CN102373190A

CN102373190A - 冬虫夏草中国被毛孢合成代谢甘露醇相关酶、基因及应用

Info

Publication number: CN102373190A
Application number: CN2011102671613A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 李邦良; 吴晖; 柳志强; 许静; 袁水金; 许峰; 陈丽芳; 薛亚平; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT; Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT; Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-09-09
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2031-09-09
Also published as: CN102373190B

Abstract

本发明提供了一组来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢(Hirsutella sinensis)参与葡萄糖出发合成代谢甘露醇的相关酶、编码这些酶的基因及其应用。所述相关酶包括：(1)己糖激酶：序列为SEQ ID No.1～6的manA1～A6蛋白；(2)磷酸葡萄糖异构酶：序列为SEQ ID No.7～9的manB1～B3蛋白；(3)甘露醇-1-P脱氢酶：序列为SEQ ID No.10的manC蛋白。本发明从原理上对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢葡萄糖合成甘露醇代谢途径进行了详细研究，包含本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节甘露醇生物合成基因的表达，赋予宿主甘露醇的高表达性。

Description

冬虫夏草中国被毛孢合成代谢甘露醇相关酶、基因及应用

(一)技术领域

本发明涉及一组来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与葡萄糖出发合成代谢甘露醇的相关酶、编码这些酶的基因及其应用。

(二)背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)又称冬虫草、虫草，它是寄生在幼虫蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。

天然虫草具有严格的寄生性以及特殊的生态环境，故其产量很低，价格高昂。野生冬虫夏草由于受生长环境等因素制约，资源匮乏。由于近几年在人工栽培上进展不大，野生冬虫夏草代用品研究多集中在液体发酵上。利用液体深层发酵培养冬虫夏草菌丝体、提取物或发酵液，是解决冬虫夏草药源的一种有效途径。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效，实验表明，人工发酵培养冬虫夏草中国被毛孢得到的菌丝，经毒理、药理、植化研究，证明与天然虫草化学组成、药理作用基本一致，可代替天然虫草生产虫草制品，以弥补自然资源的短缺。

冬虫夏草中大量的甘露醇是一种非特异性免疫增强及调节剂，可激活机体的免疫活性细胞，尤其是T淋巴细胞、淋巴因子及单核-巨噬细胞系统，从而攻击癌细胞，发挥其抗肿瘤作用。Chatterjee等(Chatterjee，Srinivasan et al.Cordyceps sinensis：structure of cordycepic acid[J].J Am Pharm Assoc，1957，46：114-117.)首次将甘露醇从虫草中分离出来，误以为其结构是1，3，4，5-四羟基环己烷酸，被誉为“虫草酸”。后经Sprecher等(Sprecher，Sprinson.A reinvestigation ofthe″Cordycepic acid″[J].J Org Chem，1996，28(9)：490-494.)再次鉴定，确认“虫草酸”的真实结构为D-甘露醇。

甘露醇，又名D-甘露糖醇、己六醇、木蜜醇，分子式C₆H₁₄O₆，是山梨醇的同分异构体，二者都为六元醇。甘露醇为无色针状或斜方柱状晶体或白色结晶状粉末，无臭、味甜、有引湿性，甜度为蔗糖的57％-72％，熔点为166℃-170℃，密度为1.489kg/L，易溶于水，微溶于乙醇和甘油，几乎不溶于醚、酮和其他碳氢化合物，对稀酸、稀碱稳定，是多元醇中惟一一种不吸湿的晶体。甘露醇是一种重要的精细化工产品，广泛应用于医药、化工、食品及相关领域。

研究发现有许多微生物，如酵母、丝状真菌、乳酸菌等，可以利用碳水化合物为底物合成甘露醇而不生成山梨醇，从而避免甘露醇与山梨醇分离上的困难。通过微生物发酵途径来生产甘露醇的研究越来越多，并且已取得了一定的研究进展，但是关于甘露醇生物合成代谢的研究还很少见，特别是对冬虫夏草中国被毛孢中合成代谢甘露醇的研究还集中于发酵条件的优化。

(三)发明内容

本发明针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢甘露醇相关酶及其编码基因进行深入研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与葡萄糖出发合成代谢甘露醇的酶、编码基因及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一组来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与葡萄糖出发合成代谢甘露醇的酶，包括：

(1)己糖激酶：序列为SEQ ID No.1的manA1蛋白、序列为SEQ ID No.2的manA2蛋白、序列为SEQ ID No.3的manA3蛋白、序列为SEQ ID No.4的manA4蛋白、序列为SEQ ID No.5的manA5蛋白和序列为SEQ ID No.6 的manA6蛋白；

(2)磷酸葡萄糖异构酶：序列为SEQ ID No.7的manB1蛋白、序列为SEQ IDNo.8的manB2蛋白和序列为SEQ ID No.9的manB3蛋白；

(3)甘露醇-1-P脱氢酶：序列为SEQ ID No.10的manC蛋白。

本发明还涉及所述的酶在生物催化葡萄糖制备甘露醇中的应用。

本发明还涉及编码上述酶的基因。

具体的，所述基因包括：

(1)己糖激酶基因：序列为SEQ ID No.11的manA1基因、序列为SEQ ID No.12的manA2基因、序列为SEQ ID No.13的manA3基因、序列为SEQ IDNo.14的manA4基因、序列为SEQ ID No.15的manA5基因和序列为SEQID No.16的manA6基因；

(2)磷酸葡萄糖异构酶基因：序列为SEQ ID No.17的manB1基因、序列为SEQ IDNo.18的manB2基因和序列为SEQ IDNo.19的manB3基因；

(3)甘露醇-1-P脱氢酶基因：序列为SEQ IDNo.20的manC基因。

所述的基因可用于构建能够生物催化葡萄糖制备甘露醇的基因工程菌，以扩大甘露醇或其衍生物的产量。

本发明还涉及能够提供上述酶及基因的菌株——中国被毛孢(Hirsrtella Sinensis)L0106，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号为CCTCC No：M 2011278，保藏日期：2011年8月5日。

本发明的有益效果主要体现在：本发明从原理上对葡萄糖合成甘露醇代谢途径进行了详细研究，包含本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节甘露醇生物合成基因的表达，赋予宿主甘露醇的高表达性。

(四)附图说明

图1为糖酵解途径注释图；

图2为果糖-甘露糖代谢途径注释图；

图3为“百令”生产菌中国被毛孢参与葡萄糖出发合成甘露醇代谢途径注释图；

图4为甘露醇功能基因PCR扩增产物凝胶电泳图；

图5为克隆载体pGEM-T Easy与表达载体pET-28b物理图谱；

图6为重组克隆质粒pGEM-T Easy/man gene物理图谱；

图7为重组菌E.coli JM109/pGEM-T Easy/man gene菌落PCR产物凝胶电泳图；

图8为重组表达质粒pET-28b/man gene构建过程示意图；

图9为重组表达质粒pET-28b/man gene物理图谱；

图10为甘露醇功能蛋白SDS-PAGE图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的培养

菌株来源：先从青海采集天然冬虫夏草，并将其带回杭州进行分离筛选，得到了L0106菌株，并经菌种鉴定该菌株为中国被毛孢(Hirsrtella Sinensis)，该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号为CCTCCNo：M 2011278，保藏日期：2011年8月5日。

将该菌种接种于斜面，培养基配方(此为固化之前的液体配方，按下述比例配制好之后再制成斜面)为葡萄糖2.0％(w/v，1％表示100mL培养基中含有1g，下同)、玉米粉1.0％、土豆汁0.5％、糊精0.5％、酵母粉0.5％、麸皮1.0％、蚕蛹粉2.0％、蛋白胨1.0％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、琼脂粉1.0％，余量为水，在12～16℃培养25天；然后将菌种接种于发酵培养基，培养基配方为葡萄糖1.0％、糖蜜1.0％、蚕蛹粉0.5％、黄豆饼粉1.0％、酵母膏0.5％、硫酸镁0.01％、磷酸二氢钾0.02％，余量为水，置于摇床上，温度12～16℃培养25天，培养结束后在无菌条件下，进行固液分离，并将固体置于无菌器具，备用。

实施例2：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的提取

用TRIzol试剂提取总RNA，步骤具体为：1)液氮研磨：取1g湿菌体放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状，分装到预冷的1.5mL离心管中，加入1mLTRIzol试剂，混匀，冰上静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。2)RNA分离：加入0.2mL氯仿，用力震荡混匀15s，冰上静置2～3min，4℃、12000rpm离心15min，分层，取上层水相，约600μL。3)RNA沉淀：加入500μL异丙醇，在冰上静置10min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清。4)RNA洗涤：加入1mL 75％乙醇，将沉淀悬起，冰上静置10min，4℃、7500rpm离心15min；重复上面洗涤步骤，再洗一遍。5)溶解RNA：将离心管置于冰上敞开干燥5～10min，加适量DEPC水溶解。实施例3：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA样品测序

提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段(200-700bp)，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后合成第二条cDNA链，再经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina GAIIx进行测序。测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，即raw data或raw reads。除去原始测序reads中只含adaptor序列的reads，备以后续分析。

实施例4：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA短读序列组装

使用短reads组装软件SOAPdenovo(Li，Zhu et al.De novo assembly of human genomes with massively parallel short read sequencing[J].Genome Res，2010，20：265-272.)做转录组从头组装。SOAPdenovo首先将具有一定长度overlap的reads连成更长的不含N的Contig片段。然后我们将reads比对回Contig，通过paired-end reads确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，SOAPdenovo将这些Contig连在一起，中间未知序列用N表示，这样就得到Scaffold。进一步利用paired-end reads对Scaffold做补洞处理，最后得到含N最少，两端不能再延长的Unigene序列。最后，将Unigene序列与蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比对(evalue＜0.00001)，取比对结果最好的蛋白确定Unigene的序列方向。如果不同库之间的比对结果有矛盾，则按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的优先级确定Unigene的序列方向，跟以上四个库皆对比不上的Unigene我们用软件ESTScan(Iseli，Jongeneel et al.ESTScan：a program for detecting，evaluating，and reconstructing potential coding regions in EST sequences[J].In Proceedings of 9th InternationalConference on Intelligent Systems for Molecular Biology.AAAIPress，Menlo Park，CA，pp.1999，138-148.)预测其编码区并确定序列的方向。对于能确定序列方向的Unigene给出其从5′到3′方向的序列，对于无法确定序列方向的Unigene给出组装软件得到的序列。

实施例5：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢Unigene功能注释

功能注释信息给出Unigene的蛋白功能注释、Pathway注释、COG功能注释和Gene Ontology(GO)功能注释。首先，通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(evalue＜0.00001)，得到跟给定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。根据KEGG注释信息能进一步得到Unigene的Pathway注释。将Unigene和COG数据库进行比对，预测Unigene可能的功能并对其做功能分类统计。根据nr注释信息，使用Blast2GO软件(Conesa，Gotz et al.Blast2GO：a universal tool for annotation，visualization and analysis in functional genomics research[J].Bioinformatics，2005，21(18)：3674-3676.)得到Unigene的GO注释信息。得到每个Unigene的GO注释后，用WEGO软件(Ye，Fang et al.WEGO：a web tool for plotting GO annotations[J].Nucleic Acids Research，2006，34：293-297.)对所有Unigene做GO功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。

实施例6：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢甘露醇代谢途径分析

图1、图2分别是KEGG代谢途径注释中的糖酵解途径(map00010)和果糖-甘露糖代谢途径(map00051)，图1中已注释的酶是已检测到的“百令”生产菌中国被毛孢糖酵解途径相关酶类，从图中可以看出，我们检测到了从葡萄糖出发合成6-磷酸果糖的2种酶共9个Unigene；图2中已注释的酶是已检测到的“百令”生产菌中国被毛孢果糖-甘露糖代谢途径相关酶类，从图中可以看出，我们检测到了甘露醇-1-P脱氢酶的1个Unigene。利用该注释信息，我们得到了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与葡萄糖出发合成甘露醇代谢途径注释图(图3)，并进一步得到了参与从葡萄糖出发生物合成甘露醇的10个Unigene。通过NCBI中的ORF Finder软件在线检测，找出了这10个基因的开放阅读框(SEQ ID No.11～20)并得到了相应的蛋白质序列(SEQ IDNo.1～10)。

实施例7：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢甘露醇相关基因引物设计

运用GENE RUNNER引物设计软件根据预测得到的各基因开放阅读框DNA序列设计引物，用于克隆“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢甘露醇的相关基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下所列：

manA1基因：

正向引物5’ATGTTGGCCGCCATCAGATCTC 3’

反向引物5’TTACTCGAGGGGGAAGCTCCATG 3’

manA1基因长度为927bp；

manA2基因：

正向引物5’ATGGTGGCAAAGACGGCCC 3’

反向引物5’CTACCGGTGCCTGTTCCACC 3’

manA2基因长度为1356bp；

manA3基因：

正向引物5’ATGTTGCAGCGGATGGGCAAATG 3’

反向引物5’TTATTCAATTAGGGAGAGGGTGTCG 3’

manA3基因长度为548bp；

manA4基因：

正向引物5’ATGACCCTCGTCGAGGAGGTGC 3’

反向引物5’TTAACCGCAGGCGGAGAGGCG 3’

manA4基因长度为1137bp；

manA5基因：

正向引物5’ATGGGCAAGGGCTTTGCCC 3’

反向引物5’TCATGATGCGCGACTCGCATC 3’

manA5基因长度为1038bp；

manA6基因：

正向引物5’ATGTGTGTGTCGTCGGGTTG 3’

反向引物5’TCACCCGAGCGGTGCAAG 3’

manA6基因长度为378bp；

manB1基因：

正向引物5’ATGCTGCTGCAGATAGGCCGG 3’

反向引物5’TTACTCTTCCTCGTCGCCT 3’

manB1基因长度为452bp；

manB2基因：

正向引物5’ATGCTGGCTCCCCTTTCGACTC 3’

反向引物5’TTACGTCTCCGGGTCCGAGTTC 3’

manB2基因长度为717bp；

manB3基因：

正向引物5’ATGCTGATCCCGACCGACTTCATC 3’

反向引物5’TTAGGGGCTGCTCGTGGAGCC 3’

manB3基因长度为414bp；

manC基因：

正向引物5’ATGTTGACAGCAGCTTTCCTCGTC 3’

反向引物5’TTAGGCGTTTTCGCAGGCAATG 3’

manC基因长度为407bp；

实施例8：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢甘露醇相关基因的克隆

先按照实施例1提供的方法培养出中国被毛孢发酵菌丝体后，再按照实施例2所提供的方法对中国被毛孢进行总RNA的提取，得到总RNA后按下述实验方法进行“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢甘露醇相关基因的克隆：

1、cDNA第一链的合成

采用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)从Total RNA中反转录合成cDNA第一链。一般情况，在真核生物mRNA3’末端都有一个PolyA结构，A碱基的数量在十至几百个不等，利用这一结构可以利用Oligo(dT)引物，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板合成cDNA第一链，本发明采用由TaKaRa独自开发的dT区域的序列(PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit中提供)为引物，如果获得的mRNA完整性较好，那么通过逆转录过程可以得到物种中所有酶蛋白编码基因的cDNA第一链。

2、功能基因cDNA第二链的合成

以合成的cDNA第一链为模板，利用Pfu DNA聚合酶以及各功能基因的引物分别进行PCR反应，条件设置如下：

Pfu DNA Ploymerase PCR扩增反应体系：

Pfu DNA Ploymerase PCR扩增条件：

3、各功能基因PCR产物凝胶电泳检测

具体检测方法为：1)将配制好的0.9％的琼脂糖凝胶用微波炉加热使其溶解均匀；

2)取15mL凝胶，待凝胶冷却至50℃左右时，加入1μL染色液Gold view，混合均匀后倒入电泳凝胶板上，除去气泡后插入点样梳；3)凝胶凝固后，小心取出点样梳，将胶板放入电泳槽中(点样孔一端靠近电泳槽的负极)，在电泳槽中加入TAE电泳缓冲液；4)取5μL样品然后加入6×Loading Buffer 1.5μL和ddH₂O 4μL混合后用移液枪上样，上样量为10μL；5)连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色；6)开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm；7)当样品跑过胶板的2/3时可终止电泳；8)切断电源后，将凝胶取出放入凝胶成像仪中观察、拍照。图4为“百令”生产菌中国被毛孢合成代谢甘露醇相关基因PCR产物凝胶电泳图，分析结果见表1。

表1：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢甘露醇相关基因PCR扩增分析

4、功能基因PCR产物的纯化

由于Pfu DNA聚合酶PCR产物末端为平端，所以在胶回收后还需进行加碱基A处理、纯化后才可用于T载体连接。Pfu DNA聚合酶PCR产物加碱基A体系如下：

PCR仪中72℃加A碱基20min，最后用AxyPrep PCR清洁试剂盒纯化。

5、克隆载体连接

克隆载体pGEM-T Easy购自普洛麦格生物技术有限公司(pGEM-T Easy Vector SystrmI)，其物理图谱见图5，将甘露醇各功能基因分别与克隆载体连接构建重组质粒，其物理图谱见图6，连接体系和连接条件如下。

连接体系：

连接条件：连接：16℃，16h；灭活：65℃，15min。

6、转化

将重组质粒分别转入大肠杆菌E.coli JM109中构建10株不同功能基因的重组菌E.coli JM109/pGEM-T/man gene，具体步骤为：1)将10μL反应体系转至感受态细胞E.coli JM109中，冰浴30min；2)热击：42℃，90s；3)冰浴：2-3min；4)加入800μL液体LB，37℃，250rpm，1h；5)涂布平板(含Amp抗性)；6)37℃培养箱培养过夜。

7、阳性重组菌的筛选

菌落PCR可不必提取基因组DNA，而直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，该方法操作简便、快捷、可以快速鉴定菌落是否为含有目的质粒的阳性菌落，在转化鉴定中较为常见。实验中，将接种到液体培养基中对应的单菌落进行菌落PCR，以验证是否转入目的基因。首先，用牙签挑取单菌落加入含50μL无菌水的1.5ml离心管中，沸水浴30min，然后离心以上清作为模板，进行PCR扩增，具体的反应体系如下所示，PCR程序设定为Taq酶扩增一般程序。最后采用0.9％的琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物，由于菌落PCR采用了克隆载体的通用引物M13F/R，PCR产物除目的基因外，在其两端还有100bp左右的多酶切位点序列，所以菌落PCR产物要比目的基因大。图7为菌落PCR凝胶电泳图，结果分析见表2。

表2：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢甘露醇相关基因-克隆载体阳性重组菌

筛选结果分析

8、质粒测序

对菌落PCR检测出的阳性重组菌液体LB培养基培养过夜后，取4mL菌液提取质粒，方法按AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提供的操作说明。测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。

实施例9：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢甘露醇相关基因的表达

实验根据外源基因在大肠杆菌中表达的原则，以及表达载体和目的基因酶切位点比对情况，确定了EcoR I单酶切位点，并对上述获得的10株重组大肠杆菌E.coliJM109/pGEM-T/man gene分别进行液体LB试管摇床培养、重组质粒提取。甘露醇各功能基因及表达载体pET-28b经EcoR I单酶切后连接，构建重组表达质粒pET-28b/man gene，然后将其转化至E.coli BL21宿主菌中，在tac启动子的启动下，甘露醇功能基因在E.coli BL21中进行了表达，蛋白电泳检测10种合成代谢甘露醇相关蛋白。

1、引物的确定

用pGEM-T Easy载体的通用引物M13F/R扩增出的功能基因两端仍含pGEM-TEasy载体的多克隆酶切位点，所以本实验确定以M13F/R作为功能基因的引物，从重组克隆载体上扩增出目的基因，引物序列如下：

M13F：5′-GTTTT CCCAG TCACG AC-3′

M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′

2、甘露醇功能基因的扩增

以甘露醇各功能基因的重组质粒pGEM-T/man gene为模板，利用引物M13F/R和Taq DNA聚合酶PCR扩增甘露醇功能基因。PCR结束后胶回收目的基因，由于该目的基因两端各含有100bp左右的多酶切位点片段，所以在切胶时目的片段较目的基因大约200bp。

3、目的基因与表达载体的酶切

胶回收后的甘露醇功能基因及表达载体pET-28b用EcoR I限制性内切酶在37℃ 分别酶切处理3h，酶切体系如下所示：

EcoR I单酶切体系：

酶切结束后65℃灭活15min，然后表达载体用Axygen DNA凝胶回收试剂盒进行回收，而目的基因用Axygen PCR清洁试剂盒作进一步的纯化

4、重组表达质粒的构建与转化

表达载体pET-28b和目的基因经酶切、纯化后进行连接，构建重组表达质粒，其构建过程见图8，构建得到的各重组表达质粒图谱见图9。连接体系组成如下：

连接体系：

5、阳性单克隆的筛选

将构建好的表达质粒热激转化至E.coli BL21宿主菌中，然后涂布到含有50μg/mL卡那霉素(Kan)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。从平板上随机挑选单菌落，以各功能基因的引物为引物进行PCR，电泳检测PCR产物，以验证载体与目的基因是否连接。

6、诱导表达

将鉴定为阳性的单克隆接种于5mL含有Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜。取1mL培养物，将其转接于50mL含有Kan抗性的LB液体培养基中37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600约为0.6～0.8左右。向培养物中分别加入一定浓度的IPTG诱导培养8h。收集菌体供电泳分析。

7、表达产物SDS-PAGE分析

以转入空载体的E.coli BL21菌及未加入诱导剂IPTG的重组菌作为对照。鉴定为阳性的重组菌经IPTG诱导培养一定时间后，取0.5mL诱导培养物，离心收集菌体，重悬于50μL蒸馏水中，加入50μL上样缓冲液，混匀后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳分析，图10为甘露醇功能蛋白SDS-PAGE图。

实施例10：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢甘露醇相关蛋白在生物催化葡萄糖制备甘露醇中的应用

将实施例9中所获得的菌体各0.5g用磷酸盐缓冲液(50mM、pH8.0)15mL悬浮，经超声破碎(功率350W、破碎2s、间隔2s、共超声破碎5min)后作为催化用酶。转化体系及转化条件如下：在50mL转化瓶中加入10种超声破碎后的菌体混合液10mL、1％的底物葡萄糖，30℃下，150r/min转化，转化结束后，离心取上清备以后续检测。

采用照高效液相色谱法来测定产物甘露醇的积累量，条件设置如下：色谱柱：Agilent zorbax NH₂(4.6×250mm，5μm)；流动相∶乙腈-水(86∶14，v/v)；检测器：示差检测器；检测器温度：内部35℃，外部30℃；标准溶液的制备：取甘露醇对照品适量，精密称定，加流动相制成每1mL含0.14mg的溶液。测定法：分别精密吸取标准溶液与转化上清液各20μL，注入液相色谱仪，测定。经测定，转化体系中的甘露醇浓度为0.3％。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

杭州中美华东制药有限公司

<120> 冬虫夏草中国被毛孢合成代谢甘露醇相关酶、基因及应用

<130>

<160> 20

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 309

<212> PRT

<213> Hirsutella sinensis

<400> 1

Leu Ala Ala Ile Arg Ser Pro Gly Phe Ile Gln Pro Ser Thr Ser Arg

1 5 10 15

Asp Ala Ser Arg Asp Ala His Leu Leu Gln Gln Gly Ala Cys Arg Ser

20 25 30

Ala Arg Pro Pro Ala Arg Cys His Leu Ile Leu Glu Pro Ser His Ala

35 40 45

Thr Leu Ser Pro Pro Gln Pro Ala Ser Ser Glu Pro Val Tyr Leu His

50 55 60

Ser Leu Ser Pro Pro Gln Ser Cys Leu Asp Phe Pro Arg His Arg Val

65 70 75 80

Phe Gln Gly Ser Leu Pro Gly Ile Val Ser Phe Lys Gly His Ser Gln

85 90 95

Ala Thr Pro Arg Leu Ser Phe Thr Ser Ser Ser Pro Asn Val Met Pro

100 105 110

Ser Leu Val Ser Ala Met Thr Thr Leu Arg Lys Ala Phe Ile Ser Ala

115 120 125

Ile Leu Glu Ser Leu Leu Arg Gly Lys Ser Leu Ile Gln Ala Ile Leu

130 135 140

Thr Tyr Cys Ile Ser Pro Leu Lys Ala Gly Pro Ala Ser Phe Ala Arg

145 150 155 160

Asp Thr Pro Ala Lys Ser Leu Gln Glu Phe Leu Lys Asp Ala Glu Ala

165 170 175

Ala Leu Leu Gly Pro Val Ser Gly His Gly Leu Leu Gln Leu Ser Ala

180 185 190

Gly Leu Lys Lys Gln Phe Phe Glu Arg Leu Gln Thr Asp Thr Gln Cys

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Met Leu Pro Ser Tyr Ser His Gln Leu Pro Thr Gly Asn Glu Ser Gly

210 215 220

Arg Tyr Val Thr Val Asp Val Gly Gly Ser Thr Leu Arg Val Ala Leu

225 230 235 240

Val Glu Leu Arg Gly Gly Glu Lys Gln Gly Glu Ile Val Ser Met Arg

245 250 255

Thr Phe Arg Ile Gly Lys Leu Ala Lys Asp Leu Glu Gly Met Ala Phe

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Phe Asp Trp Met Ala Glu Arg Ile Arg Glu Thr Leu Ser Thr Gly Leu

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Ser Leu Glu Pro Gly Pro Ser Lys Ser Ile Pro Leu Ala Leu Ala Trp

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305

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<212> PRT

<213> Hirsutella sinensis

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Met Val Ala Lys Thr Ala Arg Glu Leu Phe Ala Phe Leu Ala Lys Gln

1 5 10 15

Ile Glu Leu Phe Leu Arg Glu His His Ala Glu His Phe Glu Ser His

20 25 30

Val Arg Arg Arg Asn Thr Ser Ser Thr Pro Met Gly Tyr Arg Glu Glu

35 40 45

His Ile Phe Arg Leu Gly Phe Thr Phe Ser Phe Pro Val Lys Gln Leu

50 55 60

Gly Ile Asn Lys Gly Lys Leu Ile Arg Trp Thr Lys Gly Phe Asp Ile

65 70 75 80

Pro Asp Ala Leu Gly Lys Asp Val Cys Ala Leu Leu Gln Asp Glu Ile

85 90 95

Asp Arg Leu Arg Leu Pro Val Lys Val Ala Ala Leu Val Asn Asp Thr

100 105 110

Val Gly Thr Leu Met Ala Arg Ser Tyr Thr Ser Met Gly Lys His Arg

115 120 125

Ser Ile Leu Gly Gly Ile Phe Gly Thr Gly Thr Asn Gly Ala Tyr Ile

130 135 140

Glu Lys Thr Ala Asn Ile Arg Lys Pro Ile Glu Gly Gln Tyr Asp Thr

145 150 155 160

Ser Thr Gly Glu Met Val Val Asn Thr Glu Trp Gly Ser Phe Asp Asn

165 170 175

Gln Leu Asn Val Leu Pro Ser Thr Pro Trp Asp Glu Ala Leu Asp Val

180 185 190

Gln Ser Val Asn Pro Gly Val Gln Met Phe Glu Lys Arg Val Ser Gly

195 200 205

Met Phe Leu Gly Glu Ile Val Arg Leu Ala Val Leu Asp Met Met Lys

210 215 220

Asn Asp Ala Thr Ser Leu Phe Lys Asp Leu Asn Ser Ser Phe Asn Asp

225 230 235 240

Trp Gly Thr Thr Thr Asn Ile Ser Pro Gln Ser Gly Met Phe Glu Ser

245 250 255

Gly Gly Leu Asp Ser Ala Ile Met Ser Val Ala Ala Ser Asp Asn Ser

260 265 270

Pro Glu Leu Ser Thr Leu Arg Gln Glu Leu Glu Asn Thr Leu Gln Val

275 280 285

Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asp Ala Gln Ala Phe Lys Ala Val Ala Gly

290 295 300

Ser Val Ala Arg Arg Ala Ala Arg Leu Ser Ala Val Ala Ile Gly Ala

305 310 315 320

Val Ala Leu Lys Ser Gly Lys Ile Asp Asp Pro Lys Glu Glu Ile Ile

325 330 335

Asp Ile Gly Val Asp Gly Ser Leu Val Glu His Tyr Pro Phe Phe Arg

340 345 350

Asp Met Ile Tyr Glu Ala Leu Pro Ala Ile Asp Gly Ile Gly Pro Glu

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Gly Val Lys Lys Ile Arg Ile Gly Ile Ala Lys Asp Gly Ser Gly Val

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Gly Ala Ala Leu Ile Ala Leu Val Ala Gln Arg Met Glu Lys Pro Gly

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Asp Phe Leu Ala Asp Leu Arg Lys Asp Ile Lys Arg Ser Leu Asp Ala

405 410 415

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Val Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ile Trp Trp Asn

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450

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<212> PRT

<213> Hirsutella sinensis

<400> 3

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1 5 10 15

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Gly Val Val Pro Pro Ser Leu Glu Ala Pro Tyr Ser Leu Gly Ala Asp

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<212> PRT

<213> Hirsutella sinensis

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Asp Lys Lys Lys Leu Lys Glu Ile Thr Asp His Phe Met Ser Glu Leu

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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Asp Tyr Ile Asp Ala Gly Val Leu Gln Arg Trp Thr Lys Gly Phe Asp

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Ile Ala Gly Val Glu Gly Glu Asn Ile Val Pro Met Phe Glu Ala Ala

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275 280 285

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<212> PRT

<213> Hirsutella sinensis

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275 280 285

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290 295 300

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<213> Hirsutella sinensis

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65 70 75 80

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Val Leu Lys His Met Lys Asp Phe Ser Ala Gln Val Arg Ser Gly Glu

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Gly Thr His Met Ala Glu Ala Leu Lys Asn Ser Asp Pro Glu Thr

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<211> 138

<212> PRT

<213> Hirsutella sinensis

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<210> 10

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<212> PRT

<213> Hirsutella sinensis

<400> 10

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85 90 95

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Val Leu Ala Lys Ala Ile Ala Arg Arg Pro Asp Gly Asn Pro Leu His

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130 135

<210> 11

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<212> DNA

<213> Hirsutella sinensis

<400> 11

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gctgagcccc gtcgacagcg tttcccgtat cctttcggcc atccagtcga aaaaggccat 120

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ctgcttctct ccaccacgca gttccaccag ggcgactctc aaggtcgacc caccgacatc 240

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catgcattgc gtgtctgtct gcagccgctc aaagaactgc ttcttcaagc cggcggacag 360

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ctcctggaga ctcttggccg gagtgtcgcg tgcaaaggag gcggggccgg ccttgagggg 480

gctgatgcaa taggtcaaga tggcctgtat cagagacttg ccgcggagca agctctcgag 540

gatggcggag atgaaggctt ttcgcagagt cgtcattgca gaaacgagcg acggcatgac 600

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cgggggggac agggagtgta aatagacggg ctctgaagag gcaggttggg gcggtgacaa 780

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ggcaccttgt tggagcaagt gtgcgtctcg agaagcgtca cggctagtac tgggttggat 900

gaaacctgga gatctgatgg cggccaaaag aaaagaaagg atggggcagc aacagcagta 960

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<210> 12

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<212> DNA

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atggtggcaa agacggcccg ggagctcttt gcctttttgg caaagcagat cgagctgttc 60

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ctgccctcga ctccctggga cgaggctctg gacgtgcaga gcgtgaatcc tggggttcaa 600

atgtttgaga agcgtgtgtc gggcatgttt ctcggcgaga tcgtgcggct ggcagttctg 660

gacatgatga agaacgatgc cacttcgctc ttcaaggacc tcaactcgag cttcaacgac 720

tgggggacca cgacaaacat cagcccccag tctggtatgt tcgaatctgg gggcctggac 780

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<212> DNA

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attgaaag 548

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<212> DNA

<213> Hirsutella sinensis

<400> 14

atgaccctcg tcgaggaggt gcggaggctg gagggactct tcgtcgtcga caagaagaag 60

cttaaggaaa tcaccgacca cttcatgtcg gagctggcca agggcttgag cgtcgagggc 120

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acctttctcg ccctcgacat gggaggcacc aacctgcgcg tgtgccaaat caccctgacg 240

gaccaaaagt ctgagttcga catcatccag tccaagtacc gcatgcccga ggagctcaaa 300

acgggcaaaa gcgacgagct ctgggagtat attgccgact gcctgcacca gttcatcgag 360

acgcaccacg gcgactgcaa caagatggag aagctgcccc tcgggttcac gttttcctac 420

cctgccaccc aagactacat tgacgcgggc gtgcttcaac gatggaccaa gggcttcgac 480

attgccggcg tcgagggcga aaacattgtg cccatgttcg aggctgcgct ggccaagcgt 540

ggcgtgccca tcaagctgac ggccttgatc aatgacacga cggggaccat gattgcctcg 600

gcatacacgg acaccaagat gaagattggc tgcatctttg gaaccggctg caacgccgcc 660

tacatggagg actgcggctc gattcccaag ctcgccgaca tgaaactgcc cgccgacacg 720

cccatggcca tcaactgcga gtggggtgcc tttgacaacg agcacaaggt gctgccccgg 780

accgactacg acaagattat cgatcgcgac tctccccggc cgggtcagca ggcattcgag 840

aagatgattg ctggtctgta tctgggggag attttccgac tggtcatggt ggacctttac 900

gacaaccgag acgccaaggt atttgagggc cagaacattg acctgttgcg caagccctac 960

gccttggact cgtcgtttct gtcggcgatt gaagaagacc cctttgagaa cctgcaggag 1020

acgcaagacc tgttcacaaa caagctcaac attacttgca accgcggcga gctggaactc 1080

atgcgacgac tggccgagct catcggcacc cgcgccgccc gcctctccgc ctgcggt 1137

<210> 15

<211> 1038

<212> DNA

<213> Hirsutella sinensis

<400> 15

atgggcaagg gctttgccct cccaccagac ggcgagctcg gcgcgcgcct ccagcagggc 60

tacgacgagg cgcgggtggc cgcccacctc ccccccatca gggtcgttgc cattgccaac 120

gactcggtcg cgaccctcgt gtccttcatc ttcaactaca atgatacggc gcatcgccag 180

gccgccatgg gcctgatcct cggcaccggc agcaacgcca cggtcccgct gcggtccaac 240

cgcctccatg ccagtaagcg gccgcaaaaa gtgagcgtct tgcccggcga ggtggtcgac 300

gacgacgttg tcattgccgt caacaccgag tggagcatca gggggacagc gccgccgatg 360

cgccagctgg ggctcatcac tcggtgggac gacgagctga gcgcgcaaaa cgaaaccccg 420

ggcttccagc cgctcgagta catgacggca ggccgctacc tcggggagct gggccgtatc 480

atgctgctta gctacatgac ggagacgctc ggcctgcggc aaggagcgct gccgtcggcg 540

ctgctcgaga cgcacagcct gacgacgacg ttcctcggcc acttcaagcc gccggggccg 600

gcggcggccc tcgtgtcgaa gctgaggacg gcttttccgg aacgccagga gacggggttt 660

gcttggaccg aacatctggc cgaagccctg taccgcatag ccaaggcaat cgagttgcgg 720

gcggccggca tcatatcggc cggcatcctg gccctgctga cgttggccga ggagctgccg 780

gccgagggag ggagccaagg tccggacgcc cgagagctcg gggtggggta cacgggcggg 840

tgcatcgtgc acttccagga ctacttggca gactgccaga ggctggtgga cgggctcgtg 900

gcgaagcgat atggcgagga gacgcaggtg cgcgtggcgt tgagcccttg ccacgacggg 960

gggataacgg gagccggcat actggtggct gcggctctca gtagccagga agccagagat 1020

gcgagtcgcg catcatga 1038

<210> 16

<211> 378

<212> DNA

<213> Hirsutella sinensis

<400> 16

atgtgtgtgt cgtcgggttg cgtctgcacc aatcccacag cagaccgagt tcaatatcaa 60

catttggaaa cacaaaactc caggcacggt gcgacagacc gagtgtcggt ccggcgagaa 120

cgaaaggcgc ccattaaaca ctcagtcgtc ccgctcgatg cacgccagcg cgaccgccgc 180

tcccatcagg gagctttccc tggccgggac aaggcgaatg ctcctgggtt ccgccaggcc 240

cttgctctcg accagctcgt ccacgtatcg ttggcagttg ccgaggtacc ccgtatagct 300

ttcgatgacg ctgccgttga acgcaacagt ggtgctttcc aacctcatgt cggcctcggc 360

cttgcaccgc tcgggtga 378

<210> 17

<211> 452

<212> DNA

<213> Hirsutella sinensis

<400> 17

ctgctgcaga taggccggga agcgatgaag atactggtcg aatggggcaa cgaggtgagt 60

ctgggcctgg aaaaagtccg agtaccagac gctgagcaga ccgccgagaa tgggaatgtt 120

gtccttgatg ggcgtgttgc ggaagtgttg gtccatggca tgggcgccgc tgaggagctt 180

gtgaaagttg tcgaagccga cgtagatggc gacgctgagg ccaatggcgc tccagaccga 240

gtagcggccg ccgacccagc tctcaaagcc aaacatgttc ttgctgtcga tgccaaactt 300

ggtcacctct ggctcgttgg tggagagggc gacaaagtgc ttcgcaatgt cgcccttggc 360

gcccgacttt tcgaggaacc acgtcttggc cgtgtttgcg ttggtcgtcg tctcggccgt 420

ggtgaacgtc ttggaggcga cgaggaagag cg 452

<210> 18

<211> 717

<212> DNA

<213> Hirsutella sinensis

<400> 18

ctggctcccc tttcgactcg tcaaagcaaa acagctactg accccgtctc tgctcaagtc 60

atccgatcct cctcgcttcc accgacggca acaatggctc ccgcaaacac gctgcctgcc 120

tgggcagagc ttcaagctca tcgcgacaac gtgggcaaga agtttgtcct caaggacgcc 180

tttgcctcgg acaaggaccg cttcaaccgc ttctctcgca cctttacctc ggacggcgtc 240

tcggccgata tcctcttcga ctttagcaag aacttcgtca ccgaggacac gctcaacctc 300

ctcgtcaagc ttgccgagca ggccggcgtc gagcgcaagc gcaatgccat gttttccggc 360

gacaagatca attttaccga gaaccgcgcc gtcttccaca cggccctgcg caacgtcggc 420

ggcgtcgaga tgaaggtcga cggccaggat gtcatgaact gccccggcgg cgtcaacgac 480

gtcctcaagc acatgaagga cttttcggcc caggtccgca gcggcgagtg gaagggcttc 540

accggcaaga agctcaccac aatcatcaac attggcattg gtggatccga cctcggcccc 600

gtcatggtga ccgaggccct caagcactac ggcgcccacg acatgacgct tcacttcgtc 660

tccaacattg acggcaccca catggccgag gccctcaaga actcggaccc ggagacg 717

<210> 19

<211> 414

<212> DNA

<213> Hirsutella sinensis

<400> 19

ctgatcccga ccgacttcat cctcgccgcg cagtcgcaca accccacgtc caacaacctt 60

caccagaaga tgctcgcctc caactacttt gcccaggccg aggccctcat ggtcggcaag 120

actgatgacg aggtcaaggc cgaggggacg gcgagcgatc tcgtgcccca caagcgcttc 180

ctcggcaacc ggccgacgac gtcgatcctt gtgggaggct ccattgggcc ggcggagctt 240

ggtgccttga ttgtctacta cgagcacctg acgtttaccg agggcgccat ctgggacatc 300

aacagcttcg accagtgggg cgtcgagctg ggcaaggtgc tggccaagaa gatccttaag 360

gagctcgacg agcccggcag cggcgagggc cacgacggct ccacgagcag cccc 414

<210> 20

<211> 407

<212> DNA

<213> Hirsutella sinensis

<400> 20

ttgacagcag ctttcctcgt ccttctcacc atggccaaga aggctgttca ttttggcgcc 60

ggcaacattg gccgtggctt cgtcgcctgc ttcctgcaca actcgggcta cgaagtcgtc 120

tttgccgatg tcgtcgactc tctcatcgac aggatcaacg ccacgccctc gtacaaggtc 180

atcgaggttg gcgaagaggg caccacggac cgaacaatca caaactaccg cgccatcaac 240

tccaagacgc acgaggagga cctgattgcg gagctcatcc ctgccgacgt tgccacgtgc 300

tccgtcggcc ccaacattct caagttcatt gcccccgtcc tcgcaaaggc catcgcccgc 360

cgtcctgatg gcaaccctct gcacgtcatt gcctgcgaaa acgccat 407

Claims

1.冬虫夏草中国被毛孢参与葡萄糖出发合成代谢甘露醇的酶，包括：

(1)己糖激酶：序列为SEQ ID No.1的manA1蛋白、序列为SEQ ID No.2的manA2蛋白、序列为SEQ ID No.3的manA3蛋白、序列为SEQ ID No.4的manA4蛋白、序列为SEQ ID No.5的manA5蛋白和序列为SEQ ID No.6的manA6蛋白；

(2)磷酸葡萄糖异构酶：序列为SEQ ID No.7的manB1蛋白、序列为SEQ ID No.8的manB2蛋白和序列为SEQ ID No.9的manB3蛋白；

(3)甘露醇-1-P脱氢酶：序列为SEQ ID No.10的manC蛋白。

2.如权利要求1所述的酶在生物催化葡萄糖制备甘露醇中的应用。

3.编码权利要求1所述酶的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因包括：

(1)己糖激酶基因：序列为SEQ ID No.11的manA1基因、序列为SEQ ID No.12的manA2基因、序列为SEQ ID No.13的manA3基因、序列为SEQ ID No.14的manA4基因、序列为SEQ ID No.15的manA5基因和序列为SEQ ID No.16的manA6基因；

(2)磷酸葡萄糖异构酶基因：序列为SEQ ID No.17的manB1基因、序列为SEQID No.18的manB2基因和序列为SEQ ID No.19的manB3基因；

(3)甘露醇-1-P脱氢酶基因：序列为SEQ IDNo.20的manC基因。

5.如权利要求3所述的基因在构建能够生物催化葡萄糖制备甘露醇的基因工程菌中的应用。

6.中国被毛孢(Hirsutella Sinensis)L0106，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号为CCTCC No：M 2011278，保藏日期：2011年8月5日。