CN101736019B - 麻疯树香叶基香叶基焦磷酸合成酶蛋白及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体涉及一种在麻疯树中表达的JcGGPPs蛋白(麻疯树香叶基香叶基焦磷酸合成酶蛋白，Jatropha curcasgeranylgeranyl diphosphate synthase，JcGGPPs)及其及其编码基因。所分离出的DNA分子包括：编码具有麻疯树麻疯树香叶基香叶基焦磷酸合成酶活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第39-1148位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第39-1148位的核苷酸序列杂交。本发明是一种催化苯甲酰CoA和去苯甲酰紫杉醇生成紫杉醇的酶，对保护人民的健康生长有所帮助。

Description

麻疯树香叶基香叶基焦磷酸合成酶蛋白及其编码基因

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在麻疯树中表达的JcGGPPs蛋白(麻疯树香叶基香叶基焦磷酸合成酶蛋白，Jatrophacurcas gerany lgeranyl diphosphate synthase，JcGGPPs)及其核酸序列。

背景技术

麻疯树是一种多用途的植物，常被用在医药、农药、生物柴油、饲料、染料、肥料、水土保持、生态治理等方面，有可持续综合利用的开发潜力。麻疯树毒素—佛波醇脂(12-脱氧-16-羟基佛波醇酯，12-deoxy-16-hydroxyphorbol)是一种二萜类化合物，主要存在于植物种子、树皮、叶、根和乳汁中。研究报道，麻疯树种子油中的佛波醇酯具有双重作用：一方面对癌细胞有促长作用，称为促癌剂，是剧毒植物毒素，可激发肿瘤和炎症；另一方面其还具有抗虫性和抗软体动物的活性。当前麻疯树种子油作为生物燃油的研究、开发和应用以及最大限度地发挥其经济效益和取得良好的生态环境效益一其副产物的合理利用已成为生物能源研究的热点。但由于麻疯树种仁中含有以佛波醇酯为代表的毒素，一方面麻疯树种子油中会有佛波醇酯(脂溶性)的残留，另一方面麻疯树种仁榨油后的籽粕，只能将其用作肥料还田，使得这一对家畜有潜在利用价值的植物性蛋白饲料被大量浪费。因此由于麻疯树毒素的存在限制了麻疯树油的开发和麻疯树的综合利用。近年来植物基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技术调节麻疯树毒素或其前体的含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术一方面可采用RNA干扰技术将佛波醇酯生物合成途径中的关键酶基因(或转录因子)导入麻疯树中，获得转基因的细胞系、组织或再生植株，以达到借助基因工程手段培育低毒麻疯树优良品种，另一方面可采用转基因植物过量表达技术，将佛波醇酯生物合成途径中的关键酶基因(或转录因子)导入麻疯树中，获得转基因的细胞系、组织或再生植株，以达到借助基因工程手段培育高毒麻疯树优良品种。

现有技术公开了香叶基香叶基焦磷酸合成酶(GGPP synthase)是一种能够催化法尼基焦磷酸(FPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)发生电子耦化作用的戊烯基转运酶。其能将15碳的FPP和5碳的IPP缩合生成20碳的香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)，香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)是所有二萜类化合物的共同前体。佛波醇酯的二萜骨架是由通用的二萜前体GGPP环化而来，因此GGPP为佛波醇酯的合成提供了通用前体。

现有技术(“Biochim.Biophys.Acta(生物化学与生物物理学报)2003，1625(2)：214-220“和“Chem.Pharm.Bull(化学药理学报)2001，49(2)：197-202”等)先后报道从三叶橡胶树和巴豆中克隆了香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因，由于这个基因编码的酶催化二萜合成的第一步，并对二萜合成效率具有重要影响，因此，这第一步是基因工程遗传改良麻疯树的重要切入点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种麻疯树JcGGPPs蛋白编码序列。

本发明的JcGGPPs蛋白编码序列包含所说基因的保守片断的构建体，携带该构建体的新的RNA干扰载体，被所说的RNA干扰载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织，所获得的转基因植物将具有降低的佛波醇酯含量；或，包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织，所获得的转基因植物将具有显著提高的佛波醇酯含量。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有麻疯树JcGGPPs活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第39-1148位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第39-1148位的核苷酸序列杂交。

较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第39-1148位的核苷酸序列。

本发明分离出的麻疯树JcGGPPs多肽，它包括：具有SEQ ID NO.4氨基酸序 列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

本发明所提供的载体DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

本发明用上述载体，在实例中该宿主细胞是麻疯树。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“麻疯树JcGGPPs(或多肽)的编码基因”指编码具有麻疯树JcGGPPs活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第39-1148位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第39-1148位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第39-1148位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第39-1148位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第39-1148位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的麻疯树JcGGPPs相同功能的蛋白的SEQ IDNO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“麻疯树JcGGPPs或多肽”指具有麻疯树JcGGPPs活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然麻疯树JcGGPPs相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳 地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括麻疯树JcGGPPs的活性片段和活性衍生物。

本发明的麻疯树JcGGPPs多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与麻疯树JcGGPPsDNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用麻疯树JcGGPPs多肽的血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“麻疯树JcGGPPs保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

 

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala (A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg (R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn (N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
			Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
			Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro；Ala	Ala
			His (H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile (I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu (L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys (K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met (M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe (F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro (P)	Ala	Ala

[0020]

Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

表2为本发明的麻疯树JcGGPP蛋白与三叶橡胶HbGGPP蛋白的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。

表2

79％identity in 386nt overlap

Query  533 CAATGATGATCTTCGACGGGGAAAACCTACAAATCATAAAATGTTCGGCGAAGAAACTGC  592

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Sbjct  1   CAACGATGATCTTCGACGAGGCAAACCCACAAACCATAAGATGTTCGGCGAAGAAACTGC  60

Query  593 GATCCTTGCCGGAGATGCAATGCTTTCTTTAGCATTCGAGCACATAGCTAG-AGCAACCA  651

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Sbjct  61  CATTCTGGCCGGCGATGCTCTCCTCTCATTCTCCTTTGAACATGTAGCT-GCAGCAACCA  119

Query  652 AGAATGTTTCGCCGGAGCGAGTGGTTCGAGTCATAACTGAGCTTGGATCGGCTGTTGG-G  710

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Sbjct  120 AGAACGTTTCACCTGACCGAGTGGTTAGAGCCATTGCTGAGCTTGGTTCAGCAGTTGGAG  179

Query  711 TCAGAAGGACTTGTTGCAGGTCAAATTGTCGACGTTTG-CAGTGAGGGGAAAGAGGTAAA  769

            ||| ||| || || ||||| |||||||| |||  |||  || ||||||||| | || ||

Sbjct  180 -CAGCAGGGCTAGTGGCAGGCCAAATTGTAGAC-ATTGAAAGCGAGGGGAAACAAGT-AA  236

Query  770 CGTGA-AAGATTTAGAGTATATCCATATTC-ATAAAACTG-CAAAGCTTTTAGAAGCAGC  826

           | | | | || |||||||||||||| | || | || || | | |||||||||||||||||

Sbjct  237 CTTTAGAGGACTTAGAGTATATCCACA-TCAACAAGAC-GTCGAAGCTTTTAGAAGCAGC  294

Query  827 AGTTGTTTGCGGAGCCATAGCAGGCGGAGCCGATGATGAGAGCATC-GAAAGAGTGAGAA  885

           |||||||||||| || |||   || || || |||||||| |||| | |||||||| ||||

Sbjct  295 AGTTGTTTGCGGGGCGATAATTGGAGGGGCAGATGATGAAAGCA-CAGAAAGAGTTAGAA  353

Query  886 AATATGCAAGGTGTATAGGATTATTA 911

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Sbjct  354 AATATGCGAGGTGTATAGGGTTGTTA 379

Query：麻疯树JcGGPPs蛋白的核酸序列”；

Sbjct：三叶橡胶HbGGPPs蛋白的核酸序列(GenBank Accession No.AB041631)

表3为本发明的麻疯树JcGGPPs与番茄SlGGPPs蛋白氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

表3

62％identity in 377aa overlap，77％similarity in 377aa overlap

Query  1  MAFSATAPACNNILFKKSTFNGLKNRPELP------FNHLKFHFRMKMTTTTVQVVSDSS  54

          MAF AT    +N+    +  N      +LP      F H K H             SD +

Sbjct  1  MAFLATISGLDNLFLSNTPNNNFAFSRKLPPSQSYSFLHKKIH------------ASDVA  48

Query  55 PVTQPLETTQESLSF-SPKILLPNFPFEEYMVLKANNVNEALDKAVPLNHPLKIHAAMRY  113

             Q  +  +  +S  +K +LP F F+EYMV KA  VN+ALD+A+P+   P+K+H AMRY

Sbjct  49 NSFQTFQVKERDVSSKAEKFILPEFEFQEYMVTKAIKVNKALDEAIPMQEPIKVHEAMRY  108

Query  114 SLLAGGKRVRPILCIAACELVGGDEAAAMPSACAMEMIHTMSLIHDDLPCMDNDDLRRGK 173

           SLLAGGKRVRPILC+A+CE+VGGDE+ A+P+ACA+EMIHTMSL+HDDLPCMDNDDLRRGK

Sbjct  109 SLLAGGKRVRPILCMASCEVVGGDESLAIPAACAVEMIHTMSLVHDDLPCMDNDDLRRGK 168

Query  174 PTNHKMFGEETAILAGDAMLSLAFEHIARATKNVSPERVVRVITELGSAVGSEGLVAGQI 233

           PTNHK+FGE TA+LAGDA+LSLAFEH+A  T+NV P+RVV+ I ELGSAVGSEGLVAGQI

Sbjct  169 PTNHKIFGENTAVLAGDALLSLAFEHVATKTQNVPPQRVVQAIGELGSAVGSEGLVAGQI 228

Query  234 VDVCSEGKEVNVKDLEYIHIHKTAKLLEAAVVCGAIAGGADDESIERVRKYARCIGLLFQ 293

           VD+ SEGK+V++ +LEYIH HKT+KLLEAAVVCGAI GG ++  +ER+R YARCIGLLFQ

Sbjct  229 VDLASEGKQVSLTELEYIHHHKTSKLLEAAVVCGAIMGGGNEVDVERMRSYARCIGLLFQ 288

Query  294 VIDDILDVTKSSEELGKTAGKDLVSDKATYPKLLGIDEARKLAAKLVDEANQELAYFDSA 353

           V+DDILDVTKSS+ELGKTAGKDL++DKATYPKL+G+++AR+ A +L+ +A  EL+YFD A

Sbjct  289 VVDDILDVTKSSDELGKTAGKDLITDKATYPKLMGLEKARQYAGELMAKAMNELSYFDYA 348

Query  354 KAAPLYHFANYIASRQN  370

           KAAPLYH A+YIA+RQN

Sbjct  349 KAAPLYHIASYIANRQN 365

Query：麻疯树JcGGPPS蛋白氨基酸序列

Sbjct：番茄SlGGPPS蛋白氨基酸序列(GenBank Accession No.ABB82554)

本发明还包括麻疯树JcGGPPs或多肽的类似物。这些类似物与天然JcGGPPs多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨 基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的麻疯树JcGGPPs多肽时，可以将麻疯树JcGGPPs的编码基因的核酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成麻疯树JcGGPPs表达载体。

如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、麻疯树细胞和其它植物细胞。

还可用Northern印迹法技术分析麻疯树JcGGPPs基因产物的表达，即分析麻疯树JcGGPPs的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有麻疯树JcGGPPs核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码麻疯树JcGGPPs的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在麻疯树JcGGPPs核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于麻疯树JcGGPPs核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的麻疯树JcGGPPs核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选麻疯树JcGGPPs同源基因或同源蛋白。

为了得到与麻疯树JcGGPPs基因相关的麻疯树cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选麻疯树cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用³²P对麻疯树JcGGPPs的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自麻疯树的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与麻疯树JcGGPPs的基因家族的核苷酸序列。

本发明的麻疯树JcGGPPs核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的麻疯树JcGGPPs，通过各种常规筛选方法，可筛选出与麻疯树JcGGPPs发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。本发明催化法尼基焦磷酸(FPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)生成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的酶，在抗性试验中具有明显的作用，对保护人民的健康生长有所帮助。因此，具有很大的应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

麻疯树JcGGPPs基因的克隆

1.组织分离(isolation)

麻疯树种子来源于四川省攀枝花地区，麻疯树种子采集后，放在实验室保存。

2.RNA的分离(RNA isolation)

将麻疯树种子的种皮剥掉，取出种仁，用研钵研碎，加入液氮后，研磨成粉后，取100mg移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(两步裂解法)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据一些植物GGPP的氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，采用SMART^TMRACE cDNA扩增方法(Clontech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分四个阶段进行：

(1)核心序列的克隆

PCR(GGPPF+GGPPR)得到JcGGPP-1(510bp)，回收，连接到pMD-18T载体上，用M13F或M13R作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(GeneBank+EMBL)，知其核苷酸序列及编码蛋白与已知的木本植物如三叶橡胶树(Hevea brasiliensis)等的GGPP基因的同源性很高，故初步认为它是一个GGPP基因。

(2)3’-RACE

根据核心序列扩增的结果，设计两个正向特异引物(JcggppF1和JcggppF2)。采用二次PCR扩增方法进行。第一次PCR(JcggppF1+AP)得到PCR产物，稀释100倍后，用其做模板，进行第二次PCR(JcggppF2+AP)，得到JcGGPP-2(523bp)， 回收，连接，测序过程同(1))。

(3)5’-RACE

根据核心序列的扩增的结果，设计两个反向特异引物(JcggppR1和JcggppR2)。采用二次PCR扩增方法进行。第一次PCR(JcggppR1+UPM)得到PCR产物，稀释100倍后，用其做模板，进行第二次PCR(JcggppR2+NUP)，得到JcGGPP-3(722bp)，回收，连接，测序(过程同(1))。

(4)编码序列的克隆

将核心序列、5’RACE与3’RACE测序结果序列比对并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行Jc-ggpp编码区(Jcggppfull-F+Jcggppfull-R)PCR扩增，得到JcGGPPs编码区(1110bp)(过程同(1))。

BLAST的结果证明从麻疯树中新得到的基因确为一个植物GGPP基因。由于已知的岩蔷薇(Cistus creticus)的CcGGPPs具有催化法尼基焦磷酸(FPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)生成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的酶的功能(Pateraki andKanellis Montamat，2008)，故推测此新克隆的基因具有相同的功能。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的麻疯树JcGGPPs蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物Jcggppfull-F5’-AAGTATCAAGAATTCAAAACCCATTGT-3’(SEQ ID NO.3)为正向引物，Jcggppfull-R5’-GTGATATATATCCATCCCATCTTAGTA-3’(SEQ ID NO.4)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃1分钟、58℃1分钟和72℃2分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1397bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.1所示的序列。

实施例2

麻疯树JcGGPPs基因的序列信息与同源性分析

本发明新的麻疯树JcGGPPs全长cDNA的长度为1414bp，详细序列见SEQ IDNO.1，其中开放读框位于39-1148位核苷酸。根据全长cDNA推导出麻疯树JcGGPPs的氨基酸序列，共370个氨基酸残基，分子量40371.12，pI为6.03。详细序列见SEQ ID NO.2。

将麻疯树JcGGPPs的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与三叶橡胶HbGGPPs蛋白的核酸序列(AB041631)在核苷酸水平上具有79％的同源性(附表2)；在氨基酸水平上，它与番茄SlGGPPs基因(ABB82554)有62％的相同性和77％的相似性(见表3)。由此可见，麻疯树JcGGPPs与植物的GGPPs无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为麻疯树JcGGPPs在催化法尼基焦磷酸(FPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)生成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的反应上也具有相似的功能。

实施例3

麻疯树JcGGPPs在大肠杆菌中进行功能验证

在该实施例中，将全长的麻疯树JcGGPPs编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以鉴定JcGGPPs的活性。

麻疯树JcGGPPs原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌

根据麻疯树JcGGPPs的氨基酸序列，设计蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pBluescript II KS-vector载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将麻疯树JcGGPPs基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pBluescript II KS-vector(Stratahene)。鉴定好的表达载体利用CaCl₂方法转入大肠杆菌DH10B(该菌带有pACCAR25ΔcrtE质粒，质粒上带有来源于噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)合成类胡萝卜素的ctr基因簇，但缺失该种中的ctrE即GGPP基因)，筛选鉴定得到含有JcGGPPs表达载体的工程菌DH10B-JcGGPP。

结果观察

在生长大肠杆菌的平板上，没有转入JcGGPPs基因的大肠杆菌DH10B在平板上生长的颜色为白色，转入了JcGGPPs基因的大肠杆菌DH10B在平板上生长的颜色为黄色，说明在转入了JcGGPPs基因的转化平板上有类胡萝卜素的生成，进一步说明JcGGPPs能代替噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)中的ctrE基因，促进类胡萝卜素的生成。使用来源于小鼠和拟南芥的GGPP基因做对照，转入麻疯树JcGGPPs基因 的菌的颜色比转入小鼠和拟南芥的GGPP基因的菌的颜色深，说明麻疯树JcGGPPs基因具有较高的活性。

实施例4

麻疯树JcGGPPs在大肠杆菌中的表达、纯化和活性分析

在该实施例中，将全长的麻疯树JcGGPPs蛋白编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白，用以鉴定重组蛋白具有GGPP合成酶的活性。

将麻疯树JcGGPPs蛋白多肽以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。

原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌：根据麻疯树JcGGPPs蛋白的氨基酸序列，设计蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pQE30载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将麻疯树JcGGPPs蛋白基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pQE30载体(QIAGEN)。鉴定好的表达载体利用CaCl₂方法转入大肠杆菌M15，筛选鉴定得到含有pQE30-JcGGPPs表达载体的工程菌M15-pQE30-JJcGGPPs。

表达JcGGPPs重组蛋白(rJcGGPPs)的工程菌的分离鉴定：挑取单菌落的M15-pQE30-JCHMGR工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)中培养约3小时，至OD₆₀₀达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，4小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清液中加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达JcGGPPs融合蛋白的工程菌。

rJcGGPPs融合蛋白的提取纯化：按上述方法诱导表达JcGGPPs融合表达蛋白的工程菌M15-pQE30-JcGGPPs，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(QIAGEN)的说明书用组氨酸结合(His·Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)洗脱来收集M15-pQE30-JcGGPPs融合蛋白。

纯化的麻疯树香叶基香叶基焦磷酸合成酶的活力测定：按Kainou等(Biochim. Biophys.Acta1999，1437：333-340)的方法对表达纯化的香叶基香叶基焦磷酸合成酶蛋白进行酶活力的测定，研究其对香叶基香叶基焦磷酸生成的影响。测定的反应体系包括：1.0mM的MgCl₂，0.1％(w/v)的Triton X-100，50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)，10μM的[1-¹⁴C]IPP(异戊烯基焦磷酸)(活性为0.92TBq/mol)，5μM的法尼基焦磷酸(FPP)，200μg酶的样品(浓度0.2mg/ml)。反应流程如下：样品混合后，放在30℃条件下培养120分钟，反应产物，如香叶基香叶基焦磷酸，用丁醇饱和水溶液提取，用酸性磷酸酶水解。水解产物用正己烷提取，用反向薄层层析进行分析(丙酮/水＝19:1，v/v)。用图像分析仪BAS1500-Mac(Fuji FilmCo.)分析样品的活性。实验中设计了一个平行对照。结果表明，表达的蛋白的确具有催化异戊烯基焦磷酸(IPP)和法尼基焦磷酸(FPP)生成香叶基香叶基焦磷酸的酶活性。

实施例5

麻疯树JcGGPPs基因在麻疯树中进行过量表达

1.含目的基因(麻疯树JcGGPPs蛋白基因)的表达载体的构建

根据麻疯树JcGGPPs蛋白的全长序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将麻疯树JcGGPPs蛋白基因cDNA克隆至中间载体(如pMD18T)，进一步克隆到双元表达载体(如p CAMBIA1304或改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化麻疯树。

2.利用农杆菌介导的转化技术转化麻疯树

1)用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2ml YEB液体(Sm⁺，Kan⁺)，28℃，200rpm振荡培养24-36小时；

2)室温下4,000g离心10min；

3)弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD₆₀₀＝0.5左右；

4)取生长一个月左右的麻疯树的无菌外植体，将其剪成约1平方厘米见方的小片 或小段；

5)将步骤(4)的小片或小段放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；

6)把经浸染的小片或小段放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；

7)将小片或小段转到愈伤组织培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L⁺cb250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；

8)约40天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，10天左右生根；

9)等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

3.利用GUS染色和PCR扩增的方法检测麻疯树转基因阳性植株

取一小片叶片放入GUS染液(配置方法：①x-gluc：用N，N-二甲基甲酰胺配成20mM的储存液，分装成每管100ul，保存于—20℃；②底物溶液：1mM x-gluc于100mM磷酸钠缓冲液(pH7)含10-100mM EDTA，1-5mM铁氰化钾，1-5mM亚铁氰化钾，0.1％Tritron X-100；③使用时，将x-gluc用底物溶液稀释20倍)，37℃反应过夜，75％乙醇脱绿后检测。

待芽生根并长至约6cm时，移栽到装有1:1:1的泥炭土、蛭石和珍珠岩混合物小型的塑料花盆中自然生长，同时取叶片提取DNA，PCR鉴定阳性，将鉴定为阴性的苗丢弃，阳性苗继续培养。

4.利用Northern blotting检测JcGGPPs基因在转基因麻疯树植株中的表达

1)RNA的提取：待转基因麻疯树叶片长到2-3片叶时抽取麻疯树叶的RNA。以正常生长的植株作为对照(条件同上)，利用TRIzol试剂盒(GIBCO BRL，USA)提取RNA。

2)RNA的定量：参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD₂₆₀；RNA含量计算：1OD₂₆₀＝40μg/ml。

3)总RNA琼脂糖凝胶电泳分离：①取6ml25(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。②称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。③于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。④迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。⑤将提取的RNA(20μg) 溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。⑥在样品中加入2ul10×上样缓冲液，混匀。⑦在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。

4)RNA尼龙膜上转移：①转移之前，将尼龙膜用10×SSC浸泡。②将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2×SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。③滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。④转移后，将膜于80℃烘烤2小时。

5)膜上杂交信号的检出：①将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA，65℃下预杂交2小时。②将用Gene Images^TMContents CDP-Star^TMlabelling module标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入(1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。③取出膜，置于洗膜液I(1×SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1×SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。④用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明；转基因麻疯树的JcGGPPs转录水平比未转基因的对照材料的表达水平明显高得多。

5.转基因麻疯树中佛波醇酯含量的测定

对转基因的麻疯树植株中的佛波醇酯含量可通过下列步骤测定：

1)麻疯树种子油的提取。将转基因麻疯树的种子加液氮研磨成细粉后，加入石油醚，超声波振荡1h。3000r/min下，离心10min，取上清液，50℃左右恒温水浴加热至肉眼可见其中的籽油沉积于管底。剩余的沉淀部分再加石油醚，超声波振荡1h，同样条件下离心，取上清液与上一步骤的溶液混合，继续恒温加热直至管中的石油醚差不多挥发完全。剩余的溶液即为种子油。

2)麻疯树毒素(佛波醇酯)的分离和提取。取一定量的麻疯树种子油，加入制备好的硅胶柱，石油醚和二氯甲烷洗涤后，用甲醇进行洗脱液后真空浓缩，分离步骤采用薄层层析(TLC)进行检测(使用加热的硫酸香兰素作为展开剂)。

3)麻疯树毒素(佛波醇酯)的含量测定。使用高效液相法进行含量的测定。麻疯树毒素(佛波醇酯)的含量应比对照(非转基因植株)高。

实施例6

麻疯树JcGGPPs基因在麻疯树中进行RNA干扰

1.含目的基因(麻疯树JcGGPPs蛋白基因)的RNA干扰载体的构建

根据麻疯树JcGGPPs蛋白的全长序列(SEQ ID NO.1)(属于正义片段)，设计一对引物，PCR扩增后得到互补的反义片段，将正义片断和反义片断分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)并连上载体pHANNIBAL形成茎环结构，然后通过双酶切将茎环结构的片断连入pCAMBIA1301载体，构建成RNA干扰载体，再将其转入农杆菌中，利用农杆菌介导的转化技术转化麻疯树。(pHANNIBAL载体含有在大肠杆菌中复制的复制起点、CaMV35S启动子，OCS终止子、PDK内含子以及一些多克隆位点，并在其它的某些位置含有相应的酶切位点(Helliwell andWaterhouse，2003)。

2.利用农杆菌介导的转化技术转化麻疯树

方法同实施例4中的2利用农杆菌介导的转化技术转化麻疯树。

3.利用GUS染色和PCR扩增的方法检测麻疯树转基因阳性植株

方法同实施例4中的3利用GUS染色和PCR扩增的方法检测麻疯树转基因阳性植株。

4.利用Northern blotting检测JcGGPPs基因在转基因麻疯树植株中的表达

方法同实施例4中的4利用Northern blotting检测JcGGPPs基因在转基因麻疯树植株中的表达。

5.转基因麻疯树中佛波醇酯含量的测定

方法同实施例4中的5转基因麻疯树中佛波醇酯含量的测定。麻疯树毒素(佛波醇酯)的含量应比对照(非转基因植株)低。

序列表

<110>复旦大学

<120>麻疯树香叶基香叶基焦磷酸合成酶蛋白及其编码基因

<160>4

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>1414

<212>DNA

<213>麻疯树(Jatropha curcas)

<220>

<221>CDS

<222>(39)..(1148)

<223>

<400>1

<210>2

<211>370

<212>PRT

<213>麻疯树(Jatropha curcas)

<400>2

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>麻疯树(Jartropha curcas)

<400>3

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>麻疯树(Jatropha curcas)

<400>4

Claims (2)

1.一种编码麻疯树香叶基香叶基焦磷酸合成酶蛋白的核酸，其特征在于该核酸序列是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列第39-1148位的核苷酸序列。

2.一种麻疯树香叶基香叶基焦磷酸合成酶蛋白，其特征在于该蛋白的序列是SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。