提取质粒，方法按AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提供的操作说明。测序由苏州 泓迅生物科技有限公司完成。经测序验证，序列SEQ ID NO:2已经重组至 pMD18-T/fru中。

8、果糖激酶重组表达质粒pET-28a/fru的构建

实验根据外源基因在大肠杆菌中表达的原则，以及表达载体pET-28a和果糖 激酶fru基因酶切位点比对情况，确定了EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点，并对重 组大肠杆菌E.coliJM109/pMD18-T/fru进行液体LB试管摇床培养、重组质粒提 取。

果糖激酶fru基因的重组质粒pMD18-T/fru及表达载体pET-28a用 EcoRⅠ/HindⅢ限制性内切酶在37℃分别酶切处理6h，酶切体系如下所示：

EcoRⅠ/HindⅢ双酶切体系：

酶切结束后65℃灭活15min，然后分别用Axygen DNA凝胶回收试剂盒进 行回收、纯化。

果糖激酶fru基因及表达载体pET-28a经双酶切、纯化后再用T4连接酶16℃ 连接过夜，构建重组表达质粒pET-28a/fru，构建得到的果糖激酶重组表达质粒 pET-28a/fru图谱见图2。连接体系组成如下：

连接体系：

9、果糖激酶重组表达质粒pET-28a/fru的转化以及阳性单克隆的筛选

分别将构建好的果糖激酶重组表达质粒pET-28a/fru热激转化至E.coli BL21 宿主菌中，然后涂布到含有卡那霉素(Kan)抗性(50mg/L)的LB琼脂平板上， 37℃培养过夜。从平板上随机挑选单菌落，以各功能基因的引物进行PCR扩增， 挑选阳性克隆。

10、果糖激酶重组菌E.coli BL21/pET-28a/fru的诱导表达

将鉴定为阳性的单克隆接种于5mL含有Kan抗性(50mg/L)的LB液体培 养基中，37℃、250r/min培养过夜。取1mL培养物，将其转接于50mL含有Kan 抗性(50mg/L)的LB液体培养基中37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600约 为0.6～0.8左右。向培养物中分别加入一定浓度(240mg/L)的IPTG诱导培养 8h。收集菌体供电泳分析以及酶活检测。

11、果糖激酶重组菌E.coli BL21/pET-28a/fru表达产物SDS-PAGE分析

以转入空载体的E.coli BL21菌及未加入诱导剂IPTG的重组菌作为对照。 鉴定为阳性的重组菌经IPTG诱导培养一定时间(8h)后，取0.5mL诱导培养物， 离心收集菌体，重悬于50μL蒸馏水中，加入50μL上样缓冲液，混匀后煮沸10min， 进行SDS-PAGE电泳分析，图3为重组菌E.coli BL21/pET-28a/fru表达的果糖激 酶fru(经测序验证其氨基酸序列为SEQID NO:1所示)的SDS-PAGE图。

12、果糖激酶重组菌E.coli BL21/pET-28a/fru的蛋白活性检测

酶液制备：称取收集的重组菌E.coli BL21/pET-28a/fru湿菌体0.5g(干重 0.1g)用磷酸盐缓冲液(50mM、pH8.0)15mL悬浮，超声破碎(功率360W、 破碎2s、间隔2s、共超声破碎6min)后用作催化用酶。

果糖激酶fru转化体系：在50mL转化瓶中加入E.coli BL21/pET-28a/fru超 声破碎菌体10mL、0.1g的D-果糖-6-磷酸，30℃、150r/min转化2～3h，转化结 束后，离心取上清备以后续检测。

经过检测和计算表明，果糖激酶重组菌E.coli BL21/pET-28a/fru所表达的果 糖激酶的最大底物转化率约为75.3％。

序列表

<110> 北京中医药大学深圳医院（龙岗）（深圳市龙岗区中医院）

<120> 一种来自真菌中药的果糖激酶及其编码基因和应用

<141> 2021-04-15

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 328

<212> PRT

<213> 中华被毛孢(Hirsutella sinensis)

<400> 1

Met Ala Glu Pro Gly Leu Thr Ser Ala Glu Thr Asp Gly Pro Asn Gly

1 5 10 15

Ser Ser Ala Ala Gly Pro His Pro Arg Gly Asp Asp Ser His Ala Gln

20 25 30

Ser Val Asp Asp Ser Arg Pro Thr Asp Phe Glu Gly Glu Leu Pro Thr

35 40 45

Thr Asn Glu Leu Pro Ser Pro Glu Thr Ile Asn Lys Ile Asp Asp Tyr

50 55 60

Ile Val Leu Asp Ala His Gly Arg Thr His Thr Phe Gln Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Gly Gly Arg His Ala Ala Arg Arg Gly Leu Phe Val Phe Val Arg His

85 90 95

Phe Phe Ser Gly Asn Cys Gln Glu Tyr Leu Arg Ser Leu Ser Glu Ser

100 105 110

Val Thr Pro Glu Ala Leu Leu Gln Leu Pro Val Ser Thr Val Val Val

115 120 125

Val Val Gly Cys Gly Asn Pro Asn Leu Ile Asp Met Tyr Val Lys Ala

130 135 140

Thr Lys Cys Pro Phe Pro Val Tyr Thr Asp Pro Asn Ala Ser Leu Tyr

145 150 155 160

Ser Glu Leu Gly Met Val Lys Thr Leu Ala Met Gly Pro Lys Pro Glu

165 170 175

Tyr Met Arg Arg Pro Met Ile Met Ser Val Val Glu Ser Ile Gly Gln

180 185 190

Gly Leu Arg Ser Val Pro Ser Gly Leu Ala Leu Lys Ser Gly Asp His

195 200 205

Arg Gln Val Gly Gly Glu Phe Leu Phe Glu Pro Val Asp Val Val Thr

210 215 220

Pro Val Val Thr Pro Leu Asp Glu Thr Pro Asp Pro Met Gly Pro Arg

225 230 235 240

Tyr Gly Gly Arg Gly Asp Asp Asp Ser Gly Pro Ile Glu Pro Lys Arg

245 250 255

Val Thr Trp Cys His Arg Met Lys Ser Thr Arg Asp His Ala Glu Ile

260 265 270

Pro Glu Val Met Gly Val Leu Gly Leu Lys Ser Gln Ala Pro Ala Ser

275 280 285

Ser Leu Arg Glu Lys Asp Lys Met Arg Trp Ala Lys Ala Glu Gln Val

290 295 300

Arg Lys Gly Ser Gly Gly Ser Leu Ala Leu Gln Met Asn Glu Leu Ser

305 310 315 320

Glu Ala Thr Ser Arg Arg Ala Ser

325

<210> 2

<211> 987

<212> DNA

<213> 中华被毛孢(Hirsutella sinensis)

<400> 2

atggcggaac cagggttgac gtcagctgag acggacgggc caaacggcag ctctgccgca 60

gggccgcatc caaggggcga cgactcgcat gcgcagtccg tcgacgattc cagaccaacc 120

gacttcgagg gcgagctgcc gacgaccaac gagctgccgt cgcccgaaac catcaacaag 180

attgacgact acattgtcct cgacgcccat ggccgcacgc acacgttcca gagcctctac 240

ggcgggcgcc acgccgcccg ccgagggctc tttgtctttg tgcgacactt tttctccggg 300

aactgccagg aatacctgcg gtcgctgtcc gaatcggtca cccccgaagc cctgctgcag 360

ctccccgtca gcaccgtcgt cgtcgtcgtc ggctgcggca acccgaacct gattgacatg 420

tacgtaaagg cgacaaagtg tccctttccc gtctacacgg acccgaacgc gtccctgtac 480

agcgagctcg gcatggtcaa gacgctggcc atgggcccca agcccgaata catgaggagg 540

cccatgataa tgagcgtcgt cgagagcatt ggccaaggcc tccgctccgt ccccagcggc 600

ttggccctca agtcaggcga ccaccggcag gtcggcggcg agttcctctt tgagcccgtc 660

gatgtcgtga cgcccgtcgt gacgcccctc gacgagacgc ccgatcccat gggcccccgc 720

tacggcggac gcggcgacga cgacagcggc cccatcgagc cgaagcgggt tacctggtgt 780

caccgcatga agtcgacgcg cgaccacgcc gagatacccg aggtcatggg cgttctgggc 840

ctgaagagcc aggccccggc ctcgtccctc cgcgaaaagg acaagatgcg ctgggccaag 900

gcggagcagg tgcgcaaggg ctcggggggc agcctggcct tgcagatgaa cgagctgagc 960

gaggcaacca gccggagagc ctcctga 987

Claims (8)

1.一种来自真菌中药的果糖激酶，其特征在于，其氨基酸序列为下A)或B)：

A.如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

B.以上A经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而获得，与A所限定的氨基酸序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的仍具有相同功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。

2.权利要求1所述真菌中药果糖激酶在生物催化D-果糖-6-磷酸制备D-果糖中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为将真菌中药果糖激酶、真菌中药果糖激酶体外重组蛋白或真菌中药果糖激酶的重组菌发酵培养获得的湿菌体经细胞破碎后的破碎混合液为催化剂，以D-果糖-6-磷酸为底物，制备D-果糖。

4.权利要求1所述真菌中药果糖激酶的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为下列A)至C)中的任意一种：

A.如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

B.与A所限定的核苷酸杂交，且编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸的核苷酸序列；

C.与A所限定的核苷酸序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性，且编码由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸的核苷酸序列。

5.含有权利要求4所述编码基因的重组表达载体。

6.含有权利要求5所述重组表达载体的重组菌。

7.权利要求2所述编码基因、权利要求5所述重组表达载体或权利要求6所述重组菌在构建能够生物催化D-果糖-6-磷酸制备D-果糖的基因工程菌或真菌中药果糖激酶重组蛋白中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用为构建含有所述真菌中药果糖激酶基因的重组表达载体，将重组表达载体转化至宿主表达菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有真菌中药果糖激酶的菌体细胞或再分离纯化得到真菌中药果糖激酶重组蛋白。

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