CN104388446A

CN104388446A - 邳半夏鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质与应用

Info

Publication number: CN104388446A
Application number: CN201410566830.0A
Authority: CN
Inventors: 曹小迎; 蒋继宏; 张文娟; 张盼盼; 陈集双
Original assignee: Jiangsu Normal University
Current assignee: Jiangsu Hanfang Fermentation Industry Research Institute Co ltd
Priority date: 2014-10-23
Filing date: 2014-10-23
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2034-10-23
Also published as: CN104388446B

Abstract

一种邳半夏鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质与应用，属于基因工程领域。所分离出的 DNA 分子包括：编码具有邳半夏 PtSQS 蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与 SEQIDNO.3 中从核苷酸第 127-1359 位的核苷酸序列有至少 70% 的同源性；或者所述的核苷酸序列能在 40 － 55 ℃条件下与 SEQIDNO.3 中从核苷酸第 127-1359 位的核苷酸序列杂交。本发明是一种鲨烯合酶，有助于提高邳半夏中具有抗癌活性的三萜类化合物的含量，对于保护人民的健康生长有所帮助。

Description

邳半夏鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在邳半夏中表达的PtSQS蛋白（邳半夏鲨烯合酶蛋白，Pinellia Ternata (Thunb.) Breit.squalene synthetase, PtSQS）及其核酸序列，是邳半夏鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质和应用。

背景技术

邳半夏（ Pinellia Ternata (Thunb.) Breit.）别名三叶半夏,三步跳,老鸹眼等.为天南星科，多年生草本植物，野生于山坡、溪边阴湿的草丛中或林下，叶子有长柄，初夏开黄绿色花。地下有白色小块茎，可入药。主治痰饮呕吐、湿痰咳嗽、消痞散结、眩晕、气逆等症。邳半夏中成分复杂，含有挥发性物质，三萜类化合物、及生物碱等多种活性物质，其中三萜类化合物抗肿瘤等活性已引起人们广泛关注。已有文献报道邳半夏中含有多种三萜类组分，并且这些组分都具有抗肿瘤活性。近代科学研究发现，药用植物中萜类，生物碱等次生代谢产物大部分是天然活性物质，是解决目前世界面临的西药毒副作用大，癌症、艾滋病等疑难疾病无法医治等难题的一条新途径。

然而作为次生代谢产物，其绝对含量又是很低的，这也成为次生代谢产物研究开发的最大障碍。近年来植物基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技术提高次生代谢产物或其前体的含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术将次生代谢产物生物合成途径中的关键酶基因（或转录因子）导入相应的宿主中，获得转基因的细胞系、组织或再生植株，并进行大规模的培养，是实现从根本上提高次生代谢产物含量的最佳途径。

鲨烯合酶（Squalene Synthase, SQS）催化两个分子的法尼基焦磷酸(FPP)生成鲨烯，第一步反应是两分子的FPP通过异戊烯基转移反应缩合成前鲨烯焦磷酸（PSQPP）,并释放出一分子无机二磷酸，在该过程中，其中一个FPP的C(1)-C(2)的双键作为另一个FPP的异戊烯基受体；第二步反应是PSQPP在NADPH作为供氢体的情况下，通过正碳离子重排转化为鲨烯，该反应发生在细胞中的光面内质网上，鲨烯合酶在三萜，甾醇的生物合成中起着关键的作用。由于鲨烯合酶催化的底物FPP处于异类戊二烯代谢途径中的分支点，因此，调控鲨烯合酶的活性能够直接影响甾醇、三萜类以及FPP为前提物的其他类异戊二烯化合物的生物合成。因此，利用现代生物技术将SQS基因导入邳半夏中，获得转基因的植物，并且进行大规模的栽培，是实现从根本上提高邳半夏三萜类活性化合物含量的最佳途径。

在对现有文献的分析中，“Plant and cell physiology（植物和细胞生理），2004，45（8）:976-984”和“Planta.（植物科学），2011，233:343-355”等报道了从人参和阿尔泰柴胡中克隆了鲨烯合酶基因，NCBI网站上公布了银杏，红豆杉等的鲨烯合酶基因的序列。但至今尚未有邳半夏SQS蛋白序列及其核酸序列的报道。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的邳半夏PtSQS蛋白序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种邳半夏PtSQS蛋白编码序列。使其包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织，所获得的转基因植物将具有显著提高的次生代谢产物含量。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有邳半夏PtSQS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第127-1359位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40－55℃条件下与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第127-1359位的核苷酸序列杂交。

较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO. 3中从核苷酸第127-1359位的核苷酸序列。

本发明分离出的邳半夏PtSQS蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO. 3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO. 3序列的多肽。

本发明所提供的载体DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

本发明用上述载体。在实例中该宿主细胞是烟草。

在本发明中，“分离的”、“纯化的” DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“邳半夏PtSQS蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有邳半夏PtSQS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3中第127-1359位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 3序列的编码框第127-1359位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 3中第127-1359位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第127-1359位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第127-1359位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的邳半夏PtSQS蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“邳半夏PtSQS蛋白或多肽”指具有邳半夏PtSQS蛋白活性的SEQ ID NO. 3序列的多肽。该术语还包括具有与天然邳半夏PtSQS蛋白相同功能的SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括邳半夏PtSQS蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的邳半夏PtSQS蛋白多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与邳半夏PtSQS蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用邳半夏PtSQS蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“邳半夏PtSQS蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO. 3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表 1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
			Asn (N)	Gln; His; Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
			Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
			Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro; Ala	Ala
			His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe	Leu
			Leu (L)	Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
			Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Leu
			Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
			Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
			Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala	Leu

表2

79% identity in 1057 nt overlap

Query 172 CCTCTGGTGCGGCTGAAGATGGCGGCCGCGCGGA-TC-GATAGGCAGATCCCCGCGGAGC 229

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Sbjct 190 CCTCTAGTGAAGCTGAAGATGGCGGC-GAG-GCACGCGGAGAAGCAGATTCCGCCTGAGC 247

Query 230 CCCACTGGGGCTTCTGCTACACCATGCTCGCCAAGGTGTCCCGCAGCTTCGCGCTCGTCA 289

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Sbjct 248 CACACTGGGCCTTCTGCTACACCATGCTCCACAAGGTCTCTCGAAGTTTCGGCCTCGTTA 307

Query 290 TCCAGCAGCTCGAATCCGATCTGCGTAACGCCGTGTGCATCTTTTATCTTGTTCTCAGAG 349

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Sbjct 308 TTCAGCAGCTCGGCACCGAGCTCCGCAACGCCGTATGCATTTTCTATTTGGTTCTTCGAG 367

Query 350 CACTTGACACTGTCGAGGATGATACAAGCATTCCTTCTGATGTCAAAGTACCTGTTCTGC 409

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Sbjct 368 CACTTGATACTGTTGAGGACGATACAAGCATAGCCACAGAGGTCAAAGTACCTATTCTAC 427

Query 410 AGTCTTTTCATCGACATGTGTACGACCCAAATTGGCATTTCGCATGTGGCACGAAGGAGT 469

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Sbjct 428 TGGCTTTTCATCATCATATATATGACCGTGACTGGCATTTTTCATGTGGTACAAGGGAGT 487

Query 470 ACAAGGTTCTGATGGATAAGTTTCATTTGGTTTCTACAGCCTTCCTAGAACTTGGCAAAA 529

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Sbjct 488 ACAAGGTTCTGATGGACGAGTTCCATCATGTTTCAACAGCGTTTTTGGAGCTTGGCAAAG 547

Query 530 GTTATCAAGAAGTAATTGAGGACATTACTCGGAGAATGGGAGCAGGAATGGCAAAGTTCA 589

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Sbjct 548 GTTATCAAGAAGCAATTGAGGATATTACCATGAGAATGGGTGCAGGAATGGCAAAGTTTA 607

Query 590 TTTGCAAGGAGGTTGAAACTGTAGAAGATTATGATGAATATTGCCACTATGTTGCTGGCC 649

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Sbjct 608 TTTGCAAGGAGGTAGAAACAATTGATGATTATGATGAATACTGTCACTATGTAGCCGGAC 667

Query 650 TTGTTGGATTGGGCCTGTCGTATCTCTTTCATGCTTCGGGGTCAGAAGACCTTGCATCTG 709

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Sbjct 668 TTGTCGGGCTGGGATTATCAAAGCTTTTCCATGCCTCTGGCTTGGAAGATTTGGCACCAG 727

Query 710 ATTCCCTCTCCAATTCCATGGGTTTGTTTCTTCAGAAAACAAATATCATTCGAGACTATC 769

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Sbjct 728 ATTCTCTGTCCAATTCTATGGGTTTATTTCTTCAGAAAACAAACATTATTCGAGACTATC 787

Query 770 TGGAAGATATAAATGAAGTACCAAAATCAAGAATGTTTTGGCCTCGGCAAATATGGAGCA 829

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Sbjct 788 TGGAAGATATAAATGAAATACCAAAGTCACGCATGTTTTGGCCTCGACAGATATGGAGTA 847

Query 830 AATATGCAGACAAGCTTGAGGACTTTAAATATGAAGAGAATTCAAAAAAGGCAGTAGAAT 889

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Sbjct 848 AATATGTTAACAAACTTGAGGACTTAAAATATGAGAAAAATTCAGTTAAATCAGTTCAAT 907

Query 890 GTCTGAATGACATGGTCACCAATGCCTTGATGCATGCAGAAGATTGCCTGAAGTATATGT 949

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Sbjct 908 GCTTAAACGACATGGTTACAAATGCCTTAATACATGTGGACGATTGCTTGAAATACATGT 967

Query 950 CCATTTTGCGTGATCCAATCATCTTTCGCTTTTGTGCTATCCCGCAGATCATGGCAATGG 1009

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Sbjct 968 CAGCTCTGCGAGATCCTGCCATCTTCCGATTCTGTGCAATTCCACAGATCATGGCAATTG 1027

Query 1010 CTACTCTAGCTTTGTGCTATAACAACCCTGAGGTGTTCAGAGGAGTGGTGAAGATGAGAC 1069

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Sbjct 1028 GAACCTTAGCTTTATGCTACAACAACATTGAAGTCTTCAGAGGTGTAGTAAAAATGAGGA 1087

Query 1070 GTGGTCTAACTGCTCAAATTATTGACCGTACAAGGAACATGTCCGATGTTTATTGTGATT 1129

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Sbjct 1088 GAGGTCTTACTGCTAAAGTTATTGACCAGACAAAAACCATTTCAGATGTCTATGGTGCTT 1147

Query 1130 TCTTTGATTTTTCTCACATGCTGAAAGCAAAGGTTGACAAGAATGATCCAAATGCGACCC 1189

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Sbjct 1148 TCTTCGATTTTTCTTGCATGCTGAAATCAAAGGTTGAAAAAAATGATCCCAATTCTACAA 1207

Query 1190 TGACTTTGGAGCGGG-TGGAAGCAATACAGAAAAGTTGCA 1228

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Sbjct 1208 AAACATTG-AGCAGGATAGAAGCAATTCAGAAAACTTGCA 1246

Query: 邳半夏PtSQS基因的核酸序列

Sbjct: 柿树DkSQS基因的核酸序列(FJ687954.1)

表2为本发明的邳半夏PtSQS与柿树(Diospyros Kaki) DkSQS基因的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。

表3

77% identity in 406 aa overlap, 87% similarity in 406 aa overlap

Query 1 MGSLGALLAHPEDLMPLVRLKMAAARIDRQIPAEPHWGFCYTMLAKVSRSFALVIQQLES 60

MGSLGA+L HP+D PL++LKMAA ++QIP EPHW FCYTML KVSRSFALVIQQL +

Sbjct 1 MGSLGAILKHPDDFYPLLKLKMAARNAEKQIPPEPHWAFCYTMLHKVSRSFALVIQQLGT 60

Query 61 DLRNAVCIFYLVLRALDTVEDDTSIPSDVKVPVLQSFHRHVYDPNWHFACGTKEYKVLMD 120

+LRNAVCIFYLVLRALDTVEDDTSI +DVKVP+L +FHRH+YD +WHF+CGTKEYKVLMD

Sbjct 61 ELRNAVCIFYLVLRALDTVEDDTSIETDVKVPILIAFHRHIYDRDWHFSCGTKEYKVLMD 120

Query 121 KFHLVSTAFLELGKSYQEVIEDITRRMGAGMAKFICKEVETVEDYDEYCHYVAGLVGLGL 180

+FH VSTAFLELGK+YQE IEDIT+RMGAGMAKFICKEVET++DYDEYCHYVAGLVGLGL

Sbjct 121 QFHHVSTAFLELGKNYQEAIEDITKRMGAGMAKFICKEVETIDDYDEYCHYVAGLVGLGL 180

Query 181 SYLFHASGSEDLASDSLSNSMGLFLQKTNIIRDYLEDINEVPKSRMFWPRQIWSKYADKL 240

S LFHASGSEDLA D LSNSMGLFLQKTNIIRDYLEDINE+PKSRMFWPRQIWS+Y +KL

Sbjct 181 SKLFHASGSEDLAPDDLSNSMGLFLQKTNIIRDYLEDINEIPKSRMFWPRQIWSEYVNKL 240

Query 241 EDFKYEENSKKAVECLNDMVTNALMHAEDCLKYMSILRDPIIFRFCAIPQIMAMATLALC 300

ED KYEENS KAV+CLNDMVTNALMHAEDCLKYM+ LRDP IFRFCAIPQIMA+ TLALC

Sbjct 241 EDLKYEENSVKAVQCLNDMVTNALMHAEDCLKYMAALRDPPIFRFCAIPQIMAIGTLALC 300

Query 301 YNNPEVFRGVVKMRRGLTAQIIDRTRNMSDVYCDFFDFSHMLKAKVDKNDPNATLTLERV 360

YNN EVFRGVVKMRRGLTA++IDRT+ M+DVY FFDF+ ML+ KVDKNDPNAT TL R+

Sbjct 301 YNNIEVFRGVVKMRRGLTAKVIDRTKTMADVYGAFFDFASMLEPKVDKNDPNATKTLSRL 360

Query 361 EAIQKSCINSGKPIRMTCYANDGKQRFKPLQITIVFLLLAILFAYL 406

EAIQK+C SG + Y + + + I I+ ++++I+FAYL

Sbjct 361 EAIQKTCRESGLLSKRKSYIVNDESGYGSTMIVILVIMVSIIFAYL 406

Query:邳半夏PtSQS氨基酸序列

Sbjct:大豆GmSQS的氨基酸序列(XP_006591920.1)

表3为本发明的邳半夏PtSQS蛋白的氨基酸序列与大豆(Glycine max)GmSQS的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

发明还包括邳半夏PtSQS蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然鲨烯合酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的邳半夏PtSQS蛋白多肽时，可以将邳半夏PtSQS蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成邳半夏PtSQS蛋白表达载体。

如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA; 如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列; 如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

还可用Northern印迹法技术分析邳半夏PtSQS蛋白基因产物的表达，即分析邳半夏PtSQS蛋白的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有邳半夏PtSQS蛋白核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码邳半夏PtSQS蛋白的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在邳半夏PtSQS蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于邳半夏PtSQS蛋白核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的邳半夏PtSQS蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选邳半夏PtSQS蛋白同源基因或同源蛋白。

为了得到与邳半夏PtSQS蛋白基因相关的邳半夏cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选邳半夏cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用 ³² P对邳半夏PtSQS蛋白的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自邳半夏的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech, Stratagene，Palo Alto, Cal.。这种筛选方法可以识别与邳半夏PtSQS蛋白的基因家族的核苷酸序列。

本发明的邳半夏PtSQS蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart 等人，(1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield J. (1963) J. Am Chem. Soc 85: 2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City, CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的邳半夏PtSQS蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与邳半夏SQS蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。本发明的邳半夏PtSQS蛋白基因可通过基因工程技术用来提高邳半夏中次生代谢产物或其前体的含量，而这些次生代谢产物在临床上具有巨大的应用价值，对保护人民的健康生长有所帮助。因而本发明具有很大的应用前景。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

邳半夏PtSQS蛋白基因的克隆

1．组织分离( isolation)

邳半夏来源于江苏徐州,带回江苏省药用植物生物技术重点实验室，采取材料后，立即置于液氮中冷冻保存。

．RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents, GIBCO BRL, USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

．基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据一些植物SQS的氨基酸保守序列,设计兼并引物,利用同源性基因克隆原理,采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分四个阶段进行：

(1) 中间保守区片段的扩增

PCR (SQScrF+ SQScrR) 得到SQScr(371bp)，其中，SQScrF序列为：5’-TAYTGYCAYTAYGTNGC-3’；SQScrR序列为：5’-ACYTGNGGDATNGCRCARAA-3’。回收，连接到pMD18-T载体上，用M13作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye, Perkin-Elmer, USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer, USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group, USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的柿树(Diospyros kaki)等的SQS基因的同源性很高，故初步认为它是一个SQS基因。

根据中间保守区片段结果，设计正向特异引物F2，经PCR (UPM+F2)得到PtF2'(1124bp) （过程同(1)），其中，F2序列为：5’-TATCTCTTTCATGCTTCGGGGTC AG-3’。回收，连接到pMD18-T载体上，用M13作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye, Perkin-Elmer, USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer, USA)上进行测序。

同样根据根据中间保守区片段结果，设计反向特异引物R2，经PCR (UPM+R2) 得到CpR2'(983bp) （过程同(1)），其中，R2序列为：5’- CAAAAGCGAAAGATGATTGGATC AC-3’。回收,连接到Pmd18-T载体上,用M13作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye, Perkin-Elmer, USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer, USA)上进行测序。

将5'RACE测序结果与3'RACE测序结果比序并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增PtSQS编码区(MF1+MR1)得到PtSQS编码区(1233bp)（过程同(1)）。其中，MF1序列为：5’- ATGGGGTCGCTGGGCGCGTTG-3’； MR1序列为： 5’-TTACCACCTCTTCAACAAAT-3’。

BLAST的结果证明从邳半夏中新得到的基因确为一个植物SQS基因。由于已知的人参鲨烯合酶具有催化两个法尼基焦磷酸生成鲨烯的功能（Lee,et al.,2004），故推测此新克隆的基因具有相同的功能。

通过组合使用上述四种方法，获得了候选的邳半夏PtSQS的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物PtSQSF1:5'- ACATGGGAAGGCTTCCATACAT-3'(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸PtSQSR1：5'- GCCAAAACGACACATAATTTAATG -3'(SEQ ID NO.2)为反向引物，以总RNA为模板, 进行RT-PCR扩增，PtSQSF1/PtSQSR1的PCR条件为94°C 3分钟，随之以94°C 30秒、60°C 1分钟和72°C 2分钟进行35个循环，最后以72°C延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1763bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序,获得SEQ ID NO. 3所示的序列。

实施例2

邳半夏PtSQS蛋白基因的序列信息与同源性分析

本发明新的邳半夏PtSQS蛋白全长cDNA的长度为1763bp,详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于127-1359位核苷酸。根据全长cDNA推导出邳半夏PtSQS蛋白的氨基酸序列，共410个氨基酸残基，分子量47099.83，pI为6.56。详细序列见SEQ ID NO. 4。

将邳半夏PtSQS蛋白的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank +EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations +PDB+ SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与柿树鲨烯合酶基因(FJ687954.1) 在核苷酸水平上具有较高的同源性（附表2）；在氨基酸水平上，它与大豆鲨烯合酶基因(GenBank Accession No. XP_006591920.1 )有77%的相同性和87%的相似性(见表3)。由此可见，邳半夏PtSQS蛋白与柿树和大豆鲨烯合酶蛋白无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为邳半夏PtSQS蛋白在功能上也相似。

实施例 3

邳半夏PtSQS蛋白在大肠杆菌中进行原核表达及提纯

在该实施例中，将全长的邳半夏PtSQS蛋白编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

将邳半夏PtSQS蛋白多肽以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。

原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌

根据邳半夏PtSQS蛋白的氨基酸序列，设计蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将邳半夏PtSQS蛋白基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl ₂ 方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-鲨烯合酶基因表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-鲨烯合酶基因。

表达Trx-PtSQS重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-PtSQS工程菌于3mL含100 mg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100 mg/mL 氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD ₆₀₀ 达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37 ℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1mL菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50 mL，蒸馏水45mL，二巯基乙醇5mL)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12%SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-PtSQS融合蛋白的工程菌。

融合蛋白的提取纯化Trx-PtSQS

按上述方法诱导表达Trx-PtSQS融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-PtSQS，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家（Novagen）的说明书以BugBuster试剂和Benzonase 核酸酶来纯化包涵体。包涵体可用溶解缓冲液(50mM CAPS, pH 11.0,0.3% N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mM Tris-HCl,pH8.5 )来透析。然后用组氨酸结合（HisBind）树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl pH 7.9 )洗脱来收集Trx-PtSQS融合蛋白。融合蛋白经肠激酶20℃酶切16小时后即可分离获得邳半夏PtSQS的表达蛋白。

纯化的鲨烯合酶的活力测定

取经Ni2+-琼脂糖柱纯化的重组鲨烯合酶蛋白10g，加入500μl反应体系（50mmol/L磷酸盐缓冲液pH7.2，含50μmol/L FPP, 25mmol/L MgCl2, 25mmol/L巯基乙醇，5mmol/L NADPH)，上覆200μl正己烷，37℃反应5小时，充分涡旋振荡后1000r/min离心，取上层正己烷抽提物GC-MS检测反应产物。GC-MS分析条件为：120℃ 3min, 15℃/min升至180℃,25℃/min升至260℃，保持25min；进样口温度为260℃，离子源温度230℃，GC-MS仪器为岛津GC-MS-QP2010,色谱柱为DB-5ms(30m×0.25mm)。经测定，催化产物单一，质谱图与鲨烯标准品质谱图相似度高，认定催化产物为鲨烯，从而认定克隆所得到的邳半夏PtSQS基因全长cDNA所编码蛋白具有鲨烯合酶的功能。

实施例 4

邳半夏PtSQS蛋白在烟草中进行真核细胞表达

含目的基因（邳半夏PtSQS蛋白基因）的表达载体的构建,根据邳半夏PtSQS蛋白的全长序列(SEQ ID NO. 3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将邳半夏PtSQS蛋白基因 cDNA克隆至中间载体（如pBluescript），进一步克隆到双元表达载体（如pBI121和pCAMBIA1301），在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。

利用叶盘法转化烟草

1. 用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落,接种于2mL YEB 液体(Sm+, Kan+),28°C ,200rpm振荡培养24-36小时;

2. 室温下4,000g离心10min;

3. 弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD ₆₀₀ =0.5左右；

4. 取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；

5. 将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；

6. 把经侵染的叶片放于MS培养基上，28°C暗培养48小时；

7. 将叶片转到愈伤培养基（MS＋6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb 250mg/L）上，25-28°C光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；

8. 约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；

9. 等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

利用Northern blotting 检测PtSQS蛋白在转基因烟草植株中的表达

1.RNA的提取：待转基因烟草叶片长到2-3片叶时抽取烟草叶的RNA。以正常生长的植株作为对照（条件同上），利用TRIzol 试剂盒 (GIBCO BRL, USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节（Sambrook等，1989）。

的定量：参考《分子克隆》（Sambrook等，1989），分光光度计测OD ₂₆₀ ; RNA含量计算：1 OD ₂₆₀ = 40mg/mL。

总RNA琼脂糖凝胶电泳分离：1）取6mL 25×（倍）电泳缓冲液，加入117mL无菌水，混匀。2）称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55°C水浴中。3）于通风橱中取26.8mL甲醛，加入到55°C的凝胶溶液中，混匀。4）迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5）将提取的RNA（20mg）溶解于RNA变性溶液中，在65°C下加热10分钟，然后立即放在冰上。6）在样品中加入2uL 10×上样缓冲液，混匀。7）在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。

尼龙膜上转移：1）转移之前，将尼龙膜用10×SSC浸泡。2）将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2×SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3）滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4）转移后，将膜于80°C烘烤2小时。

膜上杂交信号的检出：1）将膜浸在5×Dendart’s, 0.1%SDS，0.1mg/mL鲑鱼精DNA]，65°C下预杂交2小时。2）将用Gene Images ^TM Contents CDP-Star ^TM labelling module标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入1）的杂交液中，于65°C杂交16-24小时。3）取出膜，置于洗膜液I（1×SSC，1%SDS）中，于65°C漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II（0.1×SSC，1%SDS）中于65°C漂洗3次，每次15分钟。4）用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影（方法参照Roche DIG labeled 试剂盒说明书）。Northern杂交表明:转基因烟草的PtSQS转录水平比未转基因的对照材料的表达水平明显高得多。

含邳半夏鲨烯合酶(PtSQS)的转基因烟草植株中的PtSQS蛋白活性测定

1. 蛋白的提取：a）取500mg叶片，加入1000uL 1×PBS (KH ₂ PO ₄ 0.2 g/L, Na ₂ HPO ₄ 1.15 g/L, KCl 0.2 g/L, NaCl 8 g/L) 于50mL eppondorf管中研磨；b）13000rpm, 4°C离心10分钟；c）取上清，备用。注：以上过程于冰上进行。

蛋白的定量：参考Bradford法（Bradford，1976）。取2uL蛋白样品，加入1mL Bradford试剂，混匀后，分光光度计测OD ₅₉₅ ; 蛋白含量计算：1 OD ₅₉₅ = 28.57mg。

蛋白活性测定测定详细操作过程同实例3。结果表明，转基因烟草植株的中的PtSQS蛋白酶活性比没有转基因的对照明显高得多（P<0.05）。从而再次证明所克隆的邳半夏鲨烯合酶基因表达的蛋白的确具有催化两个法尼基焦磷酸生成鲨烯的活性，将可用于利用转基因技术来提高植物的次生代谢产物的研究和产业化中。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO. 1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：22bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii).分子类型：寡核苷酸

(iii).序列描述：SEQ ID NO. 1

ACATGGGAAGGCTTCCATACAT

(2)SEQ ID NO. 2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：24bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO. 2

GCCAAAACGACACATAATTTAATG

(3)SEQ ID NO. 3的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1793bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO. 3

(4)SEQ ID NO. 4的信息

(i)序列特征：

(A)长度：410氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii).分子类型：多肽

(iii).序列描述：SEQ ID NO. 4

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏师范大学

<120> 邳半夏鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质和应用

<130> 11

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1793

<212> DNA

<213> Pinellia Ternata

<220>

<221> CDS

<222> (127)..(1359)

<400> 1

acatgggaag gcttccatac atccccccgc cttttcctct ctctctctct ctctctcttt 60

ctctctgttt ggagttcgtg gtctcgcttg gcgactgcag cggcggagga aggggaggcg 120

gcggcg atg ggg tcg ctg ggc gcg ttg ctg gcg cac ccg gag gac ctg 168

Met Gly Ser Leu Gly Ala Leu Leu Ala His Pro Glu Asp Leu

1 5 10

atg cct ctg gtg cgg ctg aag atg gcg gcc gcg cgg atc gat agg cag 216

Met Pro Leu Val Arg Leu Lys Met Ala Ala Ala Arg Ile Asp Arg Gln

15 20 25 30

atc ccc gcg gag ccc cac tgg ggc ttc tgc tac acc atg ctc gcc aag 264

Ile Pro Ala Glu Pro His Trp Gly Phe Cys Tyr Thr Met Leu Ala Lys

35 40 45

gtg tcc cgc agc ttc gcg ctc gtc atc cag cag ctc gaa tcc gat ctg 312

Val Ser Arg Ser Phe Ala Leu Val Ile Gln Gln Leu Glu Ser Asp Leu

50 55 60

cgt aac gcc gtg tgc atc ttt tat ctt gtt ctc aga gca ctt gac act 360

Arg Asn Ala Val Cys Ile Phe Tyr Leu Val Leu Arg Ala Leu Asp Thr

65 70 75

gtc gag gat gat aca agc att cct tct gat gtc aaa gta cct gtt ctg 408

Val Glu Asp Asp Thr Ser Ile Pro Ser Asp Val Lys Val Pro Val Leu

80 85 90

cag tct ttt cat cga cat gtg tac gac cca aat tgg cat ttc gca tgt 456

Gln Ser Phe His Arg His Val Tyr Asp Pro Asn Trp His Phe Ala Cys

95 100 105 110

ggc acg aag gag tac aag gtt ctg atg gat aag ttt cat ttg gtt tct 504

Gly Thr Lys Glu Tyr Lys Val Leu Met Asp Lys Phe His Leu Val Ser

115 120 125

aca gcc ttc cta gaa ctt ggc aaa agt tat caa gaa gta att gag gac 552

Thr Ala Phe Leu Glu Leu Gly Lys Ser Tyr Gln Glu Val Ile Glu Asp

130 135 140

att act cgg aga atg gga gca gga atg gca aag ttc att tgc aag gag 600

Ile Thr Arg Arg Met Gly Ala Gly Met Ala Lys Phe Ile Cys Lys Glu

145 150 155

gtt gaa act gta gaa gat tat gat gaa tat tgc cac tat gtt gct ggc 648

Val Glu Thr Val Glu Asp Tyr Asp Glu Tyr Cys His Tyr Val Ala Gly

160 165 170

ctt gtt gga ttg ggc ctg tcg tat ctc ttt cat gct tcg ggg tca gaa 696

Leu Val Gly Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Phe His Ala Ser Gly Ser Glu

175 180 185 190

gac ctt gca tct gat tcc ctc tcc aat tcc atg ggt ttg ttt ctt cag 744

Asp Leu Ala Ser Asp Ser Leu Ser Asn Ser Met Gly Leu Phe Leu Gln

195 200 205

aaa aca aat atc att cga gac tat ctg gaa gat ata aat gaa gta cca 792

Lys Thr Asn Ile Ile Arg Asp Tyr Leu Glu Asp Ile Asn Glu Val Pro

210 215 220

aaa tca aga atg ttt tgg cct cgg caa ata tgg agc aaa tat gca gac 840

Lys Ser Arg Met Phe Trp Pro Arg Gln Ile Trp Ser Lys Tyr Ala Asp

225 230 235

aag ctt gag gac ttt aaa tat gaa gag aat tca aaa aag gca gta gaa 888

Lys Leu Glu Asp Phe Lys Tyr Glu Glu Asn Ser Lys Lys Ala Val Glu

240 245 250

tgt ctg aat gac atg gtc acc aat gcc ttg atg cat gca gaa gat tgc 936

Cys Leu Asn Asp Met Val Thr Asn Ala Leu Met His Ala Glu Asp Cys

255 260 265 270

ctg aag tat atg tcc att ttg cgt gat cca atc atc ttt cgc ttt tgt 984

Leu Lys Tyr Met Ser Ile Leu Arg Asp Pro Ile Ile Phe Arg Phe Cys

275 280 285

gct atc ccg cag atc atg gca atg gct act cta gct ttg tgc tat aac 1032

Ala Ile Pro Gln Ile Met Ala Met Ala Thr Leu Ala Leu Cys Tyr Asn

290 295 300

aac cct gag gtg ttc aga gga gtg gtg aag atg aga cgt ggt cta act 1080

Asn Pro Glu Val Phe Arg Gly Val Val Lys Met Arg Arg Gly Leu Thr

305 310 315

gct caa att att gac cgt aca agg aac atg tcc gat gtt tat tgt gat 1128

Ala Gln Ile Ile Asp Arg Thr Arg Asn Met Ser Asp Val Tyr Cys Asp

320 325 330

ttc ttt gat ttt tct cac atg ctg aaa gca aag gtt gac aag aat gat 1176

Phe Phe Asp Phe Ser His Met Leu Lys Ala Lys Val Asp Lys Asn Asp

335 340 345 350

cca aat gcg acc ctg act ttg gag cgg gtg gaa gca ata cag aaa agt 1224

Pro Asn Ala Thr Leu Thr Leu Glu Arg Val Glu Ala Ile Gln Lys Ser

355 360 365

tgc att aac tct ggg aag cca atc aga atg acc tgt tat gcg aat gat 1272

Cys Ile Asn Ser Gly Lys Pro Ile Arg Met Thr Cys Tyr Ala Asn Asp

370 375 380

ggc aag caa agg ttc aag cca ctg cag ata acc atc gtt ttt ctt ctg 1320

Gly Lys Gln Arg Phe Lys Pro Leu Gln Ile Thr Ile Val Phe Leu Leu

385 390 395

ctt gct att ctg ttc gct tat ttg ttg aag agg tgg taa tctgaggagg 1369

Leu Ala Ile Leu Phe Ala Tyr Leu Leu Lys Arg Trp

400 405 410

aatcaacgtt gcaatgtttt gtgctctaaa gcgcgatcca atttaaaaat atctcaggcc 1429

ctaagttgat ggtgtacagt tgcagactgg taagagaagc tctcatcatc tactcatgga 1489

actgtactaa aatgcataat agtgtggatt tggacgatga ttcatggagg acccttggca 1549

ttcgtttatg cacactcaca ctgtatccaa gggctatatt tacctcccgc gcatattaac 1609

attgggtatt tttgcacgtc tgatgcatcc attgtttgga gtgcaagttc ctttaacgtt 1669

cttcttgttg gtttttcttt ttggtctatg aacgttatgt atttgttgta aatgcattgg 1729

ctatttattt gattaaatta tgtgtcgttt tggcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1789

aaaa 1793

<210> 2

<211> 410

<212> PRT

<213> Pinellia Ternata

<400> 2

Met Gly Ser Leu Gly Ala Leu Leu Ala His Pro Glu Asp Leu Met Pro

1 5 10 15

Leu Val Arg Leu Lys Met Ala Ala Ala Arg Ile Asp Arg Gln Ile Pro

20 25 30

Ala Glu Pro His Trp Gly Phe Cys Tyr Thr Met Leu Ala Lys Val Ser

35 40 45

Arg Ser Phe Ala Leu Val Ile Gln Gln Leu Glu Ser Asp Leu Arg Asn

50 55 60

Ala Val Cys Ile Phe Tyr Leu Val Leu Arg Ala Leu Asp Thr Val Glu

65 70 75 80

Asp Asp Thr Ser Ile Pro Ser Asp Val Lys Val Pro Val Leu Gln Ser

85 90 95

Phe His Arg His Val Tyr Asp Pro Asn Trp His Phe Ala Cys Gly Thr

100 105 110

Lys Glu Tyr Lys Val Leu Met Asp Lys Phe His Leu Val Ser Thr Ala

115 120 125

Phe Leu Glu Leu Gly Lys Ser Tyr Gln Glu Val Ile Glu Asp Ile Thr

130 135 140

Arg Arg Met Gly Ala Gly Met Ala Lys Phe Ile Cys Lys Glu Val Glu

145 150 155 160

Thr Val Glu Asp Tyr Asp Glu Tyr Cys His Tyr Val Ala Gly Leu Val

165 170 175

Gly Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Phe His Ala Ser Gly Ser Glu Asp Leu

180 185 190

Ala Ser Asp Ser Leu Ser Asn Ser Met Gly Leu Phe Leu Gln Lys Thr

195 200 205

Asn Ile Ile Arg Asp Tyr Leu Glu Asp Ile Asn Glu Val Pro Lys Ser

210 215 220

Arg Met Phe Trp Pro Arg Gln Ile Trp Ser Lys Tyr Ala Asp Lys Leu

225 230 235 240

Glu Asp Phe Lys Tyr Glu Glu Asn Ser Lys Lys Ala Val Glu Cys Leu

245 250 255

Asn Asp Met Val Thr Asn Ala Leu Met His Ala Glu Asp Cys Leu Lys

260 265 270

Tyr Met Ser Ile Leu Arg Asp Pro Ile Ile Phe Arg Phe Cys Ala Ile

275 280 285

Pro Gln Ile Met Ala Met Ala Thr Leu Ala Leu Cys Tyr Asn Asn Pro

290 295 300

Glu Val Phe Arg Gly Val Val Lys Met Arg Arg Gly Leu Thr Ala Gln

305 310 315 320

Ile Ile Asp Arg Thr Arg Asn Met Ser Asp Val Tyr Cys Asp Phe Phe

325 330 335

Asp Phe Ser His Met Leu Lys Ala Lys Val Asp Lys Asn Asp Pro Asn

340 345 350

Ala Thr Leu Thr Leu Glu Arg Val Glu Ala Ile Gln Lys Ser Cys Ile

355 360 365

Asn Ser Gly Lys Pro Ile Arg Met Thr Cys Tyr Ala Asn Asp Gly Lys

370 375 380

Gln Arg Phe Lys Pro Leu Gln Ile Thr Ile Val Phe Leu Leu Leu Ala

385 390 395 400

Ile Leu Phe Ala Tyr Leu Leu Lys Arg Trp

405 410

Claims

1.一种邳半夏鲨烯合酶基因，其特征在于：所述基因由SEQ ID NO.1中第127-1359位的核苷酸序列所构成。

2.一种邳半夏鲨烯合酶，其特征在于：所述酶由SEQ ID NO.2中第1-410位的氨基酸序列所构成。

3.一种含有权利要求1所述的邳半夏鲨烯合酶基因的完整编码阅读框序列的质粒。

4.一种含有权利要求1所述的邳半夏鲨烯合酶基因的完整编码阅读框序列的植物表达载体。

5.一种用权利要求1所述的邳半夏鲨烯合酶基因转化获得的转基因植物。