CN113755478A - 一种改变2,3-氧化鲨烯环化酶的活性或功能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及2,3‑氧化鲨烯环化酶的催化机制研究，具体涉及一种改变2,3‑氧化鲨烯环化酶的活性或功能的方法。所述方法包括：将2,3‑氧化鲨烯环化酶的氨基酸序列中对应SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第261位氨基酸的氨基酸替换成其它氨基酸；所述2,3‑氧化鲨烯环化酶的氨基酸序列中对应SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第257位氨基酸的氨基酸为酪氨酸或苯丙氨酸。本发明的方法有助于揭示植物2,3‑氧化鲨烯环化酶的催化机制，为产生新骨架产物提供更多可能性。

Description

一种改变2,3-氧化鲨烯环化酶的活性或功能的方法
技术领域
本发明涉及2,3-氧化鲨烯环化酶的催化机制研究，具体涉及一种改变2,3-氧化鲨烯环化酶的活性或功能的方法。
背景技术
三萜类化合物是天然产物中种类最多的一类，迄今为止，已经发现超过20,000种，主要分布在植物中，其中双子叶植物三萜化合物的分布较为丰富，动物和微生物中也有分布，如在海洋动物海参和海星中发现了三萜类化合物的存在，在真菌灵芝中发现150余种灵芝三萜，细菌中可以催化鲨烯(squalene)合成三萜何帕烯(hopene)。
2,3-氧化鲨烯环化酶(2,3-Oxidosqualene cyclase，OSC)是三萜类化合物合成途径中的关键酶，其催化的酶反应因反应的复杂性和产物的多样性被认为是最复杂的酶反应之一，催化的基本过程：(1)底物的结合和预折叠；(2)底物环氧基团质子化起始环化反应；(3)碳阳离子中间体的环化和重排；(4)去质子化或捕获一个水分子终止反应。底物的预折叠在反应过程中极为关键，它的构象决定了环化产物的合成途径，这对OSC产物多样性及特异性是十分重要的。碳阳离子中间体的环化和重排涉及到环的形成与扩张、质子的转移和甲基的重排，这些也是OSC产物多样性的重要原因。然而OSC是如何精准控制反应的起止，如何维持产物的中间稳态，如何精准控制主产物与副产物的比例等有关催化机制的问题亟待研究。
蛋白晶体结构的解析极大地推动了酶催化机制的进一步研究。由于OSC属于膜蛋白且分子结构较大，很难获得晶体结构，目前，只有嗜酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)的鲨烯环化酶(Squalene-hopenecyclase，AaSHC)和人类(Homo sapiens)的羊毛甾醇合酶(HsLAS)的晶体结构得到解析。HsLAS由两个α-α螺旋桶状结构域组成，两个结构域通过loop环和三个较小的β-折叠结构相连，活性中心位于这两个结构域之间。桶状螺旋外围有5个结构基本相同的QW基序，这些基序是保守的，能通过氢键作用维持蛋白结构的稳定(Kajikawa M et al.,2005)。人类羊毛甾醇合酶(HsLAS)晶体结构的解析，推动了OSC催化机制的研究，实现了从分子水平到原子水平的跨越。到现在为止，仍没有植物OSC晶体解析的相关报道。
定点突变是蛋白改造的重要技术，也是通过改变酶结构研究催化机制的重要方法，广泛应用于对OSC催化机制的研究，定点关注某一个或几个氨基酸对催化反应的影响。在对燕麦的β-香树素合酶(AsbAS1)的研究中，Salmon等证明S728F突变后，Phe259、Phe725和C20阳离子间的“三明治”式作用被破坏，导致环化反应提前终止，生成了四环三萜。Banta等利用定点突变实验，在细菌的羊毛甾醇合酶中鉴定了四个氨基酸位点Trp230，His232，Tyr503和Asn697(HsLAS中的编号)，这些位点可能导致产物从四环三萜类甾醇变为五环产物，但仍旧保持C-B-C式构象。
三萜类化合物具有重要的生物学活性和药用价值，早已广泛应用于食品、工业和医药等各个领域。因此，寻找影响OSC活性或功能的氨基酸位点，改变OSC的活性或功能，将有助于揭示植物OSC的催化机制，为产生新骨架产物提供更多可能性。
发明内容
为了推动OSC催化机制的研究，本发明提供一种改变2,3-氧化鲨烯环化酶的活性或功能的方法。本发明请求保护的技术方案如下：
一种改变2,3-氧化鲨烯环化酶的活性或功能的方法，其特征在于，所述方法包括：将2,3-氧化鲨烯环化酶的氨基酸序列中与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第261位氨基酸相对应的氨基酸替换成其它氨基酸；所述2,3-氧化鲨烯环化酶的氨基酸序列中与SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的第257位氨基酸相对应的氨基酸为酪氨酸或苯丙氨酸。
所述改变2,3-氧化鲨烯环化酶的活性或功能是指提高或降低所述2,3-氧化鲨烯环化酶的催化活性，或者改变所述2,3-氧化鲨烯环化酶的催化产物。
在本发明的一些实施例中，所述其它氨基酸选自丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸和色氨酸组成的组。
在本发明的一些实施例中，所述2,3-氧化鲨烯环化酶来自植物。
在本发明的一些实施例中，所述2,3-氧化鲨烯环化酶为来自水稻(Oryza sativa)的帕克醇合酶OsPS，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；或来自水稻(Oryza sativa)的籼稻醇合酶OsOS，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或来自燕麦(Avena strigosa)的β-香树素合酶AsbAS1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的β-香树素合酶AtLUP4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；或来自绿玉树(Euphorbiatirucalli)的β-香树素合酶EtAS，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；或来自人参(Panaxginseng)的β-香树素合酶PgPNY1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或来自油橄榄(Oleaeuropaea)的α-香树素合酶OeOEA，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；或来自百脉根(Lotusjaponicus)的羽扇豆醇合酶LjOSC3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；或来自油橄榄(Olea europaea)的羽扇豆醇合酶OeOEW，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在本发明的一些实施例中，所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OsPS，所述方法包括：将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第261位的缬氨酸替换成丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸；或所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OsOS，所述方法包括：将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第261位的缬氨酸替换成苯丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸或酪氨酸；或所述2,3-氧化鲨烯环化酶为AsbAS1，所述方法包括：将SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第263位的异亮氨酸替换成甲硫氨酸、色氨酸或酪氨酸；或所述2,3-氧化鲨烯环化酶为AtLUP4，所述方法包括：将SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的第264位的缬氨酸替换成苯丙氨酸或色氨酸；或所述2,3-氧化鲨烯环化酶为EtAS，所述方法包括：将SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的第263位的缬氨酸替换成苯丙氨酸或色氨酸；或所述2,3-氧化鲨烯环化酶为PgPNY1，所述方法包括：将SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的第265位的缬氨酸替换成苯丙氨酸或色氨酸；或所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OeOEA，所述方法包括：将SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的第264位的苏氨酸替换成色氨酸；或所述2,3-氧化鲨烯环化酶为LjOSC3，所述方法包括：将SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的第261位的缬氨酸替换成苯丙氨酸或色氨酸；或所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OeOEW，所述方法包括：将SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的第262位的缬氨酸替换成苯丙氨酸或色氨酸。
在本发明的一些实施例中，所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OsPS，所述方法包括：将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第261位的缬氨酸替换成丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸；同时将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第732位的亮氨酸替换为丙氨酸。
在本发明的一些实施例中，所述2,3-氧化鲨烯环化酶的氨基酸替换包括如下步骤：以野生型2,3-氧化鲨烯环化酶的编码基因为模板，采用包含突变位点的引物进行PCR，获得包含突变位点的基因，构建基因表达载体，转化蛋白表达宿主，获得2,3-氧化鲨烯环化酶突变体。
在本发明的一些实施例中，所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OsPS，采用SEQ ID NO:19和20所示的引物、SEQ ID NO:21和22所示的引物、SEQ ID NO:23和24所示的引物、SEQ IDNO:25和26所示的引物、SEQ ID NO:27和28所示的引物、SEQ ID NO:29和30所示的引物、SEQID NO:31和32所示的引物或SEQ ID NO:33和34所示的引物进行PCR；或所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OsOS，采用SEQ ID NO:39和40所示的引物、SEQ ID NO:41和42所示的引物、SEQ IDNO:43和44所示的引物、SEQ ID NO:45和46所示的引物、SEQ ID NO:47和48所示的引物、SEQID NO:49和50所示的引物、SEQ ID NO:51和52所示的引物进行PCR；或所述2,3-氧化鲨烯环化酶为AsbAS1，采用SEQ ID NO:53和54所示的引物、SEQ ID NO:55和56所示的引物、SEQ IDNO:57和58所示的引物进行PCR。
在本发明的一些实施例中，所述PCR的反应体系为：5×Phusion HF buffer 4μl，2mM dNTP mixture 2μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，DMSO 0.5μl，模板1μl，Phusion DNA聚合酶1μl，ddH2O 9.5μl；所述PCR的反应条件为：98℃30s；98℃10s，60℃30s，72℃6min，20个循环；72℃30min。
为进一步揭示植物OSC的催化机制，本发明对106个功能已鉴定的植物OSC(表1)的氨基酸序列进行了序列分析，找到50余个呈现高保守性的氨基酸位点。水稻的帕克醇合酶OsPS(GenBank登录号为AK066327，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的Tyr257是关键氨基酸，也是较为保守的氨基酸，在植物OSC中，该位点是组氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸。对这106个植物OSC进行同源建模，将OSC氨基酸序列中对应OsPS Tyr257的氨基酸作为目标氨基酸进行分析，结果发现，羊毛甾醇合酶、环阿屯醇合酶和葫芦二烯醇合酶中的目标氨基酸为组氨酸，组氨酸的空间位置与人羊毛甾醇合酶(HsLAS)的一致。OsPS的Tyr257与HsLAS中相应的氨基酸不同但空间位置一致。其它OSC中的目标氨基酸无论是酪氨酸还是苯丙氨酸，在空间位置上是一致的，但明显不同于在HsLAS和OsPS中该位点的空间位置。
于是，我们选取了15个OSC(表2)，在蛋白结构中搜寻了目标氨基酸的
Figure BDA0002520045740000031
范围内的氨基酸，采用计算机模拟的方法分别模拟了这些氨基酸突变后的蛋白三维结构，比对目标氨基酸的空间位置，对上千个突变模型进行筛选。结果表明，在目标氨基酸为组氨酸的OSC中，目标氨基酸的空间位置不容易受到影响；在目标氨基酸为非组氨酸的OSC中，与OsPSVal261相对应的氨基酸的突变比较容易影响到目标氨基酸的空间位置，特别是突变为苯丙氨酸和色氨酸。
然后我们用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对OSC及其单位点突变在本氏烟草中瞬时表达的产物进行了分析，结果表明，AsbAS1I263W(AsbAS1中对应OsPS Val261的氨基酸由I替换成W)催化产生β-香树素的量显著降低，AsbAS1I263F(AsbAS1中对应OsPS Val261的氨基酸由I替换成F)催化产生β-香树素的量稍有降低，还产生了羽扇豆醇。OsOSV261F/K/M/W/Y(OsOS中对应OsPS Val261的氨基酸由V替换成F/K/M/W/Y)降低了酶催化生成籼稻醇的量。OsPSV261A/R(OsPS的第261位氨基酸由V替换成A/R)不能产生任何三萜产物，OsPSV261F/G/H/Y(OsPS的第261位氨基酸由V替换成F/G/H/Y)催化生成帕克醇的量减少。OSC中对应OsPSVal261的氨基酸对OSC而言虽然不是直接作用于底物的氨基酸残基，但该氨基酸位点的突变使酶的催化效率得到了不同程度的改变，推测其可能是影响了OSC中对应OsPS Tyr257的氨基酸的空间位置。此外，我们通过GC-MS对OsPS的双位点突变在本氏烟草中瞬时表达的产物进行分析，OsPSV261F+I732A产生了新的化合物籼稻醇，OsPS的V261A/I732A恢复了由V261A引起的产生帕克醇活性丢失，但未能产生任何新三萜产物。
综上，当2,3-氧化鲨烯环化酶的氨基酸序列中对应SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第257位氨基酸的氨基酸为酪氨酸或苯丙氨酸时，将2,3-氧化鲨烯环化酶的氨基酸序列中对应SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第261位氨基酸的氨基酸替换成其它氨基酸，能够改变2,3-氧化鲨烯环化酶的活性或功能。本发明的方法有助于揭示植物2,3-氧化鲨烯环化酶的催化机制，为产生新骨架产物提供更多可能性。
附图说明
不同OSC的氨基酸序列中对应水稻帕克醇合酶OsPS Tyr257位点的氨基酸的种类或编号会有所不同，详见表1和表2。为便于理解，这里统一表述为Tyr257，图1-6中也将该位点统一标示为Y257。
图1.植物OSC中Tyr257的空间位置；A为OsPS蛋白三维结构中Tyr257的空间位置，B为Tyr257位点为酪氨酸或苯丙氨酸的OSC(除OsPS)蛋白三维结构中Tyr257的空间位置；底物用紫色标注，模板的氨基酸残基用绿色标注，OsPS的Tyr257残基用蓝色标注，酪氨酸残基用黄色标注，苯丙氨酸用红色标注。
图2.定点突变前后的OsPS蛋白三维模型中Tyr257的空间位置；绿色结构为定点突变前的OSC氨基酸残基，其余颜色的结构为定点突变的OSC的氨基酸残基。
图3.定点突变前后的OsOS蛋白三维模型中Tyr257的空间位置；绿色结构为定点突变前的OSC氨基酸残基，其余颜色的结构为定点突变的OSC的氨基酸残基。
图4.定点突变前后的OeOEA蛋白三维模型中Tyr257的空间位置；绿色结构为定点突变前的OSC氨基酸残基，其余颜色的结构为定点突变的OSC的氨基酸残基。
图5.定点突变前后的β-香树素合酶蛋白三维模型中Tyr257的空间位置；(a-b)为AtLUP4及其突变，(c-d)为EtAS及其突变，(e-f)为PgPNY1及其突变，(g-j)为AsbAS1及其突变；绿色结构为定点突变前的OSC氨基酸残基，其余颜色的结构为定点突变的OSC的氨基酸残基。
图6.定点突变前后的羽扇豆醇合酶蛋白三维模型中Tyr257的空间位置；(a-b)为LjOSC3及其突变，(c-d)为OeOEW及其突变；绿色结构为定点突变前的OSC氨基酸残基，其余颜色的结构为定点突变的OSC的氨基酸残基。
图7.定点突变引物设计示意图；三角形表示引物序列中突变的位置。
图8.AsbAS1及其单位点突变的烟草表达产物的气相色谱图；Control为tHMGR对照；IS为内标粪醇；TIC，总离子流检测；EIC 203/218表示提取m/z＝203/218的特征离子峰的色谱图。
图9.羽扇豆醇与Product 1的质谱图。
图10.AsbAS1及其突变体的催化能力的比较；相对产率是通过GC-MS对产物β-香树素的峰面积进行积分(以粪醇为内标)来确定的，用平均值±标准差表示，每组3个生物学重复。
图11.OsOS及其单位点突变的烟草表达产物的气相色谱图；Control为tHMGR对照；IS为内标粪醇；TIC，总离子流检测；EIC 206/393表示提取m/z＝206/393的特征离子峰的色谱图。
图12.OsOS及其突变体的催化能力的比较；相对产率是通过GC-MS对产物籼稻醇的峰面积进行积分(以粪醇为内标)来确定的，用平均值±标准差表示，每组3个生物学重复。
图13.OsPS及其单位点突变的烟草表达产物的气相色谱图；Control为tHMGR对照；IS为内标粪醇；TIC，总离子流检测；EIC 295/385表示提取m/z＝295/385的特征离子峰的色谱图。
图14.OsPS及其突变体的催化能力的比较；相对产率是通过GC-MS对产物帕克醇的峰面积进行积分(以粪醇为内标)来确定的，用平均值±标准差表示，每组3个生物学重复。
图15.OsPS及其双位点突变的烟草表达产物的气相色谱图；Control为tHMGR对照；IS为内标粪醇；TIC，总离子流检测；EIC 295/385表示提取m/z＝295/385的特征离子峰的色谱图。
图16.OsPS及其双位点突变体的催化能力的比较；相对产率是通过GC-MS对产物帕克醇的峰面积进行积分(以粪醇为内标)来确定的，用平均值±标准差表示，每组3个生物学重复。
图17.OsPSV261F+I732A的酶功能分析；(a)OsPSV261F+I732A的催化能力。相对产率通过GC-MS对产物帕克醇的峰面积进行积分(以粪醇为内标)来确定，用平均值±标准差表示，每组3个生物学重复。(b)在OsPSV261F与OsPSV261F+I732A蛋白三维模型中Tyr257的空间位置，左图为OsPSV261F蛋白模型，右图为OsPSV261F+I732A蛋白模型；绿色结构为定点突变前的OSC氨基酸残基，其余颜色的结构为定点突变的OSC的氨基酸残基。(c)OsPSV261F+I732A的烟草表达产物的气相色谱图。Control为tHMGR对照；IS为内标粪醇；TIC，总离子流检测。
图18.籼稻醇(orysatinol)的TMS衍生物的质谱图。
图19.OsPSV261A+I732A的酶功能分析；(a)OsPSV261A+I732A的催化能力。相对产率通过GC-MS对产物帕克醇的峰面积进行积分(以粪醇为内标)来确定，用平均值±标准差表示，每组3个生物学重复。(b)在OsPSV261A与OsPSV261A+I732A蛋白三维模型中Tyr257的空间位置。左图为OsPSV261A蛋白模型，右图为OsPSV261A+I732A蛋白模型；绿色结构为定点突变前的OSC氨基酸残基，其余颜色的结构为定点突变的OSC的氨基酸残基。(c)OsPSV261A+I732A的烟草表达产物的气相色谱图。Control为tHMGR对照；IS为内标粪醇；TIC，总离子流检测。
图20.Product 3的TMS衍生物的质谱图。
图21.Product 4的TMS衍生物的质谱图。
图22.OsPSI258A+I732A的酶功能分析；(a)OsPSI258A+I732A的催化能力。相对产率通过GC-MS对产物帕克醇的峰面积进行积分(以粪醇为内标)来确定的，用平均值±标准差表示，每组3个生物学重复。(b)在OsPSI258A与OsPSI258A+I732A蛋白三维模型中Tyr257的空间位置。左图为OsPSI258A蛋白模型，右图为OsPSI258A+I732A蛋白模型。绿色结构为定点突变前的OSC氨基酸残基，其余颜色的结构为定点突变的OSC的氨基酸残基。(c)OsPSI258A+I732A的烟草表达产物的气相色谱图。Control为tHMGR对照；IS为内标粪醇；TIC，总离子流检测。
图23.Product 5的TMS衍生物的质谱图。
图24.Product 7的TMS衍生物的质谱图。
图25.Product 8的TMS衍生物的质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
植物材料：实验室培养的4-6周龄的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，本氏烟草种子由中国科学院植物研究所漆小泉课题组馈赠。记载了本氏烟草(Nicotianabenthamiana)的非专利文献是Ting H,et al.SNARE-RNAi results in higher terpeneemission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotianabenthamiana.Molecular Plant.2015；8:454–466。
菌株：大肠杆菌TreliefTM5α感受态细胞购自北京擎科生物科技有限公司。根癌农杆菌GV3101感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。含有tHMGR(HMGR催化亚基，3-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，GeneBank ID：KY284573)基因的农杆菌(GV3101)为本实验室保存的菌株；其中，tHMGR基因位于pEAQ-HT DEST表达载体上，含有重组表达载体(pEAQ-HTDEST-tHMGR)的GV3101菌株的构建方法参见非专利文献Metabolic Engineering 42(2017)185–193。
上述生物材料本实验室亦有保存，申请人声明，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验。
载体：中间载体pDONR207购自Invitrogen公司；瞬时表达载体pEAQ-HT DEST 1、pPICZA表达载体购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心；含有OsPS基因/OsOS基因/AsbAS1基因的酵母pPICZA表达载体，载体构建方法参见非专利文献NewPhytologist(2012)193:1022–1038；上述载体本实验室亦有保存。
引物合成委托北京擎科生物科技有限公司和苏州金唯智生物科技有限公司完成。
DNA测序委托睿博生物技术有限公司和北京擎科生物科技有限公司完成。
主要分子试剂：
Figure BDA0002520045740000061
仪器与设备：
Figure BDA0002520045740000071
若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
实施例1.影响植物OSC的关键氨基酸的分析
通过查阅文献，获得已知功能的2,3-氧化鲨烯环化酶(OSC)的GenBank登录号，从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载得到106条OSC的氨基酸序列(如表1所示)。我们使用BioEdit软件对这106条OSC的氨基酸序列进行了比对分析，发现50余个氨基酸位点呈现出很高的保守性。其中，水稻(Oryza sativa)的帕克醇合酶OsPS(GenBank登录号为AK066327，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的Tyr257是较为保守的氨基酸位点，在羊毛甾醇合酶、环阿屯醇合酶和葫芦二烯醇合酶(表1中编号为1-28的OSC)中对应的位点是组氨酸，而在其他OSC如β-香树素合酶、羽扇豆醇合酶和籼稻醇合酶(表1中编号为29-40，42-99，101-106的OSC)中对应的位点是酪氨酸，但也有特例，如在燕麦(Avena strigosa)的β-香树素合酶AsbAS1(表1中编号为41的OSC)和水稻的多产物合酶OsOSC8(表1中编号为100的OSC)中对应的位点是苯丙氨酸。
表1. 106个植物OSC
Figure BDA0002520045740000072
Figure BDA0002520045740000081
Figure BDA0002520045740000091
Figure BDA0002520045740000101
注：QMQE(Global Model Quality Estimation)是一种基于目标模板对准结合性质的质量估计，数值在0-1之间，越接近于1表示模型越接近实验结果。
将OSC的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL在线网站(https://swissmodel.expasy.org)上，以人类羊毛甾醇合酶HsLAS(GenBank登录号为AAC50184，PDB(http://www.rcsb.org/)编号为1W6K)为模板对106个OSC进行同源建模，得到预测的蛋白三维结构PDB格式文件。结果显示，106个OSC的蛋白序列与1W6K的相似性均大于40％，得到的蛋白模型的QMQE(Global Model Quality Estimation)值均在0至1之间，表明蛋白结构稳定。在羊毛甾醇合酶、环阿屯醇合酶和葫芦二烯醇合酶的氨基酸序列中对应OsPS Tyr257的位点是组氨酸，该氨基酸残基在同源建模的三维结构中与模板HsLAS的残基重合。比对OsPS和模板HsLAS的蛋白三维结构，我们发现OsPS Tyr257的空间位置与模板相对应的氨基酸残基的空间位置是一致的(图1A)。β-香树素合酶的Tyr257位点上出现了两种氨基酸，苯丙氨酸出现在单子叶植物燕麦的OSC(AsbAS1，GenBank ID：AJ311789)中，酪氨酸出现在其他的β-香树素合酶中，虽然酪氨酸和苯丙氨酸在结构上有一个羟基基团的差别，但在模拟的蛋白三维模型中，我们发现Tyr257位点的氨基酸空间位置是一致的，但明显不同于水稻的帕克醇合酶OsPS(GenBank ID：AK066327)(图1B)。
在不同功能的OSC中选取具有代表性的15个OSC，如表2所示，包括1个来自水稻(Oryza sativa)的帕克醇合酶(OsPS)，1个来自水稻的籼稻醇合酶(OsOS)，3个分别来自水稻、燕麦(Avena strigosa)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的环阿屯醇合酶(OsOSC2、AsCS1和AtCAS1)，1个来自西葫芦(Cucurbita pepo)的葫芦二烯醇合酶(CpCPQ)，2个分别来自拟南芥和人参(Panax ginseng)的羊毛甾醇合酶(AtLSS1和PgPNZ1)，2个分别来自百脉根(Lotus japonicus)和油橄榄(Olea europaea)的羽扇豆醇合酶(LjOSC3和OeOEW)，1个来自油橄榄的α-香树素合酶(OeOEA)，4个分别来自拟南芥、绿玉树(Euphorbia tirucalli)、人参和燕麦的β-香树素合酶(AtLUP4、EtAS、PgPNY1和AsbAS1)。在PyMOL软件中打开预测的这15个OSC的蛋白模型文件，找到对应帕克醇合酶OsPS Tyr257的氨基酸位点(不同OSC的氨基酸序列中对应OsPS Tyr257位点的氨基酸的种类或编号会有所不同，详见表1和表2；为便于理解，这里统一表述为Tyr257)，在这15个OSC中搜寻距离在Tyr257的
Figure BDA0002520045740000112
范围内的氨基酸，在这些氨基酸中剔除在序列比对中的高保守氨基酸和关键氨基酸，剩余的氨基酸作为待定点突变的氨基酸，结果如表2所示。在剔除的氨基酸中，除了OsPS和OsOS中的Phe/Leu365是酶功能的关键氨基酸，剩余的氨基酸是同一个保守的氨基酸。
表2. 15个OSC中待定点突变的氨基酸
Figure BDA0002520045740000111
Figure BDA0002520045740000121
将待定点突变的氨基酸分别用其余19种氨基酸替代，保存单位点定点突变的氨基酸序列。同源建模的实验方法同上。属于环阿屯醇合酶、羊毛甾醇合酶和葫芦二烯醇合酶的6个OSC(OsOSC2、AsCS1、AtCAS1、CpCPQ、AtLSS1、PgPNZ1)，用其余19种氨基酸替换距离Tyr257的
Figure BDA0002520045740000122
范围内的任一氨基酸(例如，用丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸或缬氨酸替换羊毛甾醇合酶PgPNZ1的268位点的色氨酸)，Tyr257的空间位置都未发生变化。
帕克醇合酶OsPS与上述的环阿屯醇合酶、羊毛甾醇合酶和葫芦二烯醇合酶(OsOSC2、AsCS1、AtCAS1、CpCPQ、AtLSS1、PgPNZ1)的阳离子中间产物都是C-B-C构象，属于前固醇阳离子型，但由于OsPS的Tyr257是酪氨酸而非组氨酸，Tyr257的空间位置很容易发生变化。在待定点突变的4个氨基酸位点(Ser255、Ser256、Ile258和Val261)上，分别用其余19种氨基酸进行氨基酸替换，总计有61种单位点定点突变(表3)的蛋白三维模型中的Tyr257的空间位置发生变化，图2展示了其中6种定点突变的蛋白三维模型。
表3
Figure BDA0002520045740000131
籼稻醇合酶OsOS与OsPS均来自单子叶植物水稻，但不同的是，OsOS产物籼稻醇的阳离子中间产物是C-sC-C式构象，并且OsOS与OsPS的Tyr257即使氨基酸相同，空间位置却有明显差别。在5个待定点突变的氨基酸位点Ser255、Cys256、Ile258、Val261和Val368上，只有Val261位点的缬氨酸分别被替换为苯丙氨酸(V261F)、赖氨酸(V261K)、甲硫氨酸(V261M)、精氨酸(V261R)、色氨酸(V261W)和酪氨酸(V261Y)时，蛋白三维模型中的Tyr257的空间位置发生改变，如图3所示。
OeOEA是来自油橄榄的α-香树素合酶，其阳离子中间产物是C-C-C式构象，属于达玛烷型阳离子，与OsPS、OsOS的阳离子中间产物都不相同，但对应OsPS Tyr257的氨基酸均是酪氨酸。在8个待定点突变的氨基酸位点Phe127、Trp258、Cys259、Cys261、Thr263、Thr264、Val371和Met730上，只有Trp258位点的色氨酸分别被替换为丙氨酸(W258A)、甘氨酸(W258G)和脯氨酸(W258P)以及Thr264位点的苏氨酸被替换为色氨酸(T264W)时，蛋白三维模型中的Tyr257的空间位置发生改变，如图4所示。
AtLUP4、EtAS、PgPNY1和AsbAS1是β-香树素合酶，其阳离子中间产物的构象是C-C-C式，但在对应OsPS Tyr257的位置上，AtLUP4、EtAS、PgPNY1是酪氨酸，AsbAS1是苯丙氨酸。在AtLUP4的5个待定点突变的氨基酸位点Trp258、Ser259、Cys261、Val264和Val372上，只有Val264位点的缬氨酸分别被替换为苯丙氨酸(V264F)和色氨酸(V264W)时，蛋白三维模型中的Tyr257的空间位置发生改变(图5(a)和(b))。在EtAS的9个待定点突变的氨基酸位点Phe125、Trp257、Cys258、Cys260、Met262、Val263、Val371、Glu372和Met729上，只有Val263位点的缬氨酸分别被替换为苯丙氨酸(V263F)和色氨酸(V263W)时，蛋白三维模型中的Tyr257的空间位置发生改变(图5(c)和(d))。在PgPNY1的7个待定点突变的氨基酸位点Phe127、Trp259、Cys260、Cys262、Val265、Val372和Met730上，只有Val265位点的缬氨酸分别被替换为苯丙氨酸(V265F)和色氨酸(V265W)时，蛋白三维模型中的Tyr257的空间位置发生改变(图5(e)和(f))。在AsbAS1的6个待定点突变的氨基酸位点Trp257、Cys258、Thr260、Leu262、Ile263和Cys368上，只有Ile263位点的异亮氨酸分别被替换为苯丙氨酸(I263F)、色氨酸(I263W)和酪氨酸(I263Y)以及Cys368位点的半胱氨酸被替换为色氨酸(C368W)时，蛋白三维模型中的Tyr257的空间位置发生改变(图5(g)，(h)，(i)和(j))。
LjOSC3和OeOEW属于羽扇豆醇合酶，其产物羽扇豆醇的阳离子中间产物是C-C-C构象，对应OsPS Tyr257的位点都是酪氨酸。在LjOSC3的8个待定点突变的氨基酸位点Leu255、Cys256、Cys258、Leu260、Val261、Val368、Glu369和Met726上，只有Val261位点的缬氨酸分别被替换为苯丙氨酸(V261F)和色氨酸(V261W)时，蛋白三维模型中的Tyr257的空间位置发生改变(图6(a)和(b))。在另一个羽扇豆醇合酶OeOEW的6个待定点突变的氨基酸位点Phe124、Leu256、Cys257、Cys259、Val262和Met727上，只有Val262位点的缬氨酸分别被替换为苯丙氨酸(V262F)和色氨酸(V262W)时，蛋白三维模型中的Tyr257的空间位置发生改变(图6(c)和(d))。
综合以上筛选出的OSC及其定点突变的情况可知：环阿屯醇合酶OsOSC2、AsCS1和AtCAS1、葫芦二烯醇合酶CpCPQ、羊毛甾醇合酶AtLSS1和PgPNZ1，这6个OsPS Tyr257相对应位点为组氨酸的OSC中，没有发现一种定点突变可以改变Tyr257(以OsPS中的氨基酸位点表示)的空间位置，组氨酸残基的空间位置不容易受周围氨基酸的影响。在OsPS Tyr257相对应位点为非组氨酸的OSC中，Tyr257(以OsPS中的氨基酸位点表示)的空间位置能够被其他氨基酸影响。帕克醇合酶OsPS的V261A/C/F/G/H/P/S/T/Y，籼稻醇合酶OsOS的V261F/K/M/R/W/Y，α-香树素合酶OeOEA的T264W，β-香树素合酶AtLUP4的V264F/W、EtAS的V263F/W、PgPNY1的V265F/W和AsbAS1的I263F/W/Y，羽扇豆醇合酶LjOSC3的V261F/W、OeOEW的V262F/W，这些突变影响了Tyr257的空间位置，并且在序列比对中，这些突变的氨基酸位点皆对应于同一个位点。对于β-香树素合酶AtLUP4、EtAS、PgPNY1和羽扇豆醇合酶LjOSC3、OeOEW而言，其Tyr257为酪氨酸，V261F/W这两种突变都对Tyr257空间位置产生影响。
实施例2.单位点定点突变的功能验证
1.OSC瞬时表达载体的构建
1.1 OSC基因的克隆
OsPS、OsOS和AsbAS1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10～12所示。以本实验室保存的OsPS、OsOS和AsbAS1的酵母pPICZA表达载体为模板，通过PCR扩增OsPS、OsOS和AsbAS1基因。基因的克隆用
Figure BDA0002520045740000142
高保真DNA聚合酶(货号#M0530S)按下列反应体系进行。
Figure BDA0002520045740000141
Figure BDA0002520045740000151
PCR反应条件为98℃2min；98℃10s，58℃30s，72℃2.5min，30个循环；72℃5min。PCR反应结束后，取2μL反应体系混合液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
表4.基因克隆的引物
Figure BDA0002520045740000152
注：引物OsPS-F和OsPS-R用于扩增OsPS基因，引物OsOS-F和OsOS-R用于扩增OsOS基因，引物AsbAS1-F和AsbAS1-R用于扩增AsbAS1基因。
1.2 PCR产物的回收
将上述PCR产物剩余部分用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳。在紫外灯下，用手术刀将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入2mL离心管中，做好标记。使用北京索莱宝科技有限公司的OMEGA胶回收试剂盒(货号：D2500-01)按照提供的说明书进行回收，得到OsPS、OsOS和AsbAS1基因。
1)称量胶块重量，加入1体积Binding Buffer(XP2)(如：100mg胶加100ul)。
2)将离心管置于在50-60℃的金属浴中7min，每2～3min振荡直至胶全部溶解(液体呈淡黄色)，冷却至室温。
3)将Mini Column放入2ml Collection Tube中，加入不大于700ul的胶液于滤管中。
4)10000×g，室温离心1min，弃滤液，直至胶液全部滤完。
5)加入300ul的Binding Buffer(XP2)，不小于13000×g，室温离心1min，弃滤液。
6)加入700ul的Wash Buffer(加入乙醇)，不小于13000×g，室温离心1min，弃滤液。
7)再重复步骤6)。
8)不小于13000×g，室温离心2min后静置，晾干乙醇。
9)将Mini Column放到新的1.5ml离心管中，加入15～30ul Elution Buffer于滤管中心，室温静置2min，不小于13000×g，室温离心1min。
10)将滤液再加入至滤管中心，室温静置2min，不小于13000×g，室温离心3min。回收液保存，备用。
1.3 BP反应
1)取冰盒，于冰上按照如下体系加入试剂：
Figure BDA0002520045740000153
2)瞬时离心，25℃过夜反应。
3)瞬时离心，加入1ul Proteinase K(蛋白酶K)，37℃孵育10min，终止反应。获得重组载体pDONR207-OsPS、pDONR207-OsOS和pDONR207-AsbAS1。
1.4 转化大肠杆菌并提取质粒
取冰盒，于冰上：将5ul上述重组载体、20ul大肠杆菌TreliefTM5α感受态加入到离心管中，混合均匀，冰浴30min。金属浴42℃热击60s。冰浴2min。加入500ul无抗性LB液体培养基，于37℃恒温摇床中以180rpm的速度振荡培养45min。室温下，5000rpm离心2min，弃去上清，余200ul左右用移液器吹打使菌液重悬，均匀涂布在含庆大霉素(100mg/L)的固体LB培养基上，做好标记，置于37℃培养箱，正置30min至培养基表面无水痕，倒置培养12～16h。挑取阳性克隆：在超净台中，取10个1.5ml离心管，分别加入含100mg/L庆大霉素的LB液体培养基500ul，从平板上分别用枪头沾染10个生长状态良好的单菌落(圆形、大小适中、边缘整齐)，将枪头打入上述离心管中，37℃220rpm振荡培养3～4h。菌液PCR鉴定，PCR体系和程序同1.1，测序正确后，提取质粒。
1.5 LR反应
取冰盒，于冰上按照如下体系加入试剂：
Figure BDA0002520045740000161
瞬时离心，25℃过夜反应。瞬时离心，加入1ul Proteinase K，37℃10min，终止反应。转化大肠杆菌并涂布在含卡那霉素(50mg/l)的固体LB培养基上培养(方法和步骤同1.4)。挑取阳性克隆：在超净台中，取10个1.5ml离心管，分别加入含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基500ul，从平板上分别用枪头沾染10个生长状态良好的单菌落，将枪头打入上述离心管中，37℃220rpm振荡培养3～4h。菌液PCR鉴定，PCR体系和程序同1.1，测序正确后，提取质粒。获得重组载体pEAQ-HT DEST 1-OsPS、pEAQ-HT DEST 1-OsOS和pEAQ-HT DEST 1-AsbAS1。
2.单位点突变的瞬时表达载体的构建
2.1 单位点突变
(1)设计定点突变的引物：每个引物对在其3’端均包含非重叠序列，在5’端包含引物-引物互补(重叠)序列。非重叠序列比互补序列长，以使非重叠序列的解链温度比引物-引物互补的解链温度高5～10℃，突变位点可置于互补区或非重叠区(图7)。
表5.定点突变的引物
Figure BDA0002520045740000162
Figure BDA0002520045740000171
(2)以构建好的重组载体pDONR207-OsPS、pDONR207-OsOS和pDONR207-AsbAS1为模板，采用表5中相应的定点突变引物，用
Figure BDA0002520045740000173
高保真DNA聚合酶按下列反应体系进行PCR，获得单个位点定点突变的基因。
Figure BDA0002520045740000172
Figure BDA0002520045740000181
PCR反应条件为98℃30s；98℃10s，60℃30s，72℃6min，20个循环；72℃30min。PCR反应结束后，取2μL反应体系混合液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
2.2 DpnI酶切反应
对有目的条带的样品进行DpnI酶切反应，去除模板。按照如下反应体系进行酶切，37℃酶切2h。
Figure BDA0002520045740000182
2.3 酶切产物的回收
将上述酶切产物用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳。在紫外灯下，用手术刀将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入2mL离心管中，做好标记。使用北京索莱宝科技有限公司的OMEGA胶回收试剂盒(货号：D2500-01)按照提供的说明书进行回收，方法同1.2。
2.4 转化大肠杆菌并提取质粒
方法同1.4。
2.5 LR反应
取冰盒，于冰上按照如下体系加入试剂：
Figure BDA0002520045740000183
瞬时离心，25℃过夜反应。瞬时离心，加入1ul Proteinase K，37℃10min，终止反应。转化大肠杆菌并涂布在含卡那霉素(50mg/l)的固体LB培养基上培养(方法和步骤同1.4)。挑取阳性克隆：在超净台中，取10个1.5ml离心管，分别加入含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基500ul，从平板上分别用枪头沾染10个生长状态良好的单菌落，将枪头打入上述离心管中，37℃220rpm振荡培养3～4h。菌液PCR鉴定，PCR体系和程序同2.1，测序正确后，提取质粒。获得包含突变基因的pEAQ-HT DEST 1重组载体。
3.瞬时表达载体的转化
3.1 冻融法转化农杆菌
取2μl质粒(包含突变基因的pEAQ-HT DEST 1重组载体)加入到装有20μl农杆菌GV3101感受态细胞的离心管中，混合均匀。冰浴5min。液氮5min。28℃水浴5min。冰浴5min。加入500μl无抗性LB液体培养基，28℃振荡培养2～3h。5000rpm，室温离心1min后，留取200μl菌液，重悬后涂布于含有25mg/l利福平、50mg/l庆大霉素和50mg/l卡那霉素的固体LB培养基上，28℃暗培养2天左右至单菌落出现。挑取单菌落，菌液PCR鉴定，PCR体系和程序同2.1，鉴定正确的农杆菌用于本氏烟草转化。
3.2 本氏烟草转化
1)取农杆菌接种于10ml含25mg/l利福平、50mg/l庆大霉素和50mg/l卡那霉素的LB液体培养基中，28℃220rpm震荡培养24h。
2)按照如下体系配制接种缓冲液，混匀后于4℃保存。
Figure BDA0002520045740000191
3)将菌液于4℃5500rpm离心10min，用5ml接种缓冲液重悬菌体。
4)将重悬液置于室温，黑暗条件下孵育不少于2h。
5)用紫外分光光度计检测菌液OD600值，用接种缓冲液调节菌液浓度至OD600＝0.2。
6)将含tHMGR基因的农杆菌菌液同含目的基因的农杆菌菌液等体积混匀。
7)用1ml无菌注射器的针头轻点待接种烟草叶片下表皮(注意尽量不要刺穿叶片)，用注射器吸取适当菌液，于叶片破口处缓慢注入菌液，直到叶片内部被菌液浸润。
8)接种后约6天左右收取烟草叶片，用于提取化合物。
4.烟草三萜类化合物提取与检测
4.1 烟草中三萜类化合物的提取
(1)将烟草叶片置于冷冻干燥机中干燥。
(2)按照如下体系配制裂解液(现配现用)。粪醇(coprostenol，CAS 360-68-9，Sigma，货号：C7578)作为内标。
Figure BDA0002520045740000192
(3)称取10mg烟草叶片装入2ml离心管中，加入1ml裂解液。
(4)75℃水浴加热1h(期间间歇性涡旋)，打开离心管盖子，75℃水浴加热至乙醇挥发。
(5)在离心管中加500ul乙酸乙酯，振荡。
(6)加500ul水并振荡。
(7)1000×g，室温离心10min，取上层有机相于2ml玻璃进样小瓶中(尽量不要取到下层的水相)，标记后4℃保存。
4.2 烟草中三萜类化合物的GC-MS检测
1)取50ul乙酸乙酯(CAS号：141-78-6，Sigma，货号：270989)提取物于新的插有内衬管的2ml玻璃进样小瓶中，于通风橱中过夜挥干(确保没有水分)。
2)在上述小瓶的内衬管中加入30ul衍生试剂1-(三甲基硅基)咪唑-吡啶混合物(CAS号：8077-35-8，Sigma，货号：92718)，充分振荡后于70℃衍生化30min，冷却至室温。
3)用GC-QQQ-MS平台对衍生化的样品进行检测分析；GC-QQQ-MS平台为ThermoScientificTM TRACETM 1310气相色谱仪和Thermo ScientificTM ISQTM 7000单四极杆GC-MS系统；色谱柱为ZB-5HT(0.25mm×30m，Thermo Fisher scientific)；载气为He，流速1.0ml/min；进样器温度为280℃。升温程序为：起始温度170℃，6℃/min升温至290℃，保持4min，10℃/min升温至340℃。进样量为1ul，分流比20:1。MS检测器在70eV条件下，扫描区间为60～800。
4)GC-MS的结果用Dionex Chromeleon 7色谱数据系统软件进行分析。
5.结果与分析
5.1 AsbAS1及其单位点突变在本氏烟草中的瞬时表达产物分析
在计算机模拟中，AsbAS1的C368W、I263F/Y的蛋白模型的Tyr257的空间位置发生明显改变，在本氏烟草瞬时表达体系中验证了突变对酶功能的影响。本研究利用GC-MS对烟草表达产物进行了分析，以仅注射tHMGR农杆菌菌液的叶片作为对照，粪醇(coprostenol，CAS360-68-9，Sigma，货号C7578)作为内标。结果如图8所示，AsbAS1的C368W样品的气相色谱图与对照的基本一致，没有β-香树素(β-Amyrin，分子式C30H50O，CAS号：559-70-6，Sigma，货号：09236)的色谱峰，表明酶已经丧失了功能。与对照相比，AsbAS1的I263F/Y的色谱图中出现了与β-香树素保留时间一致的色谱峰，提取β-香树素的特征离子峰EIC203和EIC218，仍出现与β-香树素保留时间一致的色谱峰，提取该物质的质谱图与文献比较后确定是β-香树素，表明I263F/Y不会影响AsbAS1产生β-香树素的功能。I263F的色谱图中有一个三萜的色谱峰(保留时间为19.78min)，除此之外没有发现其他三萜的色谱峰，提取该物质(Product 1)的质谱图并在数据库中比对，得知该物质可能为羽扇豆醇(Lupeol，CAS号：545-47-1，Sigma，货号：L5632)(图9)。
I263F/Y虽然不影响酶产生β-香树素，但可能影响酶的催化能力。为了验证这个假设，本研究利用GC-MS对AsbAS1及其突变体的催化效率进行分析，通过粪醇内标对产物β-香树素相对定量，以此反映AsbAS1及其突变体的催化能力。结果如图10所示，与AsbAS1相比，I263Y大大降低了催化底物生成β-香树素的量，而I263F稍稍降低了β-香树素的产量。
5.2 OsOS及其单位点突变在本氏烟草中的瞬时表达产物分析
在计算机模拟中，OsOS有6个突变V261F/K/M/R/W/Y可以改变Tyr257的空间位置，但在构建V261R突变的瞬时表达载体时，测序结果不正确，之后的功能验证中就没有进行验证了。V261C/L虽然不能影响Tyr257的空间位置，但半胱氨酸与甲硫氨酸均含有硫，可以作为对照探究硫-氢键对酶功能的影响；亮氨酸是个含长链烷烃的氨基酸，与其他氨基酸类别不同，可以在功能验证中进行探究。本实验构建的OsOS单位点突变的瞬时表达载体如下表所示。
表6. OsOS单位点突变的瞬时表达载体
Figure BDA0002520045740000201
Figure BDA0002520045740000211
由图11所示的GC-MS的结果可知，与对照(仅注射tHMGR农杆菌菌液的烟草)相比，OsOS及其突变产生的差异化合物为籼稻醇(orysatinol，化学结构如图18所示)，色谱峰的保留时间为17.66min，特征离子峰为EIC 206/393，但一些样品中的籼稻醇的量比较少。利用GC-MS对OsOS及其突变体的催化效率进行分析，通过粪醇内标对产物籼稻醇相对定量，以此反映OsOS及其突变体的催化能力。结果如图12所示，V261C/L(不影响Tyr257的空间位置)提高了酶催化生成籼稻醇的量，V261F/K/M/W/Y降低了酶催化生成籼稻醇的量，这可能与影响了Tyr257的空间位置有关。
5.3 OsPS及其单位点突变在本氏烟草中的瞬时表达产物分析
在计算机模拟中，OsPS在4个氨基酸位点(Ser255、Ser256、Ile258和Val261)有61个突变能够改变Tyr257的空间位置，并且在多个OSC中的Val261位点的氨基酸对Tyr257的空间位置有影响，故选择Val261位点的突变进行功能验证，同时选择了临近的Ile258位点的两个突变I258A/G进行功能验证，这两个突变也可以改变Tyr257的空间位置。本实验构建的OsPS单位点突变的瞬时表达载体如表7所示。
表7. OsPS单位点突变的瞬时表达载体
Figure BDA0002520045740000212
由GC-MS的结果(图13)可知，与对照(仅注射tHMGR农杆菌菌液的烟草)相比，OsPS及其突变产生的差异化合物为帕克醇(Parkeol，CAS号：514-45-4，国家标准物质资源平台，平台编号：D121027)，色谱峰的保留时间为19.23min，特征离子峰为EIC 295/385，V261F/G/H/L/W/Y和I258A/G的样品中均检测到了帕克醇，而V261A/R的样品中没有检测到帕克醇。V261A/R样品的气相色谱图与对照的基本一致，表明酶已经丧失了功能。
图14是根据GC-MS的帕克醇峰面积积分得到的柱状图，用粪醇内标做了矫正，每组皆有3个重复，目的是以OsPS为标准比较突变对酶催化帕克醇能力的影响，V261F/G/H/L/W/Y和I258A/G不影响酶产生帕克醇，但明显抑制了催化生成帕克醇的能力。在突变的样品中，V261L/W样品检测到的帕克醇量是最低的，再结合气相色谱图，我们发现，V261A/R样品与对照是一致的，突变V261A/R使酶失去了活性。
6.结论
通过GC-MS分析，AsbAS1C368W没有产生三萜化合物，AsbAS1I263W催化产生β-香树素的量显著降低，AsbAS1I263F催化产生β-香树素的量稍有降低但产生了羽扇豆醇。OsOSV261F /K/M/W/Y降低了酶催化生成籼稻醇的量，而OsOSV261C/L(Tyr257的空间位置不改变)提高了酶催化生成籼稻醇的量。OsPSV261A/R没有产生任何三萜化合物，OsPSV261F/G/H/L/W/Y降低了酶催化生成帕克醇的量，OsPSI258A/G催化产生帕克醇的量也降低了。由此可见，Val261对OSC而言不是直接作用于底物的氨基酸，通过影响Tyr257的空间位置使酶的催化能力发生不同程度的改变。
实施例3.双位点定点突变的功能验证
1.双位点突变的瞬时表达载体的构建
1.1 双位点定点突变
使用表5中相应的OsPS定点突变引物，以构建好的OsPS单位点突变pDONR207载体为模板，定点突变的反应体系和PCR程序设定如下。
Figure BDA0002520045740000221
PCR反应条件为98℃30s；98℃10s，60℃30s，72℃6min，20个循环；72℃30min。PCR反应结束后，取2μL反应体系混合液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.2 DpnI酶切反应
对有目的条带的样品进行DpnI酶切反应，去除模板。按照如下反应体系进行酶切，37℃酶切2h。
Figure BDA0002520045740000222
1.3 酶切产物的回收
酶切产物的回收方法同实施例2。将上述酶切产物用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳。在紫外灯下，用手术刀将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入2mL离心管中，做好标记。使用北京索莱宝科技有限公司的OMEGA胶回收试剂盒(货号：D2500-01)按照提供的说明书进行回收。
1.4 转化大肠杆菌并提取质粒
方法同实施例2。
1.5 LR反应
取冰盒，于冰上按照如下体系加入试剂：
Figure BDA0002520045740000231
瞬时离心，25℃过夜连接。瞬时离心，加入1ul Proteinase K，37℃10min，终止反应。转化大肠杆菌并涂布在含卡那霉素(50mg/l)的固体LB培养基上培养(方法同实施例2)。挑取阳性克隆：在超净台中，取10个1.5ml离心管，分别加入含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基500ul，从平板上分别用枪头沾染10个生长状态良好的单菌落，将枪头打入上述离心管中，37℃220rpm振荡培养3～4h。菌液PCR鉴定，PCR体系和程序同1.1，测序正确后，提取质粒。获得包含突变基因的pEAQ-HT DEST 1重组载体。
2.瞬时表达载体的转化
2.1 冻融法转化农杆菌
取2μl质粒(包含突变基因的pEAQ-HT DEST 1重组载体)加入到装有20μl农杆菌GV3101感受态细胞的离心管中，混合均匀。冰浴5min。液氮5min。28℃水浴5min。冰浴5min。加入500μl无抗性LB液体培养基，28℃振荡培养2～3h。5000rpm，室温离心1min后，留取200μl菌液，重悬后涂布于含有25mg/l利福平、50mg/l庆大霉素和50mg/l卡那霉素的固体LB培养基上，28℃暗培养2天左右至单菌落出现。挑取单菌落，菌液PCR鉴定，PCR体系和程序同1.1。
2.2 本氏烟草转化
本氏烟草的转化方法同实施例2。
3.烟草三萜类化合物提取与检测
烟草三萜类化合物提取与检测的方法同实施例2。
4.结果与分析
在表7所示的OsPS单位点突变的基础上，引入了I732A突变，构建双位点突变的瞬时表达载体，由于测序结果不正确，OsPSV261W+I732A的瞬时表达载体未成功构建，仅有9个双位点突变在本氏烟草瞬时表达体系中进行了功能验证。GC-MS分析的结果如图15所示，帕克醇色谱峰的保留时间为19.23min，特征离子峰为EIC 295/385，OsPS及其9个突变体均产生了帕克醇。图16是根据GC-MS的帕克醇峰面积积分得到的柱状图(用内标粪醇做了矫正)，目的是以OsPS为标准比较双位点突变对酶催化生成帕克醇的能力的影响。与OsPS相比，OsPSV261L +I732A和OsPSI258G+I732A的催化能力几乎不受影响，OsPSI258A+I732A的催化能力稍高一些，剩余的6个突变的催化能力都受到不同程度抑制。
由图13和图15的GC-MS结果可知，OsPSV261F与OsPSV261F+I732A的均产生了帕克醇，酶的功能没有丧失。比较突变对酶催化能力的影响，图17(a)表明OsPSV261F催化生成帕克醇的能力降低，OsPSV261F+I732A催化生成帕克醇的能力虽然低于OsPS但高于OsPSV261F的催化能力，说明引入I732A突变之后，酶的催化能力得到部分恢复。与此同时，我们在蛋白三维模型的比对中发现OsPSV261F与OsPSV261F+I732A的Tyr257空间位置皆发生了明显变化，并且Tyr257的氨基酸残基的方向不同(图17(b))，这种不同可能影响新的产物生成。GC-MS的结果如图17(c)所示，与对照(仅注射tHMGR农杆菌菌液的烟草)相比，OsPSV261F+I732A产生的差异化合物Product2，色谱峰的保留时间为17.66min，提取化合物的质谱图并结合文献分析，确定Product 2为籼稻醇(图18)，这个化合物是C-sC-C式构象的产物，不同于C-B-C构象的帕克醇。我们推测Tyr257空间位置与催化产生帕克醇的活性高低有关，与籼稻醇的产生也有一定关系。
OsPSV261A的GC-MS结果(图13)表明其失去了酶的活性，没有帕克醇产生，其TIC图与对照的相比也是一致的，说明没有产生其他差异化合物，而引入I732A突变之后，酶的活性得到了恢复，产生了帕克醇(图15)，但催化能力还是低于未突变的酶(图19(a))。在图19(b)所示的蛋白三维模型中，OsPSV261A的Tyr257空间位置发生了改变，但是OsPSV261A+I732A的Tyr257空间位置恢复到了OsPS的位置。与对照相比，OsPSV261A+I732A产生了除了帕克醇之外的2个三萜化合物Product 3(图20)和Product 4(图21)，这两个化合物能够在OsPS样品中检测到，在OsPSV261A样品中未检测到。
OsPSI258A+I732A及其单突的这组结果与OsPSV261A+I732A及其单突的有一些相似。图22(a)表明I732A突变引入之后，由I258A降低的催化能力得到提高，OsPSI258A+I732A的催化能力甚至超过了未突变的酶，这应该与Tyr257空间位置的恢复有关(图22(b))。出乎意料的是，我们在OsPSI258A+I732A的样品中检测到了帕克醇之外的4个三萜产物Product 5、6、7和8(图22(c))，提取它们的质谱，Product 6与Product 2的质谱图几乎一致，再比较保留时间确定Product 6为籼稻醇，Product 5、7和8的结构未知(图23-25)。
5.结论
通过GC-MS分析，OsPSV261F+I732A产生了新的化合物籼稻醇，OsPSV261A+I732A恢复了由OsPSV261A失去的活性但不产生籼稻醇，OsPSI258A+I732A催化生成帕克醇的活性得到提高，还产生了籼稻醇以及3个未知的三萜化合物。OsPS的Val261与Ile258是两个非直接作用的氨基酸，定点突变没有产生新的化合物，而与另一个非直接作用氨基酸的定点突变I732A相配合，不仅有新的化合物产生，还能够恢复单位点突变丧失的酶活性。
序列表
<110> 东北林业大学
<120> 一种改变2, 3-氧化鲨烯环化酶的活性或功能的方法
<130> P200342-DBL
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 759
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
Met Trp Arg Leu Lys Val Ser Glu Gly Gly Ser Pro Trp Leu Arg Ser
1 5 10 15
Val Asn Asn Leu Leu Gly Arg Gln Val Trp Glu Phe Asp Pro Asp Leu
20 25 30
Gly Thr Pro Glu Glu Arg Ala Asp Val Glu Lys Ala Arg Arg Glu Phe
35 40 45
Ala Glu His Arg Phe Glu Arg Lys His Ser Ser Asp Leu Leu Met Arg
50 55 60
Met Gln Phe Ala Lys Glu Asn Cys Gln Lys Leu Asp Leu Leu Ala Val
65 70 75 80
Lys Arg Gly Glu His Glu Asp Val Met Gly Glu Ala Val Trp Ser Ser
85 90 95
Leu Lys Arg Ala Ile Ser Arg Val Cys Asn Leu Gln Ala His Asp Gly
100 105 110
His Trp Pro Gly Asp Tyr Ala Gly Leu Met Phe Phe Leu Pro Gly Leu
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Ile Ile Thr Leu His Val Ser Gly Val Leu Asn Thr Val Leu Ser Ser
130 135 140
Glu His Gln Lys Glu Met Arg Arg Tyr Ile Tyr Asn His Gln Asn Glu
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Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Ile Glu Gly His Ser Thr Met Leu Gly
165 170 175
Ser Ser Leu Asn Tyr Val Ala Leu Arg Leu Leu Gly Glu Gly Pro Asn
180 185 190
Gly Gly Asp Gly Cys Ile Glu Asn Gly Arg Asn Trp Ile Leu Asp His
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Gly Gly Ala Thr Phe Thr Thr Ser Trp Gly Lys Phe Trp Leu Ser Val
210 215 220
Leu Gly Val Phe Asp Trp Ser Gly Asn Asn Pro Val Pro Pro Glu Leu
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Leu Leu Leu Pro Tyr Gln Leu Pro Phe His Pro Gly Arg Met Ser Ser
245 250 255
Tyr Ile Arg Met Val Phe Ile Pro Met Ser Tyr Ile Tyr Gly Lys Arg
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Phe Val Gly Pro Val Thr Pro Val Val Leu Glu Leu Arg Ser Glu Leu
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Tyr Asn Asp Pro Tyr Asp Glu Ile Asp Trp Asn Lys Ala Arg Thr Gln
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Pro Gly Arg Lys Leu Arg Glu Lys Ala Leu Ala Thr Ser Met Arg Asn
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Val His Tyr Glu Asp Glu Cys Thr Arg Tyr Ile Cys Phe Gly Gly Val
355 360 365
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Glu Ala Phe Lys Cys His Ile Ala Arg Val Tyr Asp Tyr Leu Trp Ile
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Gln Leu Leu Asp Asn Cys Pro Arg Asp Phe Asn Arg Trp Tyr Arg His
450 455 460
Ile Ser Lys Gly Gly Trp Thr Phe Thr Thr Ala Asp Asp Gly Trp Gln
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Val Ser Asp Cys Thr Ala Thr Ala Leu Lys Ala Cys Leu Leu Leu Ser
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Arg Ile Ser Pro Glu Ile Val Gly Glu Pro Leu Glu Ile Asp Ala Gln
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Tyr Asp Ala Val Asn Cys Leu Met Ser Leu Met Asn Asp Asn Gly Gly
515 520 525
Phe Ser Ala Phe Glu Leu Val Arg Ser Asn Thr Trp Leu Glu His Ile
530 535 540
Asn Pro Thr Glu Ala Phe Gly Arg Val Met Ile Glu Tyr Pro Tyr Val
545 550 555 560
Glu Cys Thr Ser Ser Ser Ile Gln Cys Leu Ala Leu Phe Lys Lys Leu
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His Pro Gly His Arg Lys Glu Glu Val Glu Asn Cys Ile Ser Lys Gly
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Ala Asn Phe Ile Glu Ser Ser Gln Arg Ser Asp Gly Ser Trp Tyr Gly
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Ser Trp Gly Ile Cys Phe Thr Tyr Ala Thr Trp Phe Ala Val Thr Gly
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Leu Val Ser Ala Gly Arg Thr Leu Gly Asn Ser Ala Thr Val Arg Lys
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Tyr Arg Asn Ile Phe Pro Ile Met Ala Leu Thr Gly Tyr Arg Arg Arg
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<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
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<213> 燕麦(Avena strigosa)
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Glu Asp Gly Gly Trp Gly Lys Met Val Leu Gly Pro Ser Thr Met Phe
165 170 175
Gly Ser Cys Met Asn Tyr Ala Thr Leu Met Ile Leu Gly Glu Lys Arg
180 185 190
Asn Gly Asp His Lys Asp Ala Leu Glu Lys Gly Arg Ser Trp Ile Leu
195 200 205
Ser His Gly Thr Ala Thr Ala Ile Pro Gln Trp Gly Lys Ile Trp Leu
210 215 220
Ser Ile Ile Gly Val Tyr Glu Trp Ser Gly Asn Asn Pro Ile Ile Pro
225 230 235 240
Glu Leu Trp Leu Val Pro His Phe Leu Pro Ile His Pro Gly Arg Phe
245 250 255
Trp Cys Phe Thr Arg Leu Ile Tyr Met Ser Met Ala Tyr Leu Tyr Gly
260 265 270
Lys Lys Phe Val Gly Pro Ile Ser Pro Thr Ile Leu Ala Leu Arg Gln
275 280 285
Asp Leu Tyr Ser Ile Pro Tyr Cys Asn Ile Asn Trp Asp Lys Ala Arg
290 295 300
Asp Tyr Cys Ala Lys Glu Asp Leu His Tyr Pro Arg Ser Arg Ala Gln
305 310 315 320
Asp Leu Ile Ser Gly Cys Leu Thr Lys Ile Val Glu Pro Ile Leu Asn
325 330 335
Trp Trp Pro Ala Asn Lys Leu Arg Asp Arg Ala Leu Thr Asn Leu Met
340 345 350
Glu His Ile His Tyr Asp Asp Glu Ser Thr Lys Tyr Val Gly Ile Cys
355 360 365
Pro Ile Asn Lys Ala Leu Asn Met Ile Cys Cys Trp Val Glu Asn Pro
370 375 380
Asn Ser Pro Glu Phe Gln Gln His Leu Pro Arg Phe His Asp Tyr Leu
385 390 395 400
Trp Met Ala Glu Asp Gly Met Lys Ala Gln Val Tyr Asp Gly Cys His
405 410 415
Ser Trp Glu Leu Ala Phe Ile Ile His Ala Tyr Cys Ser Thr Asp Leu
420 425 430
Thr Ser Glu Phe Ile Pro Thr Leu Lys Lys Ala His Glu Phe Met Lys
435 440 445
Asn Ser Gln Val Leu Phe Asn His Pro Asn His Glu Ser Tyr Tyr Arg
450 455 460
His Arg Ser Lys Gly Ser Trp Thr Leu Ser Ser Val Asp Asn Gly Trp
465 470 475 480
Ser Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Ala Val Lys Ala Leu Leu Leu Leu
485 490 495
Ser Lys Ile Ser Ala Asp Leu Val Gly Asp Pro Ile Lys Gln Asp Arg
500 505 510
Leu Tyr Asp Ala Ile Asp Cys Ile Leu Ser Phe Met Asn Thr Asp Gly
515 520 525
Thr Phe Ser Thr Tyr Glu Cys Lys Arg Thr Phe Ala Trp Leu Glu Val
530 535 540
Leu Asn Pro Ser Glu Ser Phe Arg Asn Ile Val Val Asp Tyr Pro Ser
545 550 555 560
Val Glu Cys Thr Ser Ser Val Val Asp Ala Leu Ile Leu Phe Lys Glu
565 570 575
Thr Asn Pro Arg Tyr Arg Arg Ala Glu Ile Asp Lys Cys Ile Glu Glu
580 585 590
Ala Val Val Phe Ile Glu Asn Ser Gln Asn Lys Asp Gly Ser Trp Tyr
595 600 605
Gly Ser Trp Gly Ile Cys Phe Ala Tyr Gly Cys Met Phe Ala Val Arg
610 615 620
Ala Leu Val Ala Thr Gly Lys Thr Tyr Asp Asn Cys Ala Ser Ile Arg
625 630 635 640
Lys Ser Cys Lys Phe Val Leu Ser Lys Gln Gln Thr Thr Gly Gly Trp
645 650 655
Gly Glu Asp Tyr Leu Ser Ser Asp Asn Gly Glu Tyr Ile Asp Ser Gly
660 665 670
Arg Pro Asn Ala Val Thr Thr Ser Trp Ala Met Leu Ala Leu Ile Tyr
675 680 685
Ala Gly Gln Val Glu Arg Asp Pro Val Pro Leu Tyr Asn Ala Ala Arg
690 695 700
Gln Leu Met Asn Met Gln Leu Glu Thr Gly Asp Phe Pro Gln Gln Glu
705 710 715 720
His Met Gly Cys Phe Asn Ser Ser Leu Asn Phe Asn Tyr Ala Asn Tyr
725 730 735
Arg Asn Leu Tyr Pro Ile Met Ala Leu Gly Glu Leu Arg Arg Arg Leu
740 745 750
Leu Ala Ile Lys Ser
755
<210> 4
<211> 759
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 4
Met Trp Arg Leu Lys Ile Gly Glu Gly Asn Gly Asp Asp Pro Tyr Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Asn Asn Phe Ala Gly Arg Gln Thr Trp Glu Phe Asp Pro
20 25 30
Asp Gly Gly Ser Pro Glu Glu Arg His Ser Val Val Glu Ala Arg Arg
35 40 45
Ile Phe Tyr Asp Asn Arg Phe His Val Lys Ala Ser Ser Asp Leu Leu
50 55 60
Trp Arg Met Gln Phe Leu Arg Glu Lys Lys Phe Glu Gln Arg Ile Ala
65 70 75 80
Pro Val Lys Val Glu Asp Ser Glu Lys Val Thr Phe Glu Thr Ala Thr
85 90 95
Ser Ala Leu Arg Arg Gly Ile His Phe Phe Ser Ala Leu Gln Ala Ser
100 105 110
Asp Gly His Trp Pro Ala Glu Asn Ala Gly Pro Leu Phe Phe Leu Pro
115 120 125
Pro Leu Val Phe Cys Leu Tyr Ile Thr Gly His Leu Asp Glu Val Phe
130 135 140
Thr Ser Glu His Arg Lys Glu Ile Leu Arg Tyr Ile Tyr Cys His Gln
145 150 155 160
Lys Glu Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Ile Glu Gly His Ser Thr Met
165 170 175
Phe Cys Thr Thr Leu Asn Tyr Ile Cys Met Arg Ile Leu Gly Glu Ser
180 185 190
Pro Asp Gly Gly His Asp Asn Ala Cys Gly Arg Ala Arg Glu Trp Ile
195 200 205
Leu Ser His Gly Gly Val Thr Tyr Ile Pro Ser Trp Gly Lys Thr Trp
210 215 220
Leu Ser Ile Leu Gly Val Phe Asp Trp Ser Gly Ser Asn Pro Met Pro
225 230 235 240
Pro Glu Phe Trp Ile Leu Pro Ser Phe Phe Pro Val His Pro Ala Lys
245 250 255
Met Trp Ser Tyr Cys Arg Met Val Tyr Leu Pro Met Ser Tyr Leu Tyr
260 265 270
Gly Lys Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Ser Leu Ile Leu Gln Leu Arg
275 280 285
Lys Glu Leu Tyr Leu Gln Pro Tyr Glu Glu Ile Asn Trp Met Lys Val
290 295 300
Arg His Leu Cys Ala Lys Glu Asp Thr Tyr Tyr Pro Arg Pro Leu Val
305 310 315 320
Gln Glu Leu Val Trp Asp Ser Leu Tyr Ile Phe Ala Glu Pro Phe Leu
325 330 335
Ala Arg Trp Pro Phe Asn Lys Leu Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gln Leu
340 345 350
Ala Met Lys His Ile His Tyr Glu Asp Glu Asn Ser Arg Tyr Ile Thr
355 360 365
Ile Gly Cys Val Glu Lys Val Leu Cys Met Leu Ala Cys Trp Val Glu
370 375 380
Asp Pro Asn Gly Asp Tyr Phe Lys Lys His Leu Ser Arg Ile Ser Asp
385 390 395 400
Tyr Leu Trp Met Ala Glu Asp Gly Met Lys Met Gln Ser Phe Gly Ser
405 410 415
Gln Leu Trp Asp Thr Gly Phe Ala Met Gln Ala Leu Leu Ala Ser Asn
420 425 430
Leu Ser Ser Glu Ile Ser Asp Val Leu Arg Arg Gly His Glu Phe Ile
435 440 445
Lys Asn Ser Gln Val Gly Glu Asn Pro Ser Gly Asp Tyr Lys Ser Met
450 455 460
Tyr Arg His Ile Ser Lys Gly Ala Trp Thr Phe Ser Asp Arg Asp His
465 470 475 480
Gly Trp Gln Val Ser Asp Cys Thr Ala His Gly Leu Lys Cys Cys Leu
485 490 495
Leu Phe Ser Met Leu Ala Pro Asp Ile Val Gly Pro Lys Gln Asp Pro
500 505 510
Glu Arg Leu His Asp Ser Val Asn Ile Leu Leu Ser Leu Gln Ser Lys
515 520 525
Asn Gly Gly Met Thr Ala Trp Glu Pro Ala Gly Ala Pro Lys Trp Leu
530 535 540
Glu Leu Leu Asn Pro Thr Glu Met Phe Ser Asp Ile Val Ile Glu His
545 550 555 560
Glu Tyr Ser Glu Cys Thr Ser Ser Ala Ile Gln Ala Leu Ser Leu Phe
565 570 575
Lys Gln Leu Tyr Pro Asp His Arg Thr Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ile
580 585 590
Lys Lys Ala Ala Glu Tyr Leu Glu Asn Met Gln Thr Arg Asp Gly Ser
595 600 605
Trp Tyr Gly Asn Trp Gly Ile Cys Phe Thr Tyr Gly Thr Trp Phe Ala
610 615 620
Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Gly Lys Thr Phe Asn Asp Cys Glu Ala
625 630 635 640
Ile Arg Lys Gly Val Gln Phe Leu Leu Ala Ala Gln Lys Asp Asn Gly
645 650 655
Gly Trp Gly Glu Ser Tyr Leu Ser Cys Ser Lys Lys Ile Tyr Ile Ala
660 665 670
Gln Val Gly Glu Ile Ser Asn Val Val Gln Thr Ala Trp Ala Leu Met
675 680 685
Gly Leu Ile His Ser Gly Gln Ala Glu Arg Asp Pro Ile Pro Leu His
690 695 700
Arg Ala Ala Lys Leu Ile Ile Asn Ser Gln Leu Glu Ser Gly Asp Phe
705 710 715 720
Pro Gln Gln Gln Ala Thr Gly Val Phe Leu Lys Asn Cys Thr Leu His
725 730 735
Tyr Ala Ala Tyr Arg Asn Ile His Pro Leu Trp Ala Leu Ala Glu Tyr
740 745 750
Arg Ala Arg Val Ser Leu Pro
755
<210> 5
<211> 762
<212> PRT
<213> 绿玉树(Euphorbia tirucalli)
<400> 5
Met Trp Lys Leu Lys Ile Ala Glu Gly Gly Asn Asp Glu Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
Ser Thr Asn Asn Tyr Val Gly Arg Gln Thr Trp Val Phe Asp Pro Gln
20 25 30
Pro Pro Thr Pro Gln Glu Leu Ala Gln Val Gln Gln Ala Arg Leu Asn
35 40 45
Phe Tyr Asn Asn Arg Tyr His Val Lys Pro Ser Ser Asp Leu Leu Trp
50 55 60
Arg Phe Gln Phe Leu Arg Glu Lys Asn Phe Lys Gln Thr Ile Pro Gln
65 70 75 80
Ala Lys Ile Asn Glu Gly Glu Asp Ile Thr Tyr Glu Lys Ala Thr Thr
85 90 95
Ala Leu Arg Arg Ala Val His Phe Phe Ser Ala Leu Gln Ala Ser Asp
100 105 110
Gly His Trp Pro Ala Glu Asn Ala Gly Pro Leu Phe Phe Leu Pro Pro
115 120 125
Leu Val Met Cys Leu Tyr Ile Thr Gly His Leu Asp Thr Val Phe Pro
130 135 140
Ala Pro His Arg Leu Glu Ile Leu Arg Tyr Ile Tyr Cys His Gln Asn
145 150 155 160
Glu Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Ile Glu Gly His Ser Thr Met Phe
165 170 175
Cys Thr Val Leu Ser Tyr Ile Cys Met Arg Leu Leu Gly Glu Gly Pro
180 185 190
Asn Gly Gly Gln Asp Asn Ala Cys Ser Arg Ala Arg Lys Trp Ile Ile
195 200 205
Asp His Gly Gly Ala Thr Tyr Ile Pro Ser Trp Gly Lys Thr Trp Leu
210 215 220
Ser Ile Leu Gly Val Tyr Glu Trp Ser Gly Ser Asn Pro Met Pro Pro
225 230 235 240
Glu Phe Trp Ile Leu Pro Thr Phe Leu Pro Met His Pro Ala Lys Met
245 250 255
Trp Cys Tyr Cys Arg Met Val Tyr Met Pro Met Ser Tyr Leu Tyr Gly
260 265 270
Lys Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Leu Ile Leu Gln Leu Arg Gln
275 280 285
Glu Leu His Thr Gln Pro Tyr His His Ile Asn Trp Thr Lys Thr Arg
290 295 300
His Leu Cys Ala His Glu Asp Val Tyr Tyr Pro His Pro Leu Ile Gln
305 310 315 320
Asp Leu Met Trp Asp Ser Leu Tyr Ile Phe Thr Glu Pro Leu Leu Thr
325 330 335
Arg Trp Pro Phe Asn Lys Ile Ile Arg Lys Lys Ala Leu Glu Val Thr
340 345 350
Met Lys His Ile His Tyr Glu Asp Glu Asn Ser Arg Tyr Ile Thr Ile
355 360 365
Gly Cys Val Glu Lys Val Leu Cys Met Leu Ala Cys Trp Ala Glu Asp
370 375 380
Pro Asn Gly Val Pro Phe Lys Lys His Leu Ala Arg Ile Pro Asp Tyr
385 390 395 400
Met Trp Val Ala Glu Asp Gly Met Lys Met Gln Ser Phe Gly Ser Gln
405 410 415
Gln Trp Asp Thr Gly Phe Ala Ile Gln Ala Leu Leu Ala Ser Asn Leu
420 425 430
Thr Glu Glu Ile Gly Gln Val Leu Lys Lys Gly His Asp Phe Ile Lys
435 440 445
Lys Ser Gln Val Lys Glu Asn Pro Ser Gly Asp Phe Lys Ser Met His
450 455 460
Arg His Ile Ser Lys Gly Ser Trp Thr Phe Ser Asp Gln Asp His Gly
465 470 475 480
Trp Gln Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Gly Leu Lys Cys Cys Leu Leu
485 490 495
Phe Ser Met Met Pro Pro Glu Ile Val Gly Glu Lys Met Asp Ala Gln
500 505 510
His Leu Tyr Asn Ala Val Asn Ile Leu Ile Ser Leu Gln Ser Lys Asn
515 520 525
Gly Gly Leu Ala Ala Trp Glu Pro Ala Gly Ala Gln Gln Trp Leu Glu
530 535 540
Met Leu Asn Pro Thr Glu Phe Phe Ala Asp Ile Val Ile Glu His Glu
545 550 555 560
Tyr Val Glu Cys Thr Ala Ser Ala Ile His Ala Leu Ile Met Phe Lys
565 570 575
Lys Leu Tyr Pro Gly His Arg Lys Lys Glu Ile Glu Asn Phe Ile Thr
580 585 590
Asn Ala Val Lys Tyr Leu Glu Asp Val Gln Thr Ala Asp Gly Gly Trp
595 600 605
Tyr Gly Asn Trp Gly Val Cys Phe Thr Tyr Gly Thr Trp Phe Ala Val
610 615 620
Gly Gly Leu Ala Ala Ala Gly Lys Asn Tyr Asn Asn Cys Ala Ala Met
625 630 635 640
Arg Lys Ala Val Asp Phe Leu Leu Arg Thr Gln Lys Gln Asp Gly Gly
645 650 655
Trp Gly Glu Ser Tyr Leu Ser Cys Pro His Lys Lys Tyr Val Pro Leu
660 665 670
Glu Asp Asn Arg Ser Asn Leu Val His Thr Ser Trp Ala Leu Met Gly
675 680 685
Leu Ile Ser Ala Gly Gln Met Asp Arg Asp Pro Thr Pro Leu His Arg
690 695 700
Ala Ala Lys Leu Leu Ile Asn Ser Gln Leu Glu Asp Gly Asp Phe Pro
705 710 715 720
Gln Gln Glu Ile Thr Gly Val Phe Met Lys Asn Cys Met Leu His Tyr
725 730 735
Ala Ala Tyr Arg Asn Ile Tyr Pro Leu Trp Ala Leu Ala Glu Tyr Arg
740 745 750
Asn Arg Val Pro Leu Pro Ser Thr Thr Leu
755 760
<210> 6
<211> 763
<212> PRT
<213> 人参(Panax ginseng)
<400> 6
Met Trp Lys Leu Lys Ile Ala Glu Gly Asn Lys Asn Asp Pro Tyr Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Thr Asn Asn Phe Val Gly Arg Gln Thr Trp Glu Phe Asp Pro
20 25 30
Asp Tyr Val Ala Ser Pro Gly Glu Leu Glu Glu Val Glu Gln Val Arg
35 40 45
Arg Gln Phe Trp Asp Asn Arg Tyr Gln Val Lys Pro Ser Gly Asp Leu
50 55 60
Leu Trp Arg Met Gln Phe Leu Arg Glu Lys Asn Phe Arg Gln Thr Ile
65 70 75 80
Pro Gln Val Lys Val Gly Asp Asp Glu Ala Val Thr Tyr Glu Ala Ala
85 90 95
Thr Thr Thr Leu Arg Arg Ala Val His Phe Phe Ser Ala Leu Gln Ala
100 105 110
Ser Asp Gly His Trp Pro Ala Glu Asn Ser Gly Pro Leu Phe Phe Leu
115 120 125
Pro Pro Leu Val Met Cys Val Tyr Ile Thr Gly His Leu Asp Thr Val
130 135 140
Phe Pro Ala Glu His Arg Lys Glu Ile Leu Arg Tyr Ile Tyr Cys His
145 150 155 160
Gln Asn Glu Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Ile Glu Gly His Ser Thr
165 170 175
Met Phe Cys Thr Thr Leu Ser Tyr Ile Cys Met Arg Ile Leu Gly Glu
180 185 190
Gly Pro Asp Gly Gly Val Asn Asn Ala Cys Ala Arg Gly Arg Lys Trp
195 200 205
Ile Leu Asp His Gly Ser Val Thr Ala Ile Pro Ser Trp Gly Lys Thr
210 215 220
Trp Leu Ser Ile Leu Gly Val Tyr Glu Trp Ile Gly Ser Asn Pro Met
225 230 235 240
Pro Pro Glu Phe Trp Ile Leu Pro Ser Phe Leu Pro Met His Pro Ala
245 250 255
Lys Met Trp Cys Tyr Cys Arg Met Val Tyr Met Pro Met Ser Tyr Leu
260 265 270
Tyr Gly Lys Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Leu Ile Leu Gln Leu
275 280 285
Arg Glu Glu Leu Tyr Gly Gln Pro Tyr Asn Glu Ile Asn Trp Arg Lys
290 295 300
Thr Arg Arg Val Cys Ala Lys Glu Asp Ile Tyr Tyr Pro His Pro Leu
305 310 315 320
Ile Gln Asp Leu Leu Trp Asp Ser Leu Tyr Val Leu Thr Glu Pro Leu
325 330 335
Leu Thr Arg Trp Pro Phe Asn Lys Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gln Thr
340 345 350
Thr Met Lys His Ile His Tyr Glu Asp Glu Asn Ser Arg Tyr Ile Thr
355 360 365
Ile Gly Cys Val Glu Lys Val Leu Cys Met Leu Val Cys Trp Val Glu
370 375 380
Asp Pro Asn Gly Asp Tyr Phe Arg Lys His Leu Ala Arg Ile Pro Asp
385 390 395 400
Tyr Ile Trp Val Ala Glu Asp Gly Met Lys Met Gln Ser Phe Gly Ser
405 410 415
Gln Glu Trp Asp Thr Gly Phe Ser Ile Gln Ala Leu Leu Asp Ser Asp
420 425 430
Leu Thr His Glu Ile Gly Pro Thr Leu Met Lys Gly His Asp Phe Ile
435 440 445
Lys Lys Ser Gln Val Lys Asp Asn Pro Ser Gly Asp Phe Lys Ser Met
450 455 460
Tyr Arg His Ile Ser Lys Gly Ser Trp Thr Phe Ser Asp Gln Asp His
465 470 475 480
Gly Trp Gln Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Gly Leu Lys Cys Cys Leu
485 490 495
Ile Phe Ser Thr Met Pro Glu Glu Ile Val Gly Lys Lys Ile Lys Pro
500 505 510
Glu Arg Leu Tyr Asp Ser Val Asn Val Leu Leu Ser Leu Gln Arg Lys
515 520 525
Asn Gly Gly Leu Ser Ala Trp Glu Pro Ala Gly Ala Gln Glu Trp Leu
530 535 540
Glu Leu Leu Asn Pro Thr Glu Phe Phe Ala Asp Ile Val Ile Glu His
545 550 555 560
Glu Tyr Val Glu Cys Thr Ser Ser Ala Ile Gln Ala Leu Val Leu Phe
565 570 575
Lys Lys Leu Tyr Pro Gly His Arg Lys Lys Glu Ile Asp Asn Phe Ile
580 585 590
Thr Asn Ala Val Arg Tyr Leu Glu Asp Thr Gln Met Pro Asp Gly Ser
595 600 605
Trp Tyr Gly Asn Trp Gly Val Cys Phe Thr Tyr Gly Ser Trp Phe Ala
610 615 620
Leu Gly Gly Leu Ala Ala Ala Gly Lys Thr Tyr Tyr Asn Cys Ala Ala
625 630 635 640
Val Arg Lys Ala Val Glu Phe Leu Leu Lys Ser Gln Met Asp Asp Gly
645 650 655
Gly Trp Gly Glu Ser Tyr Leu Ser Cys Pro Lys Lys Val Tyr Val Pro
660 665 670
Leu Glu Gly Asn Arg Ser Asn Leu Val His Thr Gly Trp Ala Leu Met
675 680 685
Gly Leu Ile His Ser Glu Gln Ala Glu Arg Asp Pro Thr Pro Leu His
690 695 700
Arg Ala Ala Lys Leu Leu Ile Asn Ser Gln Met Glu Asp Gly Asp Phe
705 710 715 720
Pro Gln Gln Glu Ile Ser Gly Val Phe Met Lys Asn Cys Met Leu His
725 730 735
Tyr Ala Ala Tyr Arg Asn Ile Tyr Pro Leu Trp Ala Leu Ala Glu Tyr
740 745 750
Arg Arg Arg Val Pro Leu Pro Ser Leu Gly Thr
755 760
<210> 7
<211> 762
<212> PRT
<213> 油橄榄(Olea europaea)
<400> 7
Met Trp Lys Leu Lys Ile Ala Glu Gly His Gly Pro Tyr Leu Tyr Ser
1 5 10 15
Thr Asn Asn Phe Ala Gly Arg Gln Ile Trp Glu Tyr Asp Pro Asn Gly
20 25 30
Gly Thr Pro Glu Glu Arg Glu Ala Tyr Asp Lys Ala Arg Glu Glu Phe
35 40 45
Gln Arg Asn Arg Lys Leu Lys Gly Val His Pro Cys Gly Asp Leu Phe
50 55 60
Met Arg Ile Gln Leu Ile Lys Glu Ser Gly Ile Asp Leu Met Ser Ile
65 70 75 80
Pro Pro Val Arg Leu Gly Glu Lys Glu Glu Val Thr Tyr Glu Thr Ala
85 90 95
Thr Thr Ala Val Lys Lys Ala Leu Leu Leu Asn Arg Ala Val Gln Ala
100 105 110
Ser Asp Gly His Trp Pro Ala Glu Asn Ala Gly Pro Met Phe Phe Thr
115 120 125
Pro Pro Leu Ile Ile Val Leu Tyr Ile Ser Gly Ala Ile Asn Thr Ile
130 135 140
Leu Thr Ser Glu His Arg Lys Glu Met Val Arg Tyr Ile Tyr Asn His
145 150 155 160
Gln Asn Asp Asp Gly Gly Trp Gly Phe Tyr Ile Glu Gly His Ser Thr
165 170 175
Met Ile Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Ile Ala Leu Arg Leu Leu Gly Glu
180 185 190
Gly Pro Asp Asp Gly Asn Gly Ser Ile Ala Arg Ala Arg Lys Trp Ile
195 200 205
Leu Asp His Gly Gly Ala Thr Gly Ile Pro Ser Trp Gly Lys Thr Tyr
210 215 220
Leu Ser Val Leu Gly Val Tyr Asp Trp Asp Gly Cys Asn Pro Leu Pro
225 230 235 240
Pro Glu Phe Trp Leu Phe Pro Ser Phe Leu Pro Tyr His Pro Ala Lys
245 250 255
Met Trp Cys Tyr Cys Arg Thr Thr Tyr Met Pro Met Ser Tyr Leu Tyr
260 265 270
Gly Arg Lys Tyr His Gly Pro Leu Thr Asp Leu Val Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Asn Glu Ile His Ile Lys Pro Tyr Asn Glu Ile Asp Trp Asn Lys Ala
290 295 300
Arg His Asp Cys Cys Lys Glu Asp Leu Tyr Tyr Pro His Ser Ser Ile
305 310 315 320
Gln Asp Leu Leu Trp Asp Thr Leu Asn Tyr Cys Ala Glu Pro Val Met
325 330 335
Arg Arg Trp Pro Leu Asn Lys Ile Arg Gln Arg Ala Leu Asn Lys Thr
340 345 350
Ile Lys Tyr Met Arg Tyr Gly Ala Glu Glu Ser Arg Tyr Ile Thr Ile
355 360 365
Gly Cys Val Glu Lys Ser Leu Gln Met Met Cys Trp Trp Ala His Asp
370 375 380
Pro Asn Gly Asp Glu Phe Lys His His Leu Ala Arg Val Pro Asp Tyr
385 390 395 400
Leu Trp Leu Ala Glu Asp Gly Met Lys Met Gln Ser Phe Gly Ser Gln
405 410 415
Ile Trp Asp Ser Thr Leu Ala Thr Gln Ala Val Ile Ala Thr Gly Met
420 425 430
Val Glu Glu Tyr Gly Asp Cys Leu Lys Lys Ala His Phe Tyr Val Lys
435 440 445
Glu Ser Gln Ile Lys Glu Asn Pro Ala Gly Asp Phe Lys Ser Met Tyr
450 455 460
Arg His Phe Thr Lys Gly Ala Trp Thr Phe Ser Asp Gln Asp Gln Gly
465 470 475 480
Trp Val Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Ala Leu Lys Cys Leu Leu Leu
485 490 495
Leu Ser Gln Leu Pro Thr Glu Thr Ala Gly Glu Lys Ala Asp Val Glu
500 505 510
Arg Leu Tyr Glu Ala Val Asn Val Leu Leu Tyr Leu Gln Ser Pro Glu
515 520 525
Ser Gly Gly Phe Ala Ile Trp Glu Pro Pro Val Pro Gln Pro Tyr Leu
530 535 540
Gln Met Leu Asn Pro Ser Glu Ile Phe Ala Asp Ile Val Val Glu Thr
545 550 555 560
Glu His Val Glu Cys Ser Ala Ser Ile Ile Gln Ala Leu Leu Ala Phe
565 570 575
Lys Arg Leu Tyr Pro Gly His Arg Glu Lys Glu Ile Glu Ile Ser Val
580 585 590
Ala Lys Ala Ile Ser Phe Leu Glu Gly Arg Gln Trp Pro Asp Gly Ser
595 600 605
Trp Tyr Gly Tyr Trp Gly Ile Cys Phe Leu Tyr Gly Thr Phe Phe Val
610 615 620
Leu Gly Gly Leu Ser Ala Ala Gly Lys Thr Tyr Glu Asn Ser Glu Ala
625 630 635 640
Val Arg Lys Gly Val Asn Phe Leu Leu Ser Thr Gln Asn Glu Glu Gly
645 650 655
Gly Trp Gly Glu Cys Leu Glu Ser Cys Pro Ser Met Lys Tyr Thr Pro
660 665 670
Leu Glu Gly Asn Arg Thr Asn Leu Val Gln Thr Ser Trp Ala Met Leu
675 680 685
Gly Leu Met Tyr Gly Gly Gln Ala Glu Arg Asp Pro Thr Ser Leu His
690 695 700
Lys Ala Ala Lys Leu Leu Ile Asp Ala Gln Met Asp Asp Gly Asp Phe
705 710 715 720
Pro Gln Gln Glu Ile Thr Gly Val Tyr Met Lys Asn Cys Met Leu His
725 730 735
Tyr Ala Gln Tyr Arg Asn Ile Phe Pro Leu Trp Ala Leu Gly Glu Tyr
740 745 750
Arg Lys Arg Val Trp Ser Ser Gln Ser Leu
755 760
<210> 8
<211> 755
<212> PRT
<213> 百脉根(Lotus japonicus)
<400> 8
Met Trp Lys Leu Lys Val Ala Glu Gly Gly Lys Gly Leu Val Ser Val
1 5 10 15
Ser Asn Phe Ile Gly Arg Gln His Trp Val Phe Asp Pro Asn Ala Gly
20 25 30
Thr Pro Gln Glu His Glu Glu Ile Glu Arg Met Arg Gln Glu Phe Thr
35 40 45
Lys Asn Arg Phe Ser Ile Lys Gln Ser Ala Asp Leu Leu Met Arg Met
50 55 60
Gln Leu Arg Lys Glu Asn Pro Cys Gly Pro Ile Pro Pro Ala Val Lys
65 70 75 80
Leu Arg Asp Val Glu Lys Val Thr Ala Glu Ala Leu Ile Thr Thr Ile
85 90 95
Arg Arg Ser Ile Thr Phe Tyr Ser Ser Ile Gln Ala His Asp Gly His
100 105 110
Trp Pro Ala Glu Ser Ala Gly Pro Leu Phe Phe Val Gln Pro Leu Val
115 120 125
Met Ala Leu Tyr Ile Thr Gly Ser Leu Asp Asp Val Leu Gly Pro Gln
130 135 140
His Lys Lys Glu Ile Ile Arg Tyr Leu Tyr Asn His Gln Asn Glu Asp
145 150 155 160
Gly Gly Trp Gly Phe His Ile Glu Gly His Ser Thr Met Phe Gly Ser
165 170 175
Ala Leu Ser Tyr Ile Ala Leu Arg Val Leu Gly Gln Ser Leu Glu Asp
180 185 190
Gly Glu Asp Met Ala Val Ala Arg Gly Arg Lys Trp Ile Leu Asp His
195 200 205
Gly Gly Leu Val Ala Ile Pro Ser Trp Gly Lys Phe Trp Val Thr Val
210 215 220
Leu Gly Val Tyr Glu Trp Ser Gly Cys Asn Pro Leu Pro Pro Glu Phe
225 230 235 240
Trp Leu Leu Pro Lys Ile Phe Pro Ile His Pro Gly Lys Met Leu Cys
245 250 255
Tyr Cys Arg Leu Val Tyr Met Pro Met Ser Tyr Leu Tyr Gly Lys Lys
260 265 270
Phe Val Gly Pro Ile Thr Ala Leu Val Arg Ser Leu Arg Lys Glu Leu
275 280 285
Tyr Asn Glu Pro Tyr Asp Arg Val Asp Trp Asn Lys Ala Arg Asn Thr
290 295 300
Val Ala Lys Glu Asp Leu Tyr Tyr Pro His Pro Leu Ile Gln Asp Met
305 310 315 320
Leu Trp Gly Phe Leu His His Val Gly Glu Arg Val Leu Asn Thr Trp
325 330 335
Pro Phe Ser Met Leu Arg Gln Lys Ala Ile Glu Val Ala Ile Asn His
340 345 350
Val Arg Tyr Glu Asp Glu Thr Thr Arg Tyr Leu Cys Ile Gly Ser Val
355 360 365
Glu Lys Val Leu Tyr Leu Ile Ala Arg Trp Val Glu Asp Pro Asn Ser
370 375 380
Glu Ala Tyr Lys Leu His Leu Ala Arg Ile Pro Asp Tyr Phe Trp Leu
385 390 395 400
Ala Glu Asp Gly Leu Lys Ile Gln Ser Phe Gly Cys Gln Met Trp Asp
405 410 415
Ala Ala Phe Ala Ile Gln Ala Ile Leu Ser Gly Asn Val Ser Glu Glu
420 425 430
Tyr Gly Pro Thr Leu Lys Lys Ala His His Phe Val Lys Ala Ser Gln
435 440 445
Val Arg Glu Asn Pro Ser Gly Asp Phe Lys Ala Met Tyr Arg His Ile
450 455 460
Ser Lys Gly Ala Trp Thr Phe Ser Met His Asp His Gly Trp Gln Val
465 470 475 480
Ser Asp Cys Thr Ala Glu Gly Leu Lys Val Ala Leu Leu Leu Ser Glu
485 490 495
Met Ser Asp Asp Leu Val Gly Ala Lys Met Glu Thr Glu Gln Phe Tyr
500 505 510
Asp Ala Val Asn Val Ile Leu Ser Leu Gln Ser Ser Asn Gly Gly Phe
515 520 525
Pro Ala Trp Glu Pro Gln Arg Ala Tyr Gln Trp Leu Glu Lys Phe Asn
530 535 540
Pro Thr Glu Phe Phe Glu Glu Thr Leu Ile Glu Arg Glu Tyr Val Glu
545 550 555 560
Cys Thr Gly Ser Ala Met Gln Ala Leu Ala Leu Phe Arg Lys Leu Tyr
565 570 575
Pro Lys His Arg Arg Lys Glu Ile Asp Arg Cys Ile Ser Lys Ala Ile
580 585 590
Arg Tyr Ile Glu Asn Thr Gln Asn Pro Asp Gly Ser Trp Tyr Gly Cys
595 600 605
Trp Gly Ile Cys Tyr Thr Tyr Gly Thr Trp Phe Ala Val Glu Gly Leu
610 615 620
Thr Ala Cys Gly Lys Asn Phe Gln Asn Ser Val Thr Leu Arg Arg Ala
625 630 635 640
Cys Lys Phe Leu Leu Ser Lys Gln Leu Pro Asn Gly Gly Trp Gly Glu
645 650 655
Ser Tyr Leu Ser Ser Gln Asp Lys Val Tyr Thr Asn Ile Glu Gly Lys
660 665 670
Arg Ala Asn Leu Val Gln Ser Ser Trp Ala Leu Leu Ser Leu Met Arg
675 680 685
Ala Gly Gln Ala Glu Ile Asp Pro Thr Pro Ile His Arg Gly Ile Arg
690 695 700
Leu Leu Ile Asn Ser Gln Met Asp Asp Gly Asp Phe Pro Gln Gln Glu
705 710 715 720
Ile Thr Gly Val Phe Met Arg Asn Cys Thr Leu Asn Tyr Ser Ser Tyr
725 730 735
Arg Asn Ile Phe Pro Ile Trp Ala Leu Gly Glu Tyr Arg Arg Arg Val
740 745 750
Leu Cys Ala
755
<210> 9
<211> 758
<212> PRT
<213> 油橄榄(Olea europaea)
<400> 9
Met Trp Lys Leu Lys Ile Ala Asp Gly Thr Gly Pro Trp Leu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Asn Asn His Ile Gly Arg Gln His Trp Glu Phe Asp Pro Glu Ala
20 25 30
Gly Thr Pro Asp Glu Arg Val Glu Val Glu Arg Leu Arg Glu Glu Phe
35 40 45
Lys Lys Asn Arg Phe Arg Thr Lys Gln Ser Ala Asp Leu Leu Met Arg
50 55 60
Met Gln Leu Val Lys Glu Asn Gln Arg Val Gln Ile Pro Pro Ala Ile
65 70 75 80
Lys Ile Lys Glu Thr Glu Gly Ile Thr Glu Glu Ala Val Ile Thr Thr
85 90 95
Leu Arg Arg Ala Ile Ser Phe Tyr Ser Thr Ile Gln Ala His Asp Gly
100 105 110
His Trp Pro Ala Glu Ser Ala Gly Pro Leu Phe Phe Leu Pro Pro Leu
115 120 125
Val Leu Ala Leu Tyr Val Thr Gly Ala Ile Asn Val Val Leu Ser Arg
130 135 140
Glu His Gln Lys Glu Ile Thr Arg Tyr Ile Tyr Asn His Gln Asn Glu
145 150 155 160
Asp Gly Gly Trp Gly Ile His Ile Glu Gly His Ser Thr Met Phe Gly
165 170 175
Ser Val Leu Ser Tyr Ile Thr Leu Arg Leu Leu Gly Glu Gly Gln Glu
180 185 190
Asp Gly Glu Asp Lys Ala Val Ala Arg Gly Arg Lys Trp Ile Leu Asp
195 200 205
His Gly Gly Ala Val Gly Ile Pro Ser Trp Gly Lys Phe Trp Leu Thr
210 215 220
Val Leu Gly Val Tyr Glu Trp Asp Gly Cys Asn Pro Met Pro Pro Glu
225 230 235 240
Phe Trp Leu Leu Pro Asn Phe Ser Pro Ile His Pro Gly Lys Met Leu
245 250 255
Cys Tyr Cys Arg Leu Val Tyr Met Pro Met Ser Tyr Leu Tyr Gly Lys
260 265 270
Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Gly Leu Val Leu Ser Leu Arg Gln Glu
275 280 285
Ile Tyr Thr Glu Pro Tyr His Gly Ile Asn Trp Asn Arg Ala Arg Asn
290 295 300
Thr Cys Ala Lys Glu Asp Leu Tyr Tyr Pro His Pro Leu Ala Gln Asp
305 310 315 320
Met Leu Trp Gly Phe Leu His His Phe Ala Glu Pro Val Leu Thr Arg
325 330 335
Trp Pro Phe Ser Lys Leu Arg Glu Lys Ala Leu Lys Val Ala Met Glu
340 345 350
His Val His Tyr Glu Asp Met Asn Ser Arg Tyr Leu Cys Ile Gly Cys
355 360 365
Val Glu Lys Val Leu Cys Leu Ile Ala Cys Trp Val Glu Asp Pro Asn
370 375 380
Ser Glu Ala Tyr Lys Arg His Ile Ala Arg Ile Pro Asp Tyr Phe Trp
385 390 395 400
Val Ala Glu Asp Gly Leu Lys Met Gln Ser Phe Gly Cys Gln Met Trp
405 410 415
Asp Ala Ala Phe Ala Ile Gln Ala Ile Leu Ser Ser Asn Leu Ala Glu
420 425 430
Glu Tyr Gly Pro Thr Leu Met Lys Ala His Asn Phe Val Lys Ala Ser
435 440 445
Gln Val Gln Glu Asn Pro Ser Gly Asp Phe Asn Glu Met Tyr Arg His
450 455 460
Thr Ser Lys Gly Ala Trp Thr Phe Ser Met Gln Asp His Gly Trp Gln
465 470 475 480
Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Gly Leu Lys Ala Ala Leu Leu Phe Ser
485 490 495
Gln Met Pro Ile Glu Leu Val Gly Ala Glu Ile Glu Thr Gly His Leu
500 505 510
Tyr Asp Ala Val Asn Val Ile Leu Thr Leu Gln Ser Ala Ser Gly Gly
515 520 525
Phe Pro Ala Trp Glu Pro Gln Lys Ala Tyr Arg Trp Leu Glu Lys Leu
530 535 540
Asn Pro Thr Glu Phe Phe Glu Asp Val Leu Ile Glu Arg Asp Tyr Val
545 550 555 560
Glu Cys Thr Ser Ser Ala Val Gln Ala Leu Lys Leu Phe Lys Gln Leu
565 570 575
His Pro Gly His Arg Arg Lys Glu Ile Ala Ser Cys Ile Ser Lys Ala
580 585 590
Ile Gln Tyr Ile Glu Ala Thr Gln Asn Pro Asp Gly Ser Trp Asp Gly
595 600 605
Ser Trp Gly Ile Cys Phe Thr Tyr Gly Thr Trp Phe Ala Val Glu Gly
610 615 620
Leu Val Ala Cys Gly Lys Asn Tyr His Asn Ser Pro Thr Leu Arg Arg
625 630 635 640
Ala Cys Glu Phe Leu Leu Ser Lys Gln Leu Pro Asp Gly Gly Trp Ser
645 650 655
Glu Ser Tyr Leu Ser Ser Ser Asn Lys Val Tyr Thr Asn Leu Glu Gly
660 665 670
Asn Arg Ser Asn Leu Val Gln Thr Ser Trp Ala Leu Leu Ser Leu Ile
675 680 685
Lys Ala Gly Gln Val Glu Ile Asp Pro Gly Pro Ile His Arg Gly Ile
690 695 700
Lys Leu Leu Val Asn Ser Gln Met Glu Asp Gly Asp Phe Pro Gln Glu
705 710 715 720
Glu Ile Thr Gly Ala Phe Met Lys Asn Cys Thr Leu Asn Tyr Ser Ser
725 730 735
Tyr Arg Asn Ile Phe Pro Ile Trp Ala Leu Gly Glu Tyr Arg Arg Arg
740 745 750
Ile Leu His Ala Gln Thr
755
<210> 10
<211> 2280
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 10
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ctcctcatgc ggatgcagtt cgctaaagaa aactgtcaaa agctggacct tctcgctgtc 240
aagcgtggag agcacgaaga cgtcatgggg gaagctgtgt ggagctcttt gaaacgggcc 300
ataagccgcg tttgtaattt gcaggcacat gatggacact ggcccgggga ttatgcagga 360
cttatgttct ttttgcctgg cttgattata acattgcatg tcagtggagt tctgaacact 420
gttttatcat cggaacatca gaaggagatg cgccggtaca tctataatca ccagaatgaa 480
gatggagggt gggggttgca cattgagggc cacagcacca tgcttggctc atccctgaac 540
tatgttgctt tgagattgct tggggagggt ccaaatggtg gagatggatg catagagaat 600
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tggctctcgg tacttggagt atttgattgg tccggtaata acccagtgcc accagagtta 720
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gtgtttatac ccatgtctta catttatgga aaaaggtttg ttggcccagt aacaccagtt 840
gtgctagagc taagaagtga actatacaat gacccctatg atgagattga ctggaacaaa 900
gctcgtactc agtgtgcaaa ggaagatatg tactatccac gttcatccaa actggatatg 960
ttttggtcct ttctccacaa gtttattgaa ccagttttgt tgcgctggcc tgggagaaaa 1020
ctgagggaga aagctctggc cacttccatg aggaatgttc actatgaaga tgagtgcact 1080
cgatacatct gtttcggtgg tgtacccaag gcattaaata tccttgcttg ctggattgaa 1140
gatccaagct cagaggcatt caaatgccat attgcacgcg tatatgatta tttatggatc 1200
gctgaagacg gcatgaagat gcagatttac gatggcagcc aggtgtggga cgcaggtttg 1260
acagttgagg cccttgtggc tactgacctt gtcaaagagc ttggaccaac tcttaaacga 1320
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tctttgatga atgataatgg tggcttttca gcatttgaac tcgtaaggtc taatacatgg 1620
ctggagcata ttaatcctac agaggcattt gggcgtgtaa tgattgaata tccgtatgtc 1680
gaatgtacat catcatcaat tcagtgtcta gcattattca aaaaacttca cccagggcac 1740
cgcaaggaag aggtggaaaa ttgtatcagc aaaggtgcta atttcattga gagttctcag 1800
agaagcgatg gttcatggta tggttcttgg gggatttgtt tcacctatgc cacatggttt 1860
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tcatgtcatg acgaggttta cacaaatctt aaaggcaacc gacctcacgg tacgcacact 2040
gcgtgggcca tgattgcact aattgatgca gggcaggctg aaagagatcc agtgcctctg 2100
catcgagcag ccaaggcttt gctcaacttg caattagagg atggagaatt tccacagcaa 2160
gaaattgttg gagtctttct ccaaactgcc atgatcagtt attcccagta caggaacatc 2220
ttccctataa tggctctcac agggtatcgc cgccgagtac tgcttgcagg caacatatag 2280
<210> 11
<211> 2280
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 11
atgtggaggc tcaaggtgtc ggagggcggc agcccatggc tgcggtcggt aaacaatctc 60
ctcggccggc aagtgtggga gttcgaccct gacctcggca cgccagagga gcgcgccgat 120
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ctcctcatgc ggatgcagtt cgctaaagaa aactgtcaaa ggctggacct tctcgctgtc 240
aagcgtggag agcatgaaga cgtcatgggg gaagctgtgt ggagctcttt gaaacgggtc 300
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tggctctcgg tacttggagt atttgattgg tccggtaata acccagtgcc accagagtta 720
ttactattgc cgtatcaact gccatttcac ccaggtcgaa tgtcgtgcta tatccgaatg 780
gtgtatatac ccatgtctta cgtttatgga aaaaggtttg ttggcccaat aacaccagtt 840
gtgctagagc taagaagtga actatacaat gacccctatg atgagattga ctggaacaaa 900
gctcgtactc agtgtgcaaa ggaagatatg tactatccac gttcatccaa tctggatatg 960
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ctgagggaga aagctctggc cacttccatg aggaatgttc actatgaaga tgagtgcact 1080
cgatacatct gtttgggtgg tgtacccaag gcattaaata ctcttgcttg ctgggttgaa 1140
gatccaagct cagaggcatt caaatgccat attgcacgcg tatatgatta tttatggatc 1200
gctgaagacg gcatgaagat gcagatttac gatggcagcc aggtgtggga cgcaagtttc 1260
acagttgagg cccttgtggc tactgacctt gtcaaagagc ttggaccaac tcttaaacga 1320
gcgcattcct tccttaagaa ttcgcagttg cttgacaatt gcccccgaga tttcaaccgc 1380
tggtatcgcc atatatccaa aggtggatgg acatttacaa cagctgatga tggctggcaa 1440
gtttcagatt gcacggcgac agcactgaag gcatgtctat tgttatcaag gatatctcct 1500
gaaatcgttg gtgaaccact ggaaattgat gcacaataca atgctattaa ttgtctgatg 1560
tctttcatga atgataatgg tggcttttca gcatttgaac tcgtaaggtc taatacatgg 1620
ctggagcata ttaatcctac agaggcattt gggcgtgcaa tgattgaata tccgtatgtc 1680
gaatgtacat catcatcaat tcagtgtcta gcatttttca gaaaacttca cccagggcac 1740
cgcaaggaag aggtggaaaa ttgtatcagc aaaggtgcta atttcattga gaaatctcag 1800
agaagcgatg gttcatggta tggttcttgg ggggtttgtt tcacctatgc cacatggttt 1860
gcagtgacag gattagttgc tgcaggcagg acacttggga atagcgctac agttagaaag 1920
gcatgtgact ttctcttgtc aaaacagctt ccttcgggtg gctggggcga gagctatttg 1980
tcaagtcatg acgaggttta cacaaatctt aaaggcaacc gacctcatgg tacgcacact 2040
gcgtgggcca tgattgcact aattgatgca gggcaggctg aaagagatcc agtgcctctg 2100
catcgagcag ccaaggcttt gctcaacttg caattagagg atggagaatt tccacagcaa 2160
gaaattgttg gagtctttct ccaaactgcc atggccagtt attcccagtt caggaacatc 2220
ttccctataa tggctctcac aaggtatcgc cgccgagtac tgcttgaagg caacatatag 2280
<210> 12
<211> 2274
<212> DNA
<213> 燕麦(Avena strigosa)
<400> 12
atgtggaggc taacaatagg tgagggcggc ggtccgtggc tgaagtcgaa caatggcttc 60
cttggccgcc aagtgtggga gtacgacgcc gatgccggca cgccggaaga gcgtgccgag 120
gttgagaggg tgcgtgcgga attcacaaag aacaggttcc agaggaagga gtcacaggac 180
cttcttctac gcttgcagta cgcaaaagac aaccctcttc cggcgaatat tccgacagaa 240
gccaagcttg aaaagagtac agaggtcact cacgagacta tctacgaatc attgatgcga 300
gctttacatc aatattcctc tctacaagca gacgatgggc attggcctgg tgattacagt 360
gggattctct tcattatgcc tatcattata ttctctttat atgttactag atcacttgac 420
acctttttat ctccggaaca tcgtcatgag atatgtcgct acatttacaa tcaacagaat 480
gaagatggtg gttggggaaa aatggttctt ggcccaagta ccatgtttgg atcgtgtatg 540
aattatgcaa ccttaatgat tcttggcgag aagcgaaatg gtgatcataa ggatgcattg 600
gaaaaagggc gttcttggat tttatctcat ggaactgcaa ctgcaatacc acagtgggga 660
aaaatatggt tgtcgataat tggcgtttac gaatggtcag gaaacaatcc tattatacct 720
gaattgtggt tggttccaca ttttcttccg attcacccag gtcgtttttg gtgttttacc 780
cggttgatat acatgtcaat ggcatatctc tatggtaaga aatttgttgg gcctattagt 840
cctacaatat tagctctgcg acaagacctc tatagtatac cttactgcaa cattaattgg 900
gacaaggcgc gtgattattg tgcaaaggag gaccttcatt acccacgctc acgggcacaa 960
gatcttatat ctggttgcct aacgaaaatt gtggagccaa ttttgaattg gtggccagca 1020
aacaagctaa gagatagagc tttaactaac ctcatggagc atatccatta tgacgacgaa 1080
tcaaccaaat atgtgggcat ttgccctatt aacaaggcat tgaacatgat ttgttgttgg 1140
gtagaaaacc caaattcgcc tgaattccaa caacatcttc cacgattcca tgactatttg 1200
tggatggcgg aggatggaat gaaggcacag gtatatgatg gatgtcatag ctgggaacta 1260
gcgttcataa ttcatgccta ttgttccacg gatcttacta gcgagtttat cccgactcta 1320
aaaaaggcgc acgagttcat gaagaactca caggttcttt tcaaccaccc aaatcatgaa 1380
agctattatc gccacagatc aaaaggctca tggacccttt caagtgtaga taatggttgg 1440
tctgtatctg attgtactgc ggaagctgtt aaggcattgc tactattatc aaagatatcc 1500
gctgaccttg ttggcgatcc aataaaacaa gacaggttgt atgatgccat tgattgcatc 1560
ctatctttca tgaatacaga tggaacattt tctacctacg aatgcaaacg gacattcgct 1620
tggttagagg ttctcaaccc ttctgagagt tttcggaaca ttgtcgtgga ctatccatct 1680
gttgaatgca catcatctgt ggttgatgct ctcatattat ttaaagagac gaatccacga 1740
tatcgaagag cagagataga taaatgcatt gaagaagctg ttgtatttat tgagaacagt 1800
caaaataagg atggttcatg gtatggctca tggggtatat gtttcgcata tggatgcatg 1860
tttgcagtaa gggcgttggt tgctacagga aaaacctacg acaattgtgc ttctatcagg 1920
aaatcatgca aatttgtctt atcaaagcaa caaacaacag gtggatgggg tgaagactat 1980
ctttctagtg acaatgggga atatattgat agcggtaggc ctaatgctgt gaccacctca 2040
tgggcaatgt tggctttaat ttatgctgga caggttgaac gtgacccagt accactgtat 2100
aatgctgcaa gacagctaat gaatatgcag ctagaaacag gtgacttccc ccaacaggaa 2160
cacatgggtt gcttcaactc ctccttgaac ttcaactacg ccaactaccg caatctatac 2220
ccgattatgg ctcttgggga acttcgccgt cgacttcttg cgattaagag ctga 2274
<210> 13
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aatgtggagg ctgaaggtg 49
<210> 14
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta ctatatgttg cctgcaagc 49
<210> 15
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aatgtggagg ctcaaggtg 49
<210> 16
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta ctatatgttg ccttcaagc 49
<210> 17
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aatgtggagg ctaacaata 49
<210> 18
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta tcagctctta atcgcaaga 49
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atccgaatgt tctttatacc catgtcttac atttatggaa aaaggt 46
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgggtataaa gaacattcgg atatagctcg acattcgacc tgggtg 46
<210> 21
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atccgaatgt actttatacc catgtcttac atttatggaa aaaggt 46
<210> 22
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgggtataaa gtacattcgg atatagctcg acattcgacc tgggtg 46
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atccgaatgg cgtttatacc catgtcttac atttatggaa aaaggt 46
<210> 24
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgggtataaa cgccattcgg atatagctcg acattcgacc tgggtg 46
<210> 25
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atccgaatgc actttatacc catgtcttac atttatggaa aaaggt 46
<210> 26
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgggtataaa gtgcattcgg atatagctcg acattcgacc tgggtg 46
<210> 27
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atccgaatgc tgtttatacc catgtcttac atttatggaa aaaggt 46
<210> 28
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgggtataaa cagcattcgg atatagctcg acattcgacc tgggtg 46
<210> 29
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atccgaatgt ggtttatacc catgtcttac atttatggaa aaaggt 46
<210> 30
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgggtataaa ccacattcgg atatagctcg acattcgacc tgggtg 46
<210> 31
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atccgaatgg ggtttatacc catgtcttac atttatggaa aaaggt 46
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tgggtataaa ccccattcgg atatagctcg acattcgacc tgggtg 46
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atccgaatgc ggtttatacc catgtcttac atttatggaa aaaggt 46
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tcgagctatg cccgaatggt gtttataccc atgtcttaca tttatg 46
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caccattcgg gcatagctcg acattcgacc tgggtgaaac ggcag 45
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caccattcgc ccatagctcg acattcgacc tgggtgaaac ggcag 45
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gggtatatag aacattcgga tatagcacga cattcgacct gggtga 46
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gggtatatac cacattcgga tatagcacga cattcgacct gggtga 46
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aataactggc catggcagtt tggagaaaga ctccaacaat ttc 43

Claims (10)

1.一种改变2,3-氧化鲨烯环化酶的活性或功能的方法，其特征在于：所述方法包括：将2,3-氧化鲨烯环化酶的氨基酸序列中与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第261位氨基酸相对应的氨基酸替换成其它氨基酸；
所述2,3-氧化鲨烯环化酶的氨基酸序列中与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第257位氨基酸相对应的氨基酸为酪氨酸或苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述改变2,3-氧化鲨烯环化酶的活性或功能是指提高或降低所述2,3-氧化鲨烯环化酶的催化活性，或者改变所述2,3-氧化鲨烯环化酶的催化产物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述其它氨基酸选自丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸和色氨酸组成的组。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述2,3-氧化鲨烯环化酶来自植物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述2,3-氧化鲨烯环化酶为
来自水稻(Oryza sativa)的帕克醇合酶OsPS，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；或
来自水稻(Oryza sativa)的籼稻醇合酶OsOS，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或
来自燕麦(Avena strigosa)的β-香树素合酶AsbAS1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或
来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的β-香树素合酶AtLUP4，其氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示；或
来自绿玉树(Euphorbia tirucalli)的β-香树素合酶EtAS，其氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示；或
来自人参(Panax ginseng)的β-香树素合酶PgPNY1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或
来自油橄榄(Olea europaea)的α-香树素合酶OeOEA，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；或
来自百脉根(Lotus japonicus)的羽扇豆醇合酶LjOSC3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；或
来自油橄榄(Olea europaea)的羽扇豆醇合酶OeOEW，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OsPS，所述方法包括：将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第261位的缬氨酸替换成丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸；或
所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OsOS，所述方法包括：将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第261位的缬氨酸替换成苯丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸或酪氨酸；或
所述2,3-氧化鲨烯环化酶为AsbAS1，所述方法包括：将SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第263位的异亮氨酸替换成苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；或
所述2,3-氧化鲨烯环化酶为AtLUP4，所述方法包括：将SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的第264位的缬氨酸替换成苯丙氨酸或色氨酸；或
所述2,3-氧化鲨烯环化酶为EtAS，所述方法包括：将SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的第263位的缬氨酸替换成苯丙氨酸或色氨酸；或
所述2,3-氧化鲨烯环化酶为PgPNY1，所述方法包括：将SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的第265位的缬氨酸替换成苯丙氨酸或色氨酸；或
所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OeOEA，所述方法包括：将SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的第264位的苏氨酸替换成色氨酸；或
所述2,3-氧化鲨烯环化酶为LjOSC3，所述方法包括：将SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的第261位的缬氨酸替换成苯丙氨酸或色氨酸；或
所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OeOEW，所述方法包括：将SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的第262位的缬氨酸替换成苯丙氨酸或色氨酸。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OsPS，所述方法包括：将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第261位的缬氨酸替换成丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸；同时将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第732位的异亮氨酸替换为丙氨酸。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述2,3-氧化鲨烯环化酶的氨基酸替换包括如下步骤：以野生型2,3-氧化鲨烯环化酶的编码基因为模板，采用包含突变位点的引物进行PCR，获得包含突变位点的基因，构建基因表达载体，转化蛋白表达宿主，获得2,3-氧化鲨烯环化酶突变体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OsPS，采用SEQ ID NO:19和20、SEQ ID NO:21和22、SEQ IDNO:23和24、SEQ ID NO:25和26、SEQ ID NO:27和28、SEQ ID NO:29和30、SEQ ID NO:31和32、或SEQ ID NO:33和34所示的引物对进行PCR；或
所述2,3-氧化鲨烯环化酶为OsOS，采用SEQ ID NO:39和40、SEQ ID NO:41和42、SEQ IDNO:43和44、SEQ ID NO:45和46、SEQ ID NO:47和48、SEQ ID NO:49和50、或SEQ ID NO:51和52所示的引物对进行PCR；或
所述2,3-氧化鲨烯环化酶为AsbAS1，采用SEQ ID NO:53和54或SEQ ID NO:55和56所示的引物对进行PCR。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述PCR的反应体系为：5×Phusion HFbuffer 4μl，2mM dNTP mixture 2μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，DMSO 0.5μl，模板1μl，Phusion DNA聚合酶1μl，ddH2O 9.5μl；所述PCR的反应条件为：98℃30s；98℃10s，60℃30s，72℃6min，20个循环；72℃30min。
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