CN115786389A - 一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明适用于微生物代谢及合成生物学领域，提供了一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，其中，高产檀香醇的酿酒酵母工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，过表达IME4、tHMGR、UPC2‑1、SaSS、CYP736A167和AtCPR1基因，敲低ERG9基因；其中，IME4基因的启动子替换为组成型强启动子PGK1p；tHMGR和UPC2‑1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；ERG9基因的启动子替换为半乳糖抑制型启动子HXT1p；SaSS、CYP736A167和At CPR1基因整合到酿酒酵母染色体的TY2位点。本发明实施例构建得到的酿酒酵母工程菌可以通过摇瓶发酵来生产檀香醇，该生产工艺简单，且檀香醇的产量较高，可达278mg/L。

Description

一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于微生物代谢及合成生物学领域，尤其涉及一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

檀香挥发油是檀香的最重要成分，提取自檀香科植物檀香(Santalum album L.)的干燥心材。药典(2015版)规定，其含量不得少于3.0％(mL/g)。檀香挥发油的主要成分为倍半萜类化合物，α-檀香醇、β-檀香醇、α-檀香烯和β-檀香烯等四种成分占檀香挥发油比重的95％以上。檀香挥发油中，α-檀香醇和β-檀香醇是指标成分，国际标准要求二者的含量要分别达到41-55％和16-24％。

现代医学表明，檀香挥发油具有多种药用功效，如抗炎、解热、抗氧化、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤等。同时，檀香挥发油具有重要的经济价值：(1)檀香挥发油是世界公认的高级化妆品的名贵原料，被广泛用于各种化妆品的制作，如洁面乳、爽肤水、面霜、眼霜、面膜、乳液、洗发水、沐浴露、润体乳和香皂等；(2)檀香挥发油中的α-檀香醇和β-檀香醇能够产生特殊的香味，已成为香水最珍贵的成分，现有的大约7000种经典香水中，有46％都含有檀香挥发油；(3)檀香挥发油独有的香气可安抚神经、提神静心，能够缓解忧郁、焦虑和神经紧张等的症状，被誉为“精油之帝”，可通过蒸汽吸入、按摩、涂抹、泡澡和熏香等方式应用于芳香疗法。

目前，檀香挥发油只能从檀香的心材中蒸馏提取，但檀香为半寄生植物，不能离开寄主独立生存，其生长条件严苛，生长周期长，只有20年以上树木的心材才能达到品质要求。因此，利用合成生物学的手段，通过微生物细胞工厂进行制备，是解决这一高价值成分的有效方法。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，旨在解决背景技术中提出的问题。

针对上述问题，本发明实施例是这样实现的，一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，其中，所述高产檀香醇的酿酒酵母工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，过表达IME4、tHMGR、UPC2-1、SaSS、CYP736A167和AtCPR1基因，敲低ERG9基因；其中，IME4基因的启动子替换为组成型强启动子PGK1p；tH MGR和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；ERG9基因的启动子替换为半乳糖抑制型启动子HXT1p；SaSS、CYP736A167和AtCPR1基因整合到酿酒酵母染色体的TY2位点；

所述构建方法具体包括以下步骤：

将筛选标记MET和启动子PGK1p连接，构建基因表达模块MET-PGK1p，命名为模块I；

将GAL1p、tHMGR和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMGR-AD H1t，命名为模块II；

将GAL10p、UPC2-1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块III；

将模块II和模块III连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMGR-ADH1t-GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块IV；

将筛选标记HIS和启动子HXT1p连接，构建基因表达模块HIS-HXT1p，命名为模块V；

将GAL1p、SaSS和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-SaSS-ADH1t，命名为模块VI；

将GAL1p、CYP736A167和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-CYP736A167-ADH1t，命名为模块VII；

将GAL10p、AtCPR1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p-AtCPR1-CYC1t，命名为模块VIII；

将模块VII和模块VIII连接，构建基因表达模块GAL1p-CYP736A167-ADH1t-GAL10p-AtCPR1-CYC1t，命名为模块IX；

将模块I转化酵母工程菌，得到菌株TX01；

将模块IV插入到载体pCfB2875的SfaSI酶切位点，得到整合表达载体pCf B2875-III；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合表达载体pCfB2875-III，得到DNA整合片段S1；再将DNA整合片段S1整合到酵母工程菌染色体的TY3位点，得到菌株TX02；

将pSH65载体(武汉淼灵生物科技有限公司)转化菌株TX02，并进行筛选(具体可以用含有80-120μg/mL博来霉素的YPD固体培养基进行筛选)，得到菌株TX03；

将模块V转化酵母工程菌TX03，得到菌株TX04；

将模块VI插入到载体pCfB2797的SfaSI酶切位点，得到整合表达载体pCf B2797-VI；将模块IX插入到载体pCfB2797-VI的NheI酶切位点，得到整合表达载体pCfB2797-VI-IX；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合表达载体pCfB2797-VI-IX，得到DNA整合片段S2；再将DNA整合片段S2整合到菌株TX04染色体的TY2位点，得到所述高产檀香醇的酿酒酵母工程菌；

其中，所述UPC2-1基因是基于PCR的定点突变技术将转录因子基因UPC2突变为UPC2-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的tHMGR和UPC2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示；所述的SaSS和CYP736A167基因为檀香中的檀香烯合酶和檀香醇合酶经密码子优化而来，其核苷酸序列如S EQ ID NO.4-5所示；所述的AtCPR1基因为拟南芥中的细胞色素P450酶的还原酶经密码子优化而来，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述PGK1p、HXT1p、GAL1p、GAL10p、ADH1t和CYC1t的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-12所示；所述的筛选标记MET和HIS的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13-14所示。

需要说明的是，上述各模块可以利用重叠PCR技术进行构建。另外，上述各步骤中的转化为采用酵母转化试剂盒进行转化；优选为用Zymo Research Fro zen-EZ YeastTransformation II KitTM酵母转化试剂盒进行转化。

优选地，所述的出发菌株为酿酒酵母BY4741。上述的tHMGR和UPC2基因可从酿酒酵母BY4741基因组中克隆得到；启动子PGK1p、HXT1p、GAL1p和GAL10p，以及终止子ADH1t和CYC1t也可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到。

优选地，所述檀香醇至少包括α-檀香醇和β-檀香醇。α-檀香醇(C₁₅H₂₄O)和β-檀香醇(C₁₅H₂₄O)的结构式分别如下所示：

本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述构建方法构建得到的酿酒酵母工程菌。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的酿酒酵母工程菌在高产檀香醇中的应用。

本发明实施例的另一目的在于提供一种高产檀香醇的方法，其包括以下步骤：

将上述的酿酒酵母工程菌经活化后，再接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到檀香醇。

优选地，活化为多级活化，通过以下操作实现：

挑取所述的酿酒酵母工程菌单克隆，接种到YPD培养基中，置于恒温条件下震荡培养至OD值为2-3，得到培养物；然后吸取培养物接种到YPD培养基，置于恒温条件下继续进行震荡培养。

具体的，活化的步骤包括：挑取所述的酿酒酵母工程菌单克隆，接种到含5mL YPD培养基的试管中，30℃条件下220rpm震荡培养至OD值为2-3；然后吸取1mL培养物接种到含50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，30℃条件下220rpm震荡培养168h。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明实施例提供的一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，是通过以酿酒酵母为出发菌株，过表达IME4、tHMGR、UPC2-1、SaSS、CYP736A167和AtCPR1基因，敲低ERG9基因进行构建，其构建得到的酿酒酵母工程菌可以通过摇瓶发酵来生产檀香醇，该生产工艺简单，且檀香醇的产量较高，可达278mg/L。

附图说明

图1为本发明实施例提供的高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建示意图。

图2为本发明实施例的高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的GC-MS检测结果图。

图3为本发明实施例得到的发酵产物檀香醇(α-檀香醇和β-檀香醇)的质谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂、原材料和设备仪器均可通过市售获得。

本发明实施例中所涉及的培养基的配方如下：

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L或者半乳糖18g/L+葡萄糖2g/L(固体YPD培养基在配制时添加20g/L的琼脂粉)。

SD-MET培养基：SD粉末6.7g/L，MET(甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。

SD-MET-URA培养基：SD粉末6.7g/L，MET(甲硫氨酸)和URA(尿嘧啶)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。

SD-MET-URA-HIS培养基：SD粉末6.7g/L，MET(甲硫氨酸)、URA(尿嘧啶)和HIS(组氨酸)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。

HIS/MET/LEU/URA四缺氨基酸母液(100X)：精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，用蒸馏水定容到57mL，根据需要可不加任意一种氨基酸配置成缺陷氨基酸母液(100X)(甲硫氨酸(ME T)0.12g，尿嘧啶(URA)0.12g，亮氨酸(LEU)0.36g，组氨酸(HIS)0.12g)。上述原料均购买自Sigma-Aldrich。

实施例1

该实施例提供了一种酵母内源基因和各表达元件的克隆方法，包括以下步骤：

S1、酵母基因组DNA的提取

(1)将酿酒酵母BY4741的单克隆挑取至含有5mL YPD培养基的10mL试管中，30℃培养过夜，然后4000rpm离心2min进行集菌。

(2)将收集到的菌体转移至研钵中，加入液氮研磨，然后将研磨破碎的菌体转移至1.5mL离心管中。

(3)利用基因组DNA纯化试剂DNAiso Reagent(9770Q，宝日医生物技术有限公司)提取酵母基因组，具体操作过程见说明书。

S2、酵母基因和表达元件的克隆

(1)以上述获得的酵母基因组DNA为模板，分别克隆以下基因、启动子和终止子(扩增引物见表1)：

基因tHMGR(引物为tHMGR-F和tHMGR-R)、基因UPC2(引物为UPC2-F和UPC2-R)、启动子PGK1p(引物为PGK1p-F和PGK1p-R)、启动子HXT1p(引物为HXT1p-F和HXT1p-R)、启动子GAL1p(引物为GAL1p-F和GAL1p-R)、启动子GAL10p(引物为GAL10p-F和GAL10p-R)、终止子ADH1(引物为ADH1t-F、ADH1t-R)和终止子CYC1t(引物为CYC1t-F、CYC1t-R)。

PCR反应体系：KAPA Taq ReadyMix(KK1006，默克)10μL，上下游引物各0.5μL，ddH₂O 7μl，模板1μL，总反应体系为20μL。

PCR扩增反应条件为：98℃1min；98℃30s，55-60℃30s，72℃1-2min，32循环；72℃10min。

PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小，并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP219，天根生化科技有限公司)回收目的条带，具体操作过程见说明书。

(2)DNA片段连接亚克隆载体

将回收的目的DNA片段连接平末端亚克隆载体pEASY-Blunt(CB101，全式金生物技术有限公司)，具体操作见产品说明书，并转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布平板。

(3)将平板置于37℃培养箱中，倒置培养过夜。

(4)挑选单菌落做菌落PCR验证目的基因与亚克隆载体的连接，PCR反应体系如下：Easy Taq聚合酶0.2μL(AP111，全式金生物技术有限公司)，dNT Ps(2.5mM)0.8μL，10x EasyTaq Buffer 1μL，上下游引物各0.3μL，dd H₂O 7.4μL。

PCR扩增条件为：95℃3min；95℃30s，55-60℃30s，72℃1-2min，30个循环；72℃7min。

PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，挑取阳性克隆菌株测序。

表1本发明实施例中克隆各基因和表达元件所用的引物序列所用的引物序列

实施例2

该实施例提供了各表达模块的构建方法，具体包括以下步骤：

S1、利用重叠PCR构建基因表达模块I-模块IX

(1)各表达模块的构建均采用重叠PCR技术，模块中各连接的片段通过P CR克隆获得，相邻片段的引物设计40-50bp的重叠区域，并且使重叠区域碱基的退火温度在60℃以上。

(2)第一轮PCR扩增反应体系：KAPA Taq ReadyMix(KK1006，默克)10μL，上下游引物各0.5μL，ddH₂O 7μL，模板1μL，总反应体系为20μL；其中引物序列见表2。

第一轮PCR扩增反应条件为：98℃1min；98℃30s，55-60℃30s，72℃1-4min，15循环；72℃10min。

(3)取第一轮PCR扩增反应液1μL作为第二轮PCR扩增反应的模板，第二轮PCR扩增反应体系：KAPA Taq ReadyMix(KK1006，默克)10μL，上下游引物各0.5μL，ddH₂O 7μL，模板1μL，总反应体系为20μL；其中引物序列见表2。

第二轮PCR扩增反应条件：98℃1min；98℃30s，50-60℃30s，72℃1-4min，32个循环；72℃10min。

(4)凝胶电泳胶回收目的片段，并连接pEASY-Blunt亚克隆载体(CB101，全式金生物技术有限公司)测序。

按上述步骤共构建以下六个模块：

(a)将筛选标记MET和PGK1p，构建基因表达模块MET-PGK1p，命名为模块I；其中，第一轮PCR克隆筛选标记MET引物为I-F1和I-R1，克隆PGK1p引物为I-F2和I-R2；第二轮PCR引物为I-F1和I-R2；引物序列见表2。

(b)将GAL1p、tHMG1和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMG1-ADH1t，命名为模块II。其中，第一轮PCR克隆GAL1p的引物为II-F1和II-R1，克隆tHMGR的引物为II-F2和II-R2，克隆ADH1t的引物为II-F3和II-R3；第二轮的PCR引物为II-F1和II-R3；引物序列见表2。

(c)将GAL10p、UPC2-1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p-UP C2-1-CYC1t，命名为模块III。其中，第一轮PCR克隆GAL10p的引物为III-F1和III-R1，克隆UPC2-1的引物为III-F2和III-R2，克隆CYC1t的引物为III-F3和III-R3；第二轮的PCR引物为III-F1和III-R3；引物序列见表2。

(d)将模块II和模块III连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMGR-ADH1t-GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块IV。其中，第一轮PCR克隆模块II的引物为IV-II-F1和IV-II-R1，克隆模块III的引物为IV-III-F2和IV-III-R2；第二轮的PCR引物为IV-II-F1和IV-III-R2；引物序列见表2。

(e)将筛选标记HIS和HXT1p，构建基因表达模块HIS-HXT1p，命名为模块V；其中，第一轮PCR克隆筛选标记HIS引物为V-F1和V-R1，克隆HXT1p引物为V-F2和V-R2；第二轮PCR引物为V-F1和V-R2；引物序列见表2。

(f)将GAL1p、SaSS和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-SaSS-AD H1t，命名为模块VI。其中，第一轮PCR克隆GAL1p的引物为VI-F1和VI-R1，克隆SaSS的引物为VI-F2和VI-R2，克隆ADH1t的引物为VI-F3和VI-R3；第二轮的PCR引物为VI-F1和VI-R3；引物序列见表2。

(g)将GAL1p、CYP736A167和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-CYP736A167-ADH1t，命名为模块VII。其中，第一轮PCR克隆GAL1p的引物为VII-F1和VII-R1，克隆CYP736A167的引物为VII-F2和VII-R2，克隆ADH1t的引物为VII-F3和VII-R3；第二轮的PCR引物为VII-F1和VII-R3；引物序列见表2。

(h)将GAL10p、AtCPR1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p-At CPR1-CYC1t，命名为模块VIII。其中，第一轮PCR克隆GAL10p的引物为VIII-F1和VIII-R1，克隆AtCPR1的引物为VIII-F2和VIII-R2，克隆CYC1t的引物为VIII-F3和VIII-R3；第二轮的PCR引物为VIII-F1和VIII-R3；引物序列见表2。

(i)将模块VII和模块VIII连接，构建基因表达模块GAL1p-CYP736A167-ADH1t-GAL10p-AtCPR1-CYC1t，命名为模块IX。其中，第一轮PCR克隆模块V II的引物为IX-VII-F1和IX-VII-R1，克隆模块VIII的引物为IX-VIII-F2和IX-VI II-R2；第二轮的PCR引物为IX-VII-F1和IX-VIII-R2；引物序列见表2。

其中，UPC2-1基因是基于PCR的定点突变技术将转录因子基因UPC2突变为UPC2-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；tHMGR和UPC2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示；SaSS和CYP736A167基因为檀香中的檀香烯合酶和檀香醇合酶经密码子优化而来，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；AtCPR1基因为拟南芥中的细胞色素P450酶的还原酶经密码子优化而来，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；PGK1p、HXT1p、GAL1p、GAL10p、ADH1t和C YC1t的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-12所示；筛选标记MET和HIS的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13-14所示。

S2、酵母基因组整合型表达载体pCfB2875-III的构建

(1)利用限制性内切酶SfaAI酶切载体pCfB2875(Addgene)，酶切体系如下：pCfB2875载体1μL，限制性内切酶SfaAI(FD2094，默克)0.5μL，，10x Fast Digest Buffer 1μL，ddH2O 7.5μL，总反应体系为10μL。

(2)37℃酶切1h，然后胶回收线性化的载体。

(3)将模块III从pEASY-Blunt-GAL1p-tHMGR-ADH1t-GAL10p-UPC2-1-C YC1t(即上述模块III连接pEASY-Blunt载体获得)上扩增下来，胶回收获得纯化的PCR产物，然后将其同源重组到线性化的pCfB2875载体限制性内切酶酶切位点SfaAI和NheI之间，同源重组体系如下：

II 1μL，5×CE II Buff er 2μL，回收的线性化载体1μL，纯化的PCR产物4μL，ddH₂O 2μL，总反应体系为10μL。

(4)37℃反应30min，将同源重组体系转化DH5α感受态细胞，涂布平板，37℃培养过夜，经菌落PCR鉴定和质粒测序，得到整合型表达载体pCfB2875-II I。

S3、酵母基因组整合型表达载体pCfB2797-VI-IX的构建

(1)利用限制性内切酶SfaAI酶切载体pCfB2797(Addgene)，酶切体系如下：pCfB2797载体1μL，限制性内切酶SfaAI(FD2094，默克)0.5μL，10x Fast Digest Buffer 1μL，ddH₂O 7.5μL，总反应体系为10μL。

(2)37℃酶切1h，然后胶回收线性化的载体。

(3)将模块VI从pEASY-Blunt-GAL1p-SaSS-ADH1t(即上述模块VI连接pEASY-Blunt载体获得)上扩增下来，胶回收获得纯化的PCR产物，然后将其同源重组到线性化的pCfB2797载体限制性内切酶酶切位点SfaAI，同源重组体系如下：

II 1μL，5×CEII Buffer 2μL，回收的线性化载体1μL，纯化的PCR产物4μL，ddH₂O 2μL，总反应体系为10μL。

(4)37℃反应30min，将同源重组体系转化DH5α感受态细胞，涂布平板，37℃培养过夜，经菌落PCR鉴定和质粒测序，得到整合型表达载体pCfB2797-V I。

(5)利用限制性内切酶NheI酶切载体pCfB2797-VI，酶切体系如下：pCfB2797-VI载体1μL，限制性内切酶NheI(FD2094，默克)0.5μL，10x Fast Digest Buffer 1μL，ddH₂O 7.5μL，总反应体系为10μL。

(6)37℃酶切1h，然后胶回收线性化的载体。

(7)将模块IX从pEASY-Blunt-GAL1p-CYP736A167-ADH1t-GAL10p-AtCP R1-CYC1t(即上述模块IX连接pEASY-Blunt载体获得)上扩增下来，胶回收获得纯化的PCR产物，然后将其同源重组到线性化的pCfB2797-VI载体限制性内切酶酶切位点SfaAI，同源重组体系如下：

II 1μL，5×CE II Buffer 2μL，回收的线性化载体1μL，纯化的PCR产物4μL，ddH₂O 2μL，总反应体系为10μL。

(8)37℃反应30min，将同源重组体系转化DH5α感受态细胞，涂布平板，37℃培养过夜，经菌落PCR鉴定和质粒测序，得到整合型表达载体pCfB2797-V I-IX。

表2本发明中构建各模块所用的引物序列

实施例3

如图1所示，该实施例提供了一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，具体包括以下步骤：

S1、酿酒酵母工程菌株TX01的构建

(1)将模块I从pEASY-Blunt-MET-PGK1p上扩增下来，PCR反应体系：K APA TaqReadyMix(KK1006，默克)25μL，上下游引物各1.25μL，ddH₂O 21.5μL，模板1μL，总反应体系为50μL。

PCR扩增反应条件为：98℃1min；98℃30s，55-60℃30s，72℃2mi n，32循环；72℃10min。

跑电泳检测PCR产物，并纯化回收。

(2)将回收的PCR片段转化菌株BY4741，用甲硫氨酸(SD-MET培养基)平板进行筛选，得到酿酒酵母工程菌株TX01。

S2、酿酒酵母菌株TX02的构建

(1)利用限制性内切酶NotI酶切构建好的整合型表达载体pCfB2875-III，凝胶电泳检测并回收目的条带，获得DNA整合片段S1。

(2)取50μL上述纯化的DNA片段，转化酿酒酵母工程菌株TX01，以将模块整合到酵母TX01染色体的TY3位点，并用尿嘧啶缺陷型培养基(SD-MET-URA培养基)平板进行筛选，经菌落PCR验证，得到酿酒酵母工程菌株TX02。

S3、酿酒酵母工程菌株TX03的构建

(1)将pSH65载体(武汉淼灵生物科技有限公司)转化酿酒酵母工程菌株TX02，用含有100μg/mL博来霉素的YPD固体培养基进行筛选。

(2)将单克隆挑取到含有100μg/mL博来霉素的YPD培养基中进行培养。

(3)培养四天后，采用划线稀释的方法，获得单克隆菌落。

(4)提取单克隆菌落的基因组，PCR扩增整合的DNA片段S1，经测序筛选得到整合型载体KIURA3筛选标记被敲除的菌株，再通过YPD培养基传代培养十天，丢掉pSH65质粒，得到酿酒酵母工程菌株TX03。

S4、酿酒酵母工程菌株TX04的构建

(1)将模块V从pEASY-Blunt-HIS-HXT1p上扩增下来，PCR反应体系：K APA TaqReadyMix(KK1006，默克)25μL，上下游引物各1.25μL，ddH₂O21.5μL，模板1μL，总反应体系为50μL。

PCR扩增反应条件为：98℃1min；98℃30s，55-60℃30s，72℃2mi n，32循环；72℃10min。

跑电泳检测PCR产物，并纯化回收。

(2)将回收的PCR片段转化酿酒酵母工程菌株TX03，用甲硫氨酸(SD-M ET-HIS培养基)平板进行筛选，得到酿酒酵母工程菌株TX04。

S5、高产檀香醇的酿酒酵母工程菌株TX05的构建

(1)利用限制性内切酶NotI酶切构建好的整合型表达载体pCfB2797-VI-I X，凝胶电泳检测并回收目的条带，获得DNA整合片段S2。

(2)取50μL上述纯化的DNA片段，转化酿酒酵母工程菌株TX04，以将模块整合到酿酒酵母工程菌株TX04染色体的TY2位点，并用尿嘧啶缺陷型培养基(SD-MET-HIS-URA培养基)平板进行筛选，经菌落PCR验证，得到高产檀香醇的酿酒酵母工程菌株TX05。

实施例4

该实施例提供了一种利用酿酒酵母工程菌株TX05发酵生成檀香醇的方法，具体包括以下步骤：

S1、酿酒酵母工程菌株TX05的发酵培养

(1)将酿酒酵母工程菌株TX05的单菌落接种到含5mL YPD的试管中，30℃条件下220rpm培养OD值至2-3。

(2)取1mL上述菌液接种到含50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，30℃条件下220rpm培养168h，得到发酵液。

S2、目的产物的萃取与检测

(1)取上述发酵液，加入等体积的乙酸乙酯，超声1h，然后静置48h。

(2)取有机层于干净的液相小瓶中，进行GC-MS检测。其中，所用的仪器优选为安捷伦气质联用仪7890B-5977B。检测方法如下：进样体积为1μL，溶剂延时设置为12min，载气为氦气，流速为1mL/min。色谱柱为HP-5MS。色谱条件：50℃，3min；20℃/min速率升温到70℃，1min；15℃/min升温到300℃，3min。

(3)GC-MS检测结果显示，酿酒酵母工程菌株TX05经发酵168h可以产生278mg/L的檀香醇。其中，高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的GC-MS检测结果图如图2所示，本实施例得到的发酵产物檀香醇(α-檀香醇和β-檀香醇)的质谱图如图3所示。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述高产檀香醇的酿酒酵母工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，过表达IME4、tHMGR、UPC2-1、SaSS、CYP736A167和AtCPR1基因，敲低ERG9基因；其中，IME4基因的启动子替换为组成型强启动子PGK1p；tHMGR和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；ERG9基因的启动子替换为半乳糖抑制型启动子HXT1p；SaSS、CYP736A167和AtCPR1基因整合到酿酒酵母染色体的TY2位点；

所述构建方法具体包括以下步骤：

将筛选标记MET和启动子PGK1p连接，构建基因表达模块MET-PGK1p，命名为模块I；

将GAL1p、tHMGR和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMGR-AD H1t，命名为模块II；

将GAL10p、UPC2-1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块III；

将模块II和模块III连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMGR-ADH1t-GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块IV；

将筛选标记HIS和启动子HXT1p连接，构建基因表达模块HIS-HXT1p，命名为模块V；

将GAL1p、SaSS和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-SaSS-ADH1t，命名为模块VI；

将GAL1p、CYP736A167和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-CYP736A167-ADH1t，命名为模块VII；

将GAL10p、AtCPR1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p-AtCPR1-CYC1t，命名为模块VIII；

将模块VII和模块VIII连接，构建基因表达模块GAL1p-CYP736A167-ADH1t-GAL10p-AtCPR1-CYC1t，命名为模块IX；

将模块I转化酵母工程菌，得到菌株TX01；

将模块IV插入到载体pCfB2875的SfaSI酶切位点，得到整合表达载体pCf B2875-III；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合表达载体pCfB2875-III，得到DNA整合片段S1；再将DNA整合片段S1整合到酵母工程菌染色体的TY3位点，得到菌株TX02；

将pSH65载体转化菌株TX02，并进行筛选，得到菌株TX03；

将模块V转化酵母工程菌TX03，得到菌株TX04；

将模块VI插入到载体pCfB2797的SfaSI酶切位点，得到整合表达载体pCf B2797-VI；将模块IX插入到载体pCfB2797-VI的NheI酶切位点，得到整合表达载体pCfB2797-VI-IX；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合表达载体pCfB2797-VI-IX，得到DNA整合片段S2；再将DNA整合片段S2整合到菌株TX04染色体的TY2位点，得到所述高产檀香醇的酿酒酵母工程菌；

其中，所述UPC2-1基因是基于PCR的定点突变技术将转录因子基因UPC2突变为UPC2-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的tHMGR和UPC2基因的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1-2所示；所述的SaSS和CYP736A167基因为檀香中的檀香烯合酶和檀香醇合酶经密码子优化而来，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；所述的AtCPR1基因为拟南芥中的细胞色素P450酶的还原酶经密码子优化而来，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述PGK1p、HXT1p、GAL1p、GAL10p、ADH1t和CYC1t的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-12所示；所述的筛选标记MET和HIS的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13-14所示。

2.根据权利要求1所述的一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述的出发菌株为酿酒酵母BY4741。

3.根据权利要求1所述的一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述檀香醇至少包括α-檀香醇和β-檀香醇。

4.一种采用权利要求1-3中任一项所述构建方法构建得到的酿酒酵母工程菌。

5.一种如权利要求4所述的酿酒酵母工程菌在高产檀香醇中的应用。

6.一种高产檀香醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求4所述的酿酒酵母工程菌经活化后，再接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到檀香醇。

7.根据权利要求6所述的一种高产檀香醇的方法，其特征在于，活化为多级活化，通过以下操作实现：

挑取所述的酿酒酵母工程菌单克隆，接种到YPD培养基中，置于恒温条件下震荡培养至OD值为2-3，得到培养物；然后吸取培养物接种到YPD培养基，置于恒温条件下继续进行震荡培养。

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