CN101544984A - 粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列 - Google Patents

Abstract

一种粘毛黄芩黄烷酮3－羟化酶蛋白编码序列，属于基因工程领域。编码具有黄烷酮3－羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列由SEQ ID NO.3中从核苷酸第74－1123位的核苷酸序列或其简并序列构成，所述的序列编码具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。本发明对提高粘毛黄芩植物体中黄芩苷等黄酮类化合物含量具有明显的作用，本发明具有很大的应用价值。

Description

粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列

技术领域

本发明涉及的是一种蛋白编码序列，特别是一种粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列，属于基因工程领域。

背景技术

粘毛黄芩属于唇形科黄芩属多年生药用草本植物。该属植物约300多种，世界广布，我国有100种以上，可作为黄芩药用者约有7种左右，粘毛黄芩就是其中的一种。该植物主要药用成分为黄芩苷，现代药理学证实其具有清热解毒、止血安胎、抗菌消炎、保肝利胆、降压脱敏、防晒美白等作用。随着国际上对黄芩苷等研究的持续升温和认识的逐步深入，认为黄芩苷在清除氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、调节免疫、促进细胞凋亡以及抗肿瘤和HIV等多方面均有作用(Hwang，et al，2005)，具有重要的药用价值和开发利用前景。然而目前获得粘毛黄芩的主要技术是人工栽培，但存在生产周期长、成活率低、农药残留超标和有效成分较低等弊端，使得该方式商业前景尚不明朗。因而，寻找新的药源十分必要。植物次生代谢途径分子生物生物学的飞速发展和植物生物技术的日趋成熟，使得利用基因工程获得粘毛黄芩中重要的天然药物黄芩苷成为可能。

基因工程技术是实现遗传改良和种质创新的重要方法，开展黄芩苷代谢工程研究，进而获得高产优质的新型药源，而前提是阐明其生物合成的分子机理，即分离该途径上多个酶促反应步骤的基因，并考察目的基因在黄芩苷生物合成途径中的作用，为黄芩苷的代谢工程提供候选基因和作用靶点十分必要。黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase，F3H)是黄烷酮分支点的一个核心酶，它的作用是催化5，7，4’-黄烷酮C3位的羟化，生成二氢山奈素(dihydrokaempferol，DHK)，而DHK则是合成黄烷酮和花色素的重要中间产物(Timothy et al.，1995)。因此F3H是黄酮化合物生物合成途径上的一个关键酶，也是控制黄酮合成与花青素苷合成的分流位点。1991年，f3h基因首次从金鱼草中克隆出来，目前已从拟南芥(Arabidopsis thaliana)、苜蓿(Medicago sativa)和玉米(Zea mays)中被陆续分离鉴定。通过调控f3h基因的表达能够有效调节植物花卉或种皮的颜色，针对该基因的遗传操作已成为花色变异育种研究的重要手段；另一方面通过反义抑制f3h基因从而阻断花青素合成途径，使通用前体柚皮苷更多地流向目标代谢产物黄酮和异黄酮，该策略已被证明F3H是黄酮代谢工程的重要靶点。由此可见，f3h是黄酮生物合成途径上重要的调节基因，其催化的反应是黄酮合成调控的关键步骤。可以推断，要提高粘毛黄芩中黄芩苷的含量，F3H将会是一个很有效的代谢工程靶点，然而遗憾的是，到目前为止，还未见从粘毛黄芩中克隆和鉴定f3h基因的报道。根据GeneBank中黄烷酮3-羟化酶的核苷酸序列，结合PCR技术我们从粘毛黄芩中克隆了相关序列，根据GeneBank的搜索结果，将该基因命名为黄烷酮3-羟化酶基因。

在对现有文献的分析中，未见粘毛黄芩黄酮类化合物生物合成途径上的f3h基因的克隆，至今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列。本发明公开了粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶的氨基酸序列以及粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因的核苷酸序列，为最终采用打破黄酮类化合物生物合成途径上的限速反应步骤，实现黄芩苷的代谢工程提供候选基因和作用靶点，并其在利用转基因技术提高黄芩苷等黄酮类化合物的含量方面的应用奠定了基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

在本发明所分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第74-1123位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45—55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第74-1123位的核苷酸序列杂交。

本发明所分离出的粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列多肽，它包括：具有SEQID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。

本发明所提供的一种载体，它包含上述的DNA分子。一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

本发明用上述载体转化的宿主细胞是真核细胞。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列”指编码具有活性多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第74-1123位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第74-1123位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第74-1123位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第74-1123位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第74-1123位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶相同功能的蛋白的SEQ IDNO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶”指具有蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有相关相同功能的、SEQ ID NO.3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括其活性片段和活性衍生物。

本发明的粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

 

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val

 

Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

表2

78％identity in 233aa overlap

Query  1    MAPTGICLSALAEEKSLHPDFIRDEDERPKVEYNKFSDDIPVISLAG------DRAEMC

                 I LSALAEEKSL   F RDEDERPKVEYNKFS  IPVISLAG       R E C

Sbjct  1    -MAPTTTLTALAEEKSLQQKFVRDEDERPKVAYNVFSNEIPVISLAGIDEIEGRRSEIC

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            RKIVAACE WG FQVVDHGVD      M  LARHFFALPP  KLRFDMSGGKKGGFIVS

Sbjct  61   RKIVEACEGWGVFQVVDHGVDANLIAEMTRLAREFFALPPEEKLRFDMSGGKKGGFIVS

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            SHLQGEAVQDWREIVTYFSYPI ARDYSRWPDKPE WR  TE YSE LM LAC LLEVL

Sbjct  121  SHLQGEAVQDWREIVTYFSYPIRARDYSRWPDKPEGWRAVTETYSEKLMDLACKLLEVL

Query  181  SEAIGLEKDALSKACVNMDQKIVVNFYPKCPQPDLTLGLKRHTDPGLITLLLQDQVGGL

            SEA GLEK ALSKACVNMDQK V NFYPKCPQPDLTLGLKRHTDPGLITLLLQDQVGGL

Sbjct  181  SEAMGLEKEALTKACVDMDQKVVINFYPKCPQPDLTLGLKRHTDPGTITLLLQDQVGGL

Query  241  QATRDGGDTWITVQPVPGAFVVNLGDSAYYMSNGRFKNAYHQAVVNSECSRLSVATFQN

            QATRDGGDTWITVQPVPGAFVVNLGD   Y SNGRFKNA HQAVVNSECSRLS ATFQN

Sbjct  241  QATRDGGKTWITVQPVEGAFVVNLGDHGHYLSNGRFKNADHQAVVNSNCSRLSIATFQN

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            PAPEA VYPL Q  EGEK  L EPITF   YKRNMSY  E  KLKKL    K

Sbjct  241  PAPEATVYPL-KIREGEKPILEEPITFADMYKRKMSKDIELAKLKKLAKEKKLLQDQQDIE

Query：粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶的氨基酸序列

Sbjct：茶黄烷酮3-羟化酶的氨基酸序列(GenBank Accession No.AAT68774)

表2为本发明的粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶与茶黄烷酮3-羟化酶的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

发明还包括粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白或多肽的类似物。这些类似物与粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白时，可以将粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因的编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因表达载体。

如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

本发明的粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶，通过各种常规筛选方法，可筛选出与粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。

本发明在提高粘毛黄芩黄酮类化合物含量上具有明显的作用。提高该化合物的产量，以满足全世界对黄芩苷等药物的巨大需求。因此，本发明具有很大的应用价值。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等《分子克隆：实验室手册》(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶的克隆

1.组织分离(isolation)

粘毛黄芩从山西大学购买，将种子播种于温室中，待粘毛黄芩苗长至10cm高时，准备抽取DNA或RNA。

2.RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据各种植物的黄烷酮3-羟化酶基因的核苷酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(Clontech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)核心片断的克隆

PCR[BP001(5’-

CA(G/A)GT(G/A/T)GTT(G/A)ATCA(T/C)GG(A/G)GT(T/C)GA-3’)+BP002(5’-TC(A/C)GCATTCTTGAACCT(T/C)CCATT-3’)]得到500bp的核心片断，回收后连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知黄芩的F3H基因的同源性很高，故初步认为它是一个查尔酮基因。

(2)3’-RACE

第一轮PCR[AP+BP003(5’-GATCACTTTGCTGCTACAAGAC-3’)]连同第二轮PCR[AP+BP004(5’-TGGATCACGGTTCAACCCGTCC-3’)]得到527bp3’端序列，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与黄芩的F3H基因的同源性很高，故初步认为它是一个黄烷酮3-羟化酶基因。

(3)5’-RACE

第一轮PCR[UMP+BP005(5’-CTCCAGTAGTTGGCAGGCCAGG-3’)]连同第二轮PCR[(NUP+BP006(5’-CTCGAGTAGTCACGGGCCTCG-3’)]得到495bp5’端序列，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与黄芩的F3H基因的同源性很高，故初步认为它是一个黄烷酮3-羟化酶基因。

将测序结果的重叠区拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增F3H编码区(BP007F1(5’-ATGGCCCCAACAGGGATTTGCC-3’)+BP007R1(5’-AGCTTGGAAATCTCCTCCTTTT-3’))得到F3H的编码区(1050bp)。

BLAST的结果证明从粘毛黄芩中新得到的基因确为一个查尔酮基因。由于已知的同源黄烷酮3-羟化酶基因具有将桂皮酰辅酶A与丙二酸单酰辅酶A缩合成柚皮苷查尔酮的功能，故推测此基因具有相同的功能。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶的全长编码序列。在拼接得到全长(包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物BP008 F1：5’-ACGCGGGGACCAGAAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO.1)为正向引物，BP009 R1：5’-ACGCGGGGACCAGAAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO.2)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，F1/R2的PCR条件为：94℃预变性2min；然后94变性45s、52退火45s、72延伸2min；30个循环；最后72延伸10min；电泳检测PCR产物，获得扩增片断长度为1142bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆，测序，获得SEQ ID NO.3所示的序列。

实施例2

粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因序列信息与同源性分析

本发明新的黄烷酮3-羟化酶基因序列全长cDNA的长度为1317bp，详细序列见SEQID NO.3，其中开放读框位于74-1123核苷酸(1050个核苷酸)。根据全长cDNA推导出粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶氨基酸序列，共233个氨基酸残基，分子量为39.38kDa，等电点(PI)为5.41。详细序列见SEQ ID NO.4。

将粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因基因相关的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与茶黄烷酮3-羟化酶基因基因序列在核苷酸水平上具有65％的相同性(附表2)；在氨基酸水平上，它与茶黄烷酮3-羟化酶基因F3H在蛋白水平上具有78％的相同性，(附表3)。由此可见，粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因与茶黄烷酮3-羟化酶基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶在黄酮类化合物生物合成途径上也具有相似的作用。

实施例3

粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白或多肽在粘毛黄芩中进行真核细胞表达及转基因植株中黄芩苷含量的检测。

含目的基因的表达载体的构建，根据粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因编码序列(SEQID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA1304)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化粘毛黄芩。

1.发苗：采取粘毛黄芩成熟的种子，用0.1％(M/V)升汞(HgCl₂)溶液浸泡5分钟，用无菌水冲洗6次；将粘毛黄芩种子接种在种子萌发培养基上(培养基盛于150ml的三角瓶中，于121℃灭菌20分钟)，该培养基配方为：MS基本培养基，添加30g·L^-1蔗糖，调节培养基pH值为5.8，再添加5％琼脂粉。在光照培养箱中培养粘毛黄芩的幼芽，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养。待种子萌动后，改变培养条件为：25℃，12小时光照，光照强度为25μmol·m^-2·s^-1。等到植株片长到3cm高时可用于遗传转化。

2.转化共培养：将粘毛黄芩无菌苗的幼嫩叶片用小刀片削成约1cm²放入事先培养好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分钟。接着取出放入共培养基暗培养2天。

3.除菌培养：共培养结束后，将外植体放入除菌培养基培养。4周继代一次。待除菌培养结束后，转入抗性筛选培养基进行转基因毛状根初步筛选。

除菌培养基：MS+cb(250mg·L^-1)

筛选培养基：MS+hygr(30mg·L^-1)

4.毛状根的离体培养：当毛状根长至大约4cm长时切下，在不含任何植物激素的MS培养基上于25±1.0℃无光照的恒温培养箱中继代培养。每三周继代一次，经过几次继代培养后可进行液体发酵培养，以进一步进行分子检测。

5.转基因粘毛黄芩的分子检测

毛状根DNA的提取和纯化均参照《分子克隆实验指南》(Sambrook，J.et al 1993)根据Furner等的Ri质粒基因序列分析设计rolB、rolC基因的特异性引物。rolB基因的一对引物为：5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’和5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’。rolC基因的一对引物为5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’和5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’。rolB、rolC基因的片段大小分别423bp和626bp。同时对基因进行PCR检测。

6.黄烷酮3-羟化酶基因在粘毛黄芩毛状根中的northern blot分析

1)RNA的提取：利用TRIzol试剂盒(GIBCO BRL，USA)提取并参考《分子克隆实验指南》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)提取粘毛黄芩转基因毛状根各个单克隆的RNA。

2)RNA的定量：参考《分子克隆实验指南》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD₂₆₀；RNA含量计算：1OD₂₆₀＝40μg·ml^-1。

3)总RNA琼脂糖凝胶电泳分离：①取6ml 25×(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。②称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。③于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。④迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。⑤将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。⑥在样品中加入2ul 10×上样缓冲液，混匀。⑦在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。

4)RNA尼龙膜上转移：①转移之前，将尼龙膜用10×SSC浸泡。②将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2×SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。③滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。④转移后，将膜于80℃烘烤2小时。

5)膜上杂交信号的检出：①将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg·ml^-1鲑鱼精DNA，65℃下预杂交2小时。②将用Gene Images^TM Contents CDP-Star^TM labelling module标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入①的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。③取出膜，置于洗膜液I(1×SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1×SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。④用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。

7.转黄烷酮3-羟化酶基因的粘毛黄芩毛状根黄芩苷的HPLC分析

黄芩苷的提取：将培养30d的单克隆毛状根洗净，用吸水纸吸干水分，称鲜重后冷冻干燥30h至恒重，研磨成粉，称取100mg干粉加入10mL甲醇超声破碎20min，过滤，再提取一次，合并滤液，将甲醇提取液浓缩蒸干，用甲醇定容至10ml，-20℃保存，作为供试样品溶液，可用于HPLC分析。

高压液相检测标准品的制备：精密称取2mg黄芩苷标准对照品，用色谱纯甲醇溶解过滤，配成浓度为1000μg·mL^-1，分别梯度稀释成280、140、70、35、17.5μg·mL^-1。在相应的色谱条件下进样，且每一浓度进样三次，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积对进样量回归分析，得对照品的线性回归方程和标准曲线。

高压液相检测条件：色谱柱为Symmetry-C₁₈柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相甲醇：0.2mol·L^-1磷酸二氢钠溶液(45∶55)，流速0.8mL·min^-1，柱温25℃。检测波长：280nm。黄芩苷大约在7.7min处出峰。

序列表

SEQ ID NO.1

<110>西南大学

<120>粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列

<140>

<141>

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>22bp

<212>DNA

<213>粘毛黄芩(Scutellaria viscidula Bunge)

<400>1

SEQ ID NO.2

<210>2

<211>22bp

<212>DNA

<213>粘毛黄芩(Scutellaria viscidula Bunge)

<400>2

SEQ ID NO.3

<210>3

<211>1317

<212>DNA

<213>粘毛黄芩(Scutellaria viscidula Bunge)

<220>1

<221>CDS

<222>(54)..(752)

<223>

<400>3

<210>4

<211>350

<212>PRT

<213>粘毛黄芩(Scutellaria viscidula Bunge)

<400>4

Claims (4)

1、一种粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列，编码具有黄烷酮3-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列由SEQ ID NO.3中从核苷酸第74-1123位的核苷酸序列或其简并序列构成。

2、根据权利要求1所述的粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列，其特征是，所述简并序列是指位于SEQ ID NO.3序列的编码框第74-1123位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。

3、根据权利要求1或2所述的粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列，其特征是，所述的序列编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。

4、根据权利要求4所述的粘毛黄芩黄烷酮3-羟化酶蛋白编码序列转化的宿主细胞，其特征是，所述宿主细胞是真核细胞。