CN108220311A

CN108220311A - 具有调控水稻育性的dna序列及其应用

Info

Publication number: CN108220311A
Application number: CN201710047885.4A
Authority: CN
Inventors: 谢红卫; 彭晓珏; 蔡耀辉; 钱明娟; 蔡怡聪; 朱友林; 颜龙安
Original assignee: JIANGXI SUPER-RICE RESEARCH AND DEVELOPMENT CENTER; Nanchang University
Current assignee: JIANGXI SUPER-RICE RESEARCH AND DEVELOPMENT CENTER; Nanchang University
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2018-06-29
Anticipated expiration: 2037-01-20
Also published as: CN108220311B

Abstract

本发明涉及水稻育种技术领域，具体而言，涉及一种具有调控水稻育性的DNA序列及其应用。通过将雄性不育水稻线粒体特异开放阅读框和线粒体导肽组合转化水稻品种导致产物无花粉核不育，该方法可以快速高效通过转基因的方法获得不同水稻品种的显性核不育材料，该不育材料无花粉型败育、不育稳定，不受温度环境影响。本发明将在水稻遗传育种，特别是定向创制无花粉型显性核不育材料，可在显性核不育轮回选育育种中得到广泛应用。

Description

具有调控水稻育性的DNA序列及其应用

技术领域

本发明涉及水稻育种技术领域，具体而言，涉及一种具有调控水稻育性的DNA序列及其应用。

背景技术

水稻遗传育种所用的方法技术路线非常多，比如杂交育种、诱变育种、分子标记辅助育种、转基因育种等等，而轮回选择育种作为一个非常有效的育种方法已经广泛应用于玉米育种。对于自交作物的轮回选择以小麦上实践得较为成功，水稻虽然进行了一些尝试，比如，很多育种者提出利用萍乡显性核不育或光敏核不育基因进行水稻轮回选择育种研究，用核质互作的野败不育基因进行轮回选择选育恢复系取得了一定的进展。但效果总是不太理想，分析原因发现这主要是与不育基因使用有关。水稻轮回选择育种使用的不育基因主要是显性及隐性核不育基因，隐性不育基因尝试使用比较多。而光敏核不育隐性基因由于受温、光环境条件影响限制以及后代不育株出现频率低，异交聚合优良基因效果受到限制；野败胞质不育基因由于受核质互作因素的限制及后代不育株出现频率低等原因使得轮回选择的优良基因选择效率不高。

对于水稻显性核不育基因目前已有多例报道，如江西萍乡显性核不育水稻，但在幼穗分化期遇持续高温有少量自交结实。四川农业大学的低温敏显性核不育水稻(基因TMS)为对温度敏感型的雄性不育，花粉败育是以典败和染败为主；浙江大学、中国水稻研究所分别用γ射线处理水稻品种获得了3个显性核不育材料，花粉败育以典败和染败为主，但存在败育不彻底、仍有少量自交结实、花粉囊较膨大不易区别等问题；从目前的报道来看，可供选择的水稻显性核不育材料较多，但受稳定性限制，真正实用的大概不多。因此，筛选和创制出类似于小麦太谷核不育基因、育性稳定、败育彻底且不受环境影响的水稻显性核不育材料，进行水稻轮回选择育种则可大大提高育种效率。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明公开了一种定向获得无花粉型核不育材料的转基因方法，通过将雄性不育水稻线粒体特异开放阅读框和线粒体导肽组合转化水稻品种导致产物无花粉核不育，该方法可以快速高效通过转基因的方法获得不同水稻品种的显性核不育材料，该不育材料无花粉型败育、不育稳定，不受温度环境影响。本发明将在水稻遗传育种，特别是定向创制无花粉型显性核不育材料并显性核不育轮回选育育种中得到广泛应用。

在描述本发明的化合物、组合物、蛋白质、肽等以及方法之前，应当理解，这些实施方式不限于所描述的特定方法、方案以及试剂，这是因为它们可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方式目的，并且不旨在限制本实施方式或权利要求的范围。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种DNA序列，具有调控水稻育性的功能，所述DNA序列为将水稻线粒体不育基因的序列与导肽连接得到；

所述水稻线粒体不育基因的序列选自下列组的序列之一：

a)、具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b)、具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

c)、在严格条件下能够与a)或b)所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

d)、与a)、b)或c)之任一所述序列互补的核苷酸序列。

近年来，江西省农科院以东乡野生稻为细胞质供体培育了新型东野不育系D1A，该类型不育系为孢子体不育系，无花粉败育，败育彻底，育性极易稳定，命名为D1型细胞质，分子标记鉴定该不育系不含有已克隆的孢子体不育基因WA352。申请人通过线粒体测序和比较基因组学，在该D1型不育系线粒体基因组中鉴定到一个D1型特异的开放阅读框，该开放阅读框编码182个氨基酸，其序列如SEQ ID NO：1所示，能导致产生细胞质雄性败育。

再将SEQ ID NO：1所示序列针对水稻进行密码子优化，得到SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本领域技术人员应该知晓，本发明所述的水稻线粒体不育基因还包括与核苷酸序列SEQ ID NO：1或2高度同源，并且具有同样的育性调控功能的高度同源的功能等价体序列。

所述高度同源的功能等价体序列包括在严格条件下能够与具有SEQ ID NO：1或2所示的序列的DNA杂交的DNA序列。本发明中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。

功能等价体序列还包括与SEQ ID NO：1或2所示序列有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性，且具有育性调控功能的基因序列，可以从任何植物中分离获得。其中，序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

采用转基因的方法转化线粒体基因，如果该基因没有一个导肽序列(leadingpeptide或targeting sequence)的话，就无法将转化的线粒体基因导向线粒体中，这样转化的线粒体基因就无法像线粒体基因组上表达的基因那样正常行使功能。

优选的，如上所述的DNA序列，所述导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

申请人发现，来自拟南芥的ATPγ基因前面存在一个线粒体导肽序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，再SEQ ID NO：6所示序列根据水稻进行密码子优化，得到SEQ IDNO：3所示导肽序列，将该导肽序列能将蛋白编码基因编码功能蛋白导向水稻线粒体中。

需要注意的是，本发明提供的导肽序列(SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：3所示)为最优选的导肽序列，但不排除本领域技术人员可根据本发明提供的方法采用其他导肽序列利用本发明提供的基因或DNA序列。

进一步优选的，将如SEQ ID NO：3所示导肽序列与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列进行连接，得到如SEQ ID NO：4所示的DNA序列。

如上所述的核苷酸/DNA序列编码的氨基酸序列。

将本发明提供的DNA序列转换为氨基酸序列，这对本领域技术人员来说是熟悉的。

优选的，如上所述的氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列是由SEQ ID NO：4所示的DNA序列进行表达得到的。

一种表达载体，其包含如上所述的DNA序列。

优选的，所述表达载体为PCAMBIA1301载体。

一种工程菌，其被如上所述的表达载体所转化。

优选的，所述工程菌为农杆菌。

本发明所提供的基因或DNA序列可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、农杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌，最优选的为农杆菌。

当宿主细胞是植物细胞时，含有本发明提供的基因或DNA序列的表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。另外，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。最优选的，含有本发明提供的基因或DNA序列的表达盒或载体被插入植物线粒体DNA中。

一种定向获得无花粉型核不育水稻的转基因方法，将如上所述的表达载体转化至农杆菌中，随后用所述农杆菌对水稻进行侵染转化，得到转基因水稻。

本发明提供的转基因方法亦为一种植物的生产方法，其包括：

(1)构建本发明提供的表达载体；

(2)将步骤(1)获得的表达载体直接导入植物细胞；或通过农杆菌等中间宿主细胞介导导入植物细胞；

(3)再生出转基因植物；和

(4)选择出转基因植物；并且

(5)任选地，增殖步骤(4)获得的植物以获得后代。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于农杆菌的转化技术。农杆菌可包含质粒(例如Ti或Ri质粒等常规质粒，本发明优选采用PCAMBIA1301)和本发明提供的DNA元件(即上述基因或DNA序列)，所述质粒和元件在用农杆菌转染后被转移至植物，而DNA元件被整合进植物细胞的基因组中，更具体的，被整合进线粒体基因组中。本发明的核苷酸序列尤其适用于水稻的植物细胞，但不排除在其它物种中也具有调节其育性的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为转基因片段结构图；

图2为PCAMBIA1301载体图；

图3为orf260对转基因水稻株型和育性影响；(A)转基因植株的植株表现；(B)分别为野生型和转基因抽穗期花药图；(C)分别为野生型和转基因花粉I₂-KI染色镜检图。

具体实施方式

除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。

为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明的目的是通过将雄性不育水稻线粒体特异开放阅读框和线粒体导肽组合转化水稻品种导致产物无花粉核不育，该方法可以快速高效通过转基因的方法获得不同水稻品种的显性核不育材料，该不育材料无花粉型败育、不育稳定，不受温度环境影响。本发明将在水稻遗传育种，特别是定向创制无花粉型显性核不育材料并开展显性核不育轮回选育育种中得到广泛应用。

本发明提供了该雄性不育水稻线粒体特异开放阅读框及导肽的来源、密码子优化的方法、质粒构建以及农杆菌转化等方法。

在实施例中，本发明提供了如下操作的具体内容：

一、基因序列获得及密码子优化

从拟南芥的ATPγ基因中截取78个氨基酸序列作为线粒体导肽序列，Orf182基因序列(其序列如SEQ ID NO：1所示)从D1型不育系中扩增获得，将Orf182基因序列接在ATPγ导肽序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)后面，该基因片段总计编码260个氨基酸，暂命名orf260，orf260序列由于来自线粒体基因组中，所以使用密码子软件http://www.kazusa.or.jp/codon/对基因序列进行密码子优化，优化后的序列如SEQ ID NO：4所示。

二、Orf260的转基因创制无花粉型显性核不育

采用PCR扩增和基因合成的方法构建了一个转基因载体，该载体的启动子为Pubi，依次连接优化的orf260全基因序列和终止密码子为NOS(图1)，整合的片段BamHI酶切连接到PCAMBIA1301载体的BamHI位点上(图2)，农杆菌介导法转化到红莲型水稻细胞质保持系品种粤泰B中，提取转基因材料的总DNA，同时根据orf260序列设计一对标记引物：

orf260F:ATGGCTATGGCAGTGTTCA；

orf260R:GATCTCCCCTGAGTTGACC。

退火温度为55度，扩增片段大小为720bp，通过PCR验证，共获得12株T0代阳性苗。

花粉育性检测表明有10株为完全无花粉，另外两株有少量的典败花粉，选取3株无花粉型单株与野生型粤泰B回交获得BC1F1群体，后代也分离出无花粉型单株(图3)，且符合1:1的遗传分离规律，表明该orf260为单拷贝插入，且雄性不育现象能够稳定遗传。分别提取转基因和野生型植株的幼穗总蛋白，western blot结果表明ORF260在转基因水稻中能翻译表达为功能蛋白，而野生型植株没有检测到ORF260蛋白，因此，orf260能成功导致产生无花粉型显性核不育。

三、转ORF260无花粉型核不育对光温度的影响我们将彻底无花粉败育的转ORF260无花粉型核不育冬季种在海南、夏季种在南昌，冬季海南3月5日抽穗(短日照)和夏季8月12日抽穗(长日照)开花均稳定的表现为无花粉型败育。同时，将处于幼穗分化期的ORF260无花粉型核不育材料放入光照培养箱中进行梯度稳定处理，共设置7个温度梯度，分别是22、25、28、32、34、36、38度，处理结果表明，在不同温度条件下开花的不育水稻均能稳定保持无花粉型败育。因此，转ORF260无花粉型核不育材料的败育稳定，在自然条件下，不受光温度影响，该不育材料作为一个很好的遗传材料可用于水稻轮回选择育种中去。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江西省超级水稻研究发展中心

<120> 具有调控水稻育性的DNA序列及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 549

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atgatgagat ttagttcaac ggataagaag gatagaagaa atatgctatt tgctgctatt 60

ccatctattt ggaaattcat ggacaacatt ttttttggtg gacctgggat gactatgcat 120

agcttaccac ttttcgtagt aaagaggctt gccgacactt gcgtgccagg cggcgctttc 180

ctgattgcac ttttgtgcag tctctcttcc acggcaatgg ccgctggtcc atccgactgg 240

atgcggggtg atccaaatga aacactccta cggcagaccg ataagcaaat agagaaggtc 300

aacgaggagt taaggaacgt gacatcccaa gccgtggaaa aagcgcagca gttccagttg 360

aacttgccgg gcacaagtga ggaacaaacg cacaccatcc gttctattct agaacatgat 420

cttgatggta tcgctctgaa tcaacgactt cgacgaatcc gaagatgggt caattctgga 480

gaaatcgaga atccggaaag cctattttgg cttcaaatta ttgaccaatt cagcaagtgg 540

ttcccatga 549

<210> 2

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgatgagat tctcatctac tgacaagaag gataggcgca acatgctgtt cgctgcaatc 60

ccgtctatct ggaagtttat ggacaacatt ttctttggcg gacctggcat gaccatgcac 120

tccctccccc tgttcgttgt gaagcggctc gccgatacat gcgtcccagg aggtgccttt 180

cttatcgcgc tcctgtgctc actgtcatca acagccatgg cggccggacc atctgactgg 240

atgaggggcg acccgaacga gactcttttg cgccagacgg acaagcaaat cgaaaaggtt 300

aacgaggaac tgcgcaatgt cacctcccag gctgttgaga aggcacagca attccaactt 360

aacttgccgg ggacatcgga ggaacaaacc cacacaatcc ggagtattct tgaacatgac 420

ttggatggca tcgccctcaa tcagagactg cggagaatta ggcgctgggt caactcaggg 480

gagatcgaaa atcctgagtc tctcttttgg ctgcagatca ttgatcaatt cagcaagtgg 540

tttccctga 549

<210> 3

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggctatgg cagtgttcag gagggaggga aggagactcc tgccatccat tgcagcgagg 60

ccaatcgctg caattcgcag ccctctctcc agcgaccagg aggaaggcct tttgggggtt 120

aggtccatca gcactcaagt ggtccggaac aggatgaagt cggtgaagaa tatccagaag 180

attacgaagg cgatgaagat ggtggccgcg agtaagcttc gggctgtcca ggga 234

<210> 4

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggctatgg cagtgttcag gagggaggga aggagactcc tgccatccat tgcagcgagg 60

ccaatcgctg caattcgcag ccctctctcc agcgaccagg aggaaggcct tttgggggtt 120

aggtccatca gcactcaagt ggtccggaac aggatgaagt cggtgaagaa tatccagaag 180

attacgaagg cgatgaagat ggtggccgcg agtaagcttc gggctgtcca gggaatgatg 240

agattctcat ctactgacaa gaaggatagg cgcaacatgc tgttcgctgc aatcccgtct 300

atctggaagt ttatggacaa cattttcttt ggcggacctg gcatgaccat gcactccctc 360

cccctgttcg ttgtgaagcg gctcgccgat acatgcgtcc caggaggtgc ctttcttatc 420

gcgctcctgt gctcactgtc atcaacagcc atggcggccg gaccatctga ctggatgagg 480

ggcgacccga acgagactct tttgcgccag acggacaagc aaatcgaaaa ggttaacgag 540

gaactgcgca atgtcacctc ccaggctgtt gagaaggcac agcaattcca acttaacttg 600

ccggggacat cggaggaaca aacccacaca atccggagta ttcttgaaca tgacttggat 660

ggcatcgccc tcaatcagag actgcggaga attaggcgct gggtcaactc aggggagatc 720

gaaaatcctg agtctctctt ttggctgcag atcattgatc aattcagcaa gtggtttccc 780

tga 783

<210> 5

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Ala Met Ala Val Phe Arg Arg Glu Gly Arg Arg Leu Leu Pro Ser

1 5 10 15

Ile Ala Ala Arg Pro Ile Ala Ala Ile Arg Ser Pro Leu Ser Ser Asp

20 25 30

Gln Glu Glu Gly Leu Leu Gly Val Arg Ser Ile Ser Thr Gln Val Val

35 40 45

Arg Asn Arg Met Lys Ser Val Lys Asn Ile Gln Lys Ile Thr Lys Ala

50 55 60

Met Lys Met Val Ala Ala Ser Lys Leu Arg Ala Val Gln Gly Met Met

65 70 75 80

Arg Phe Ser Ser Thr Asp Lys Lys Asp Arg Arg Asn Met Leu Phe Ala

85 90 95

Ala Ile Pro Ser Ile Trp Lys Phe Met Asp Asn Ile Phe Phe Gly Gly

100 105 110

Pro Gly Met Thr Met His Ser Leu Pro Leu Phe Val Val Lys Arg Leu

115 120 125

Ala Asp Thr Cys Val Pro Gly Gly Ala Phe Leu Ile Ala Leu Leu Cys

130 135 140

Ser Leu Ser Ser Thr Ala Met Ala Ala Gly Pro Ser Asp Trp Met Arg

145 150 155 160

Gly Asp Pro Asn Glu Thr Leu Leu Arg Gln Thr Asp Lys Gln Ile Glu

165 170 175

Lys Val Asn Glu Glu Leu Arg Asn Val Thr Ser Gln Ala Val Glu Lys

180 185 190

Ala Gln Gln Phe Gln Leu Asn Leu Pro Gly Thr Ser Glu Glu Gln Thr

195 200 205

His Thr Ile Arg Ser Ile Leu Glu His Asp Leu Asp Gly Ile Ala Leu

210 215 220

Asn Gln Arg Leu Arg Arg Ile Arg Arg Trp Val Asn Ser Gly Glu Ile

225 230 235 240

Glu Asn Pro Glu Ser Leu Phe Trp Leu Gln Ile Ile Asp Gln Phe Ser

245 250 255

Lys Trp Phe Pro

260

<210> 6

<211> 234

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

atggcaatgg ctgttttccg tcgcgaaggg aggcgtctcc tcccttcaat cgccgctcgc 60

ccaatcgctg ctatccgatc tcctctctct tctgaccagg aggaaggact tcttggagtt 120

cgatctatct caactcaagt ggtgcgtaac cgcatgaaga gtgttaagaa catccaaaag 180

atcacaaagg caatgaagat ggttgctgct tccaagctta gagcagttca aggc 234

Claims

1.一种DNA序列，具有调控水稻育性的功能，其特征在于，所述DNA序列为将水稻线粒体不育基因的序列与导肽连接得到；

所述水稻线粒体不育基因的序列选自下列组的序列之一：

a)、具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b)、具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

d)、与a)、b)或c)之任一所述序列互补的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.根据权利要求2所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列如SEQ ID NO：4所示。

4.权利要求1所述的基因或权利要求1～3任一项所述的DNA序列编码的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

6.一种表达载体，其包含权利要求1～3任一项所述的DNA序列。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为PCAMBIA1301载体。

8.一种工程菌，其被权利要求6或7所述的表达载体所转化。

9.根据权利要求8所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为农杆菌。

10.一种定向获得无花粉型核不育水稻的转基因方法，其特征在于，将权利要求7所述的表达载体转化至农杆菌中，随后用所述农杆菌对水稻进行侵染转化，得到转基因水稻。