CN111154790A - 氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1及其编码产物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1，基因全长开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。并且公开了该基因编码的蛋白。该基因不仅可应用于通过合成生物学或代谢工程技术异源合成和生产三萜皂苷，而且也为绞股蓝的分子育种提供了理论支撑。

Description

氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1及其编码产物与应用

技术领域

本发明涉及参与绞股蓝皂苷合成途径中的关键酶基因，更具体的说是涉及氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1及其编码产物与应用。

背景技术

绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino,GP)系葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，又名“五叶参”、“七叶胆”、“甘曼茶”、“小苦药”、“公罗锅底”，地上部分干燥后入药，被誉为“南方人参”。在我国，产自陕西南部和长江以南各省区，常生于海拔300-3200米的山谷密林、山坡疏林、灌丛或路旁草丛中。

绞股蓝主要药用成分为绞股蓝皂苷，有抗肿瘤、抗焦虑、抗动脉粥样硬化、调节免疫力、降血糖、降血脂等多种功效。在临床上，绞股蓝皂苷已广泛应用于治疗肿瘤、高脂血症、血液病等药物中。到目前为止，已从绞股蓝中分离200余种绞股蓝皂苷。

然而目前对于绞股蓝的研究主要集中在皂苷种类的分离和药理作用研究上，仅依靠从天然绞股蓝中提取绞股蓝皂苷无法满足临床需求量，因此，需要对绞股蓝皂苷生物合成途径进行解析，寻求新的方法以利于调节绞股蓝皂苷的生物合成。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1及其编码产物，该基因是参与绞股蓝皂苷合成的关键酶基因，对于绞股蓝的遗传育种、代谢调控及绞股蓝皂苷的生物合成具有重要价值。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1，基因全长开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有上述氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1的表达载体。

含有上述氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1的工程菌。

氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1在调节达玛烷型皂苷生物合成中的应用。

氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1在异源合成达玛烷型皂苷中的应用。

具体地，将含有GpOSC1的表达载体转入能够内源积累2,3-氧化鲨烯的宿主，诱导表达达玛烷型皂苷。

氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1在催化2,3-氧化鲨烯环化成达玛烯二醇中的应用。

氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1在绞股蓝遗传育种中的应用。

由上述技术方案可知，本发明氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1是参与绞股蓝皂苷合成途径的关键酶基因。该基因不仅可应用于通过合成生物学或代谢工程技术异源合成和生产三萜皂苷，而且也为绞股蓝的分子育种提供了理论支撑。

附图说明

图1所示为GpOSC1在根、茎、叶中的表达量分析。

图2所示为BY4742/pYES2-GpOSC1与BY4742/pYES2组叠加色谱图。

图3所示为特异性产物对应的质谱图。

图4所示为达玛烯二醇标准品色谱图。

图5所示为达玛烯二醇标准品质谱图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件进行操作。

实施例1绞股蓝中氧化鲨烯环化酶基因的克隆

1.根据已测序的绞股蓝转录组数据，通过拼接、注释、筛选等操作，获得绞股蓝皂苷合成途径中的候选氧化鲨烯环化酶基因cDNA序列。

2.设计该候选氧化鲨烯环化酶基因的引物，引物序列为：

正向引物：GTTGTATTATCCTTAG，SEQ ID NO.3；

反向引物：AAGCTTAGTGCAAGAGTA，SEQ ID NO.4；

引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

3.取生长旺盛的绞股蓝植株叶片，使用QIAGEN

Mini试剂盒提取总RNA，利用PROMEGA逆转录试剂盒进行逆转录获得cDNA，以cDNA为模板扩增GpOSC1的基因序列。

4.扩增产物琼脂糖凝胶电泳在2.3kb处出现特异性条带，对目标条带进行切胶回收，胶回收产物连接到pMD18T载体(TaKaRa)，并转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆进行测序(北京农业科学院测序中心)，选择和保存序列正确的GpOSC1基因克隆用于后续表达载体的构建。

测序获得的绞股蓝皂苷合成代谢途径氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1全长开放读码框(ORF)的长度为2283bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1；编码760个氨基酸，氨基酸序列如SEQID NO.2。

通过GpOSC1与已鉴定的OSCs进行多序列比对和系统进化树分析，可知GpOSC1有OSCs基因家族高度保守的结构域QW和DCTAE。

实施例2 GpOSC1基因真核表达及功能分析

1.GpOSC1功能初步分析

分析绞股蓝根、茎、叶中GpOSC1的表达情况，并使用200μM茉莉酸甲酯(MeJA)直接喷洒于长势旺盛的绞股蓝叶上，观察处理0，6，12，18，24h后GpOSC1的表达情况。

分别提取绞股蓝根、茎、叶RNA，参照GoScript^TM Reverse Transcription System试剂盒反转录成cDNA，使用

Premix Ex Taq^TM和Bio-RAD CFX96 real timesystem实时荧光定量PCR仪进行定量PCR扩增。

正向引物：TTGGGAAAAAGGAGGAAAGTA，SEQ ID NO.5；

反向引物：TTGCCGACAGTGAAAAGAGC，SEQ ID NO.6。

根据实时荧光定量PCR分析结果(图1)可知，GpOSC1在叶中表达量最高，是根的70多倍，是茎的40多倍。并且GpOSC1受MeJA诱导在18h基因表达量最高。因此推测GpOSC1可能参与达玛烷型皂苷的生物合成。

2.酵母表达载体的构建

酿酒酵母BY4742(市售)能内源积累2,3-氧化鲨烯，2,3-氧化鲨烯可以作为底物进行GpOSC1的功能验证。

通过对基因GpOSC1的编码序列及酶切位点进行分析，设计如下带有BamHI和XhoI酶切位点的引物，进行GpOSC1全长ORF扩增。

引物序列为：

正向引物：CGCGGATCCATGTGGAAGATAAAG，SEQ ID NO.7；

反向引物：CCGCTCGAGTCAAGTGGAAGGGAA，SEQ ID NO.8；

引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

扩增产物连接到pMD18T后进行测序验证，最后通过酶切的方法将目的基因GpOSC1连接到酵母表达载体pYES2上，获得pYES2-GpOSC1载体，测序验证正确性。

3.酵母转化

利用醋酸锂转化法将pYES2-GpOSC1载体转入酿酒酵母菌株BY4742中，并设置空载pYES2转化对照组。通过菌落PCR法挑选阳性克隆BY4742/pYES2-GpOSC1和BY4742/pYES2。

4.诱导表达

分别挑取阳性的酵母单克隆BY4742/pYES2-GpOSC1和BY4742/pYES2于10mL SD-Ura液体培养基(含20％葡萄糖+50mg/mL吐温-80+13mg/mL氯化血红素+2mg/mL麦角固醇)30℃220rpm摇菌过夜。

测定培养物的OD600，接种到50mL SD-Ura液体培养基中使培养物OD600至0.4，再培养2-4h。2500rpm集菌，去上清，用无菌水悬洗菌体两次。

用2mL SD-Ura诱导培养基(含20％半乳糖+10％棉子糖+50mg/mL吐温-80+13mg/mL氯化血红素+2mg/mL麦角固醇)悬浮菌体，再添加SD-Ura诱导培养基至50mL，30℃220rpm诱导培养48h。

5.催化产物的提取与鉴定

诱导培养48h后收集菌体，加入5ml的碱裂解液(20％KOH、50％EtOH)悬浮菌体，95℃高温裂解30min；裂解后加入等体积正己烷对催化产物进行涡旋提取。

提取的产物进行GC-MS分析，如图1-4所示，含有GpOSC1基因重组表达载体pYES2-GpOSC1的催化组与含空载pYES2对照组相比在30.68min出现特异峰，即有新物质产生，经鉴定特异性产物为达玛烯二醇(Dammarenediol II)。

上述实验证明GpOSC1基因参与绞股蓝皂苷的生物合成，可利用GpOSC1基因进行绞股蓝中达玛烷型皂苷生物合成的调节，进行实现绞股蓝的遗传育种、代谢调控。

本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院药用植物研究所

<120> 氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1及其编码产物与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2283

<212> DNA

<213> Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino

<400> 1

atgtggaaga taaagatagc agaaggaggg aataatccat atatattcag cagtaataat 60

ttcataggaa gacagatatg ggaattcgat cctgaagcag gtactcaaga agagagagac 120

caagttgaaa aggctcgctt tcatttctat caaaatcgtc gtaaagtcaa gcctgcttct 180

gatctccttt ggagaatgca gatgctgaga gagaaaaagt tcaaacaaga aatcccagca 240

gtaaagatag aggagggtga agaaataaca gtagagaagg cgagtattgc attgaagcga 300

gcagcacact tctactcggc attgcagaca agagatgggc attggccagc tgaaaatgca 360

ggtcctgctt tcttccttcc accattggta atgtgccttt actcgacagg atatctcgac 420

cagtttttca ccaaagaaca taagaaagaa atattaagat acatatattg tcatcaaaat 480

gaagatggag gttggggaat gtatattgga ggccaaagct ctatgttagg aagcatctcc 540

agttatgttt gtatgcgttt aattggtgaa ggaccggatg gtggtcttaa cgatgcttgt 600

tccagaggcc gtaaatggat tcttgatcac ggtggtgcta ctcatgtacc cgcctgggga 660

aagaccgctc ttactttgtt aggtgcttat gagtgggctg gaaacaaccc agtgcctcca 720

gagtgttggc tactcccttc atatattccg tttcacccag caaatgtttg gtgctatttt 780

cgaacggtat atctacccat gtcctactta tatggtaaaa gatttgttgg gccaatcacg 840

cctcttatac ttgaattgag acaagaaatt tacactcaac cttatgataa aatcgactgg 900

aaaaaggcac gtcaccagtg tgctaaggag gatctatatt ttccccatcc tttttaccaa 960

gatgcaatat gggatgggct atacctttgc acggaacccc ttcttactcg ttggcctctc 1020

aacaaattgg ttagagagag ggctcttaaa gtcaccatgg atcatattcg ttacgaagat 1080

gagaatagtc attatattac tatgggttgt gctgaaaagg tattgtgtat gctagcatgt 1140

tttgctgaag atccaaatgg agaagcgttc aaaaagcatt tggcaagact accagatttc 1200

atatggatag gtgaagatgg tatgaaaatg cagagttttg gaagtcaaga atgggatgct 1260

ggttttgcaa ttcaagcttt acttgctgct gatatggtcg acgaaatcgg acctacttta 1320

gcgaaaggac atgatttcat taagaattct caagtcaggg ataacccttc tggtgatttt 1380

aggaaaatgc atcgtcatat ttctaaggga gcttggactt tctcggaccg tgatcacggt 1440

tggcaagttt ctgattgtac tgctgaagct ttgaagtgtt gcctcctttt ttcattgatg 1500

ccaccagaga ttgtgggtga gaaaatggaa gctgaaaggt tatacgatgc agtcgatctc 1560

ttactttatc tacagagtga aaatggaggt ttgacagctt gggaaaaagg aggaaagtac 1620

ccttggctag aaaaactaaa tccgacagac atattcggag acgtaatgat tgagcacgag 1680

tacgtagaat gcacgtcttc agcaattcaa gcatttaaaa tgttcaagaa actataccca 1740

ggatacagaa caaaggatgt tgataatttc attacaaatg gaatttcata tattctgaaa 1800

tcacaattcc cagatggttc ttggtatggg aattggggta tttgttttac ttatggtact 1860

tggtttgctc ttgctgctct tttcactgtc ggcaaatctt ttaccaattc tttagccatt 1920

cgtaaagcta cccatttcct tcttcaaact caaaagccag atggtggttg gggtgaaagc 1980

tacctttcct gccctaatat gaaatacata cctctggaag gagatgaatc gaatttggtt 2040

cagacagctt gggcaatgat gggtctgatt cttgctgggc aggcggaaag agatcccaca 2100

cctattcacc gagccgctaa gctcatcatc aattcacaat tggaaaacgg agactttccc 2160

caacaagaaa taacaggcgt ttttatgaag aactgtatgt tacattattc aaattacaga 2220

aacatcttcc cactctgggc tctggctgaa tatcgtaaac tcgtcaaatt cccttccact 2280

tga 2283

<210> 2

<211> 760

<212> PRT

<213> Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino

<400> 2

Met Trp Lys Ile Lys Ile Ala Glu Gly Gly Asn Asn Pro Tyr Ile Phe

1 5 10 15

Ser Ser Asn Asn Phe Ile Gly Arg Gln Ile Trp Glu Phe Asp Pro Glu

20 25 30

Ala Gly Thr Gln Glu Glu Arg Asp Gln Val Glu Lys Ala Arg Phe His

35 40 45

Phe Tyr Gln Asn Arg Arg Lys Val Lys Pro Ala Ser Asp Leu Leu Trp

50 55 60

Arg Met Gln Met Leu Arg Glu Lys Lys Phe Lys Gln Glu Ile Pro Ala

65 70 75 80

Val Lys Ile Glu Glu Gly Glu Glu Ile Thr Val Glu Lys Ala Ser Ile

85 90 95

Ala Leu Lys Arg Ala Ala His Phe Tyr Ser Ala Leu Gln Thr Arg Asp

100 105 110

Gly His Trp Pro Ala Glu Asn Ala Gly Pro Ala Phe Phe Leu Pro Pro

115 120 125

Leu Val Met Cys Leu Tyr Ser Thr Gly Tyr Leu Asp Gln Phe Phe Thr

130 135 140

Lys Glu His Lys Lys Glu Ile Leu Arg Tyr Ile Tyr Cys His Gln Asn

145 150 155 160

Glu Asp Gly Gly Trp Gly Met Tyr Ile Gly Gly Gln Ser Ser Met Leu

165 170 175

Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Val Cys Met Arg Leu Ile Gly Glu Gly Pro

180 185 190

Asp Gly Gly Leu Asn Asp Ala Cys Ser Arg Gly Arg Lys Trp Ile Leu

195 200 205

Asp His Gly Gly Ala Thr His Val Pro Ala Trp Gly Lys Thr Ala Leu

210 215 220

Thr Leu Leu Gly Ala Tyr Glu Trp Ala Gly Asn Asn Pro Val Pro Pro

225 230 235 240

Glu Cys Trp Leu Leu Pro Ser Tyr Ile Pro Phe His Pro Ala Asn Val

245 250 255

Trp Cys Tyr Phe Arg Thr Val Tyr Leu Pro Met Ser Tyr Leu Tyr Gly

260 265 270

Lys Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Leu Ile Leu Glu Leu Arg Gln

275 280 285

Glu Ile Tyr Thr Gln Pro Tyr Asp Lys Ile Asp Trp Lys Lys Ala Arg

290 295 300

His Gln Cys Ala Lys Glu Asp Leu Tyr Phe Pro His Pro Phe Tyr Gln

305 310 315 320

Asp Ala Ile Trp Asp Gly Leu Tyr Leu Cys Thr Glu Pro Leu Leu Thr

325 330 335

Arg Trp Pro Leu Asn Lys Leu Val Arg Glu Arg Ala Leu Lys Val Thr

340 345 350

Met Asp His Ile Arg Tyr Glu Asp Glu Asn Ser His Tyr Ile Thr Met

355 360 365

Gly Cys Ala Glu Lys Val Leu Cys Met Leu Ala Cys Phe Ala Glu Asp

370 375 380

Pro Asn Gly Glu Ala Phe Lys Lys His Leu Ala Arg Leu Pro Asp Phe

385 390 395 400

Ile Trp Ile Gly Glu Asp Gly Met Lys Met Gln Ser Phe Gly Ser Gln

405 410 415

Glu Trp Asp Ala Gly Phe Ala Ile Gln Ala Leu Leu Ala Ala Asp Met

420 425 430

Val Asp Glu Ile Gly Pro Thr Leu Ala Lys Gly His Asp Phe Ile Lys

435 440 445

Asn Ser Gln Val Arg Asp Asn Pro Ser Gly Asp Phe Arg Lys Met His

450 455 460

Arg His Ile Ser Lys Gly Ala Trp Thr Phe Ser Asp Arg Asp His Gly

465 470 475 480

Trp Gln Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Ala Leu Lys Cys Cys Leu Leu

485 490 495

Phe Ser Leu Met Pro Pro Glu Ile Val Gly Glu Lys Met Glu Ala Glu

500 505 510

Arg Leu Tyr Asp Ala Val Asp Leu Leu Leu Tyr Leu Gln Ser Glu Asn

515 520 525

Gly Gly Leu Thr Ala Trp Glu Lys Gly Gly Lys Tyr Pro Trp Leu Glu

530 535 540

Lys Leu Asn Pro Thr Asp Ile Phe Gly Asp Val Met Ile Glu His Glu

545 550 555 560

Tyr Val Glu Cys Thr Ser Ser Ala Ile Gln Ala Phe Lys Met Phe Lys

565 570 575

Lys Leu Tyr Pro Gly Tyr Arg Thr Lys Asp Val Asp Asn Phe Ile Thr

580 585 590

Asn Gly Ile Ser Tyr Ile Leu Lys Ser Gln Phe Pro Asp Gly Ser Trp

595 600 605

Tyr Gly Asn Trp Gly Ile Cys Phe Thr Tyr Gly Thr Trp Phe Ala Leu

610 615 620

Ala Ala Leu Phe Thr Val Gly Lys Ser Phe Thr Asn Ser Leu Ala Ile

625 630 635 640

Arg Lys Ala Thr His Phe Leu Leu Gln Thr Gln Lys Pro Asp Gly Gly

645 650 655

Trp Gly Glu Ser Tyr Leu Ser Cys Pro Asn Met Lys Tyr Ile Pro Leu

660 665 670

Glu Gly Asp Glu Ser Asn Leu Val Gln Thr Ala Trp Ala Met Met Gly

675 680 685

Leu Ile Leu Ala Gly Gln Ala Glu Arg Asp Pro Thr Pro Ile His Arg

690 695 700

Ala Ala Lys Leu Ile Ile Asn Ser Gln Leu Glu Asn Gly Asp Phe Pro

705 710 715 720

Gln Gln Glu Ile Thr Gly Val Phe Met Lys Asn Cys Met Leu His Tyr

725 730 735

Ser Asn Tyr Arg Asn Ile Phe Pro Leu Trp Ala Leu Ala Glu Tyr Arg

740 745 750

Lys Leu Val Lys Phe Pro Ser Thr

755 760

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

gttgtattat ccttag 16

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

aagcttagtg caagagta 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

ttgggaaaaa ggaggaaagt a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 6

ttgccgacag tgaaaagagc 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

cgcggatcca tgtggaagat aaag 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

ccgctcgagt caagtggaag ggaa 24

Claims (8)

1.氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1，其特征在于，基因全长开放阅读框核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1编码的蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1的表达载体。

4.含有权利要求1所述氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1的工程菌。

5.权利要求1所述氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1在调节达玛烷型皂苷生物合成中的应用。

6.权利要求1所述氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1在异源合成达玛烷型皂苷中的应用。

7.权利要求1所述氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1在催化2,3-氧化鲨烯环化成达玛烯二醇中的应用。

8.权利要求1所述氧化鲨烯环化酶基因GpOSC1在绞股蓝遗传育种中的应用。

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