CN113897341B - 中华被毛孢己酮糖激酶及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种来自真菌中药中华被毛孢的己酮糖激酶及其编码基因和应用。所述中华被毛孢己酮糖激酶其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述中华被毛孢己酮糖激酶参与D‑果糖‑1‑磷酸出发合成虫草多糖主要前体单糖D‑果糖。基于本发明所述中华被毛孢己酮糖激，可通过基因工程手段，调节D‑果糖生物合成基因的表达，赋予宿主D‑果糖的高表达性，为扩大D‑果糖及其衍生物的产量提供了有效途径。

Description

中华被毛孢己酮糖激酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种来自真菌中药中华被毛 孢的己酮糖激酶及其编码基因和应用。
背景技术
茯苓、冬虫夏草(无性型菌株中华被毛孢)、僵蚕以及蝉花等作为我国传统 的真菌中药材，已经从中检测出多糖、甾醇类、萜类、核苷类等多种功能活性组 分。多糖(Polysaccharide)作为真菌中药中的一种重要生物活性大分子，具有抗 肿瘤、免疫调节、抗氧化等生物活性。真菌中药中华被毛孢含有丰富的多糖，其 在抗氧化、免疫调节及抗肿瘤方面具有较好的效果以及广阔的临床应用前景。
真菌中药多糖是一种具有生物活性的生物分子，由果糖、甘露糖、葡萄糖等 不同比例的单糖组成，具有广泛的理化性质，其免疫调节和抗肿瘤活性已引起科 学界的广泛关注。随着市场对真菌中药多糖需求增加，而野生药材对多糖的供应 较少，这使得真菌中药中华被毛孢越来越广泛地用于医药健康产品中。
鉴于多糖及其类似物具有重要药理作用，国内外也有大量文献报道了多糖的 提取、提纯等工艺，但鲜有对多糖生物合成相关功能基因的报道。此外，对于具 有更显著生物活性的真菌中药中华被毛孢多糖，也还只停留在提取、代谢产物成 分分析和功效的研究上，而对其生物合成代谢途径中相关基因和蛋白的研究还很 少；仅有中国专利CN113430186A公开了一种来自真菌中药的果糖激酶及其编码 基因和应用，因此，亟需提供更多关于真菌中药中华被毛孢多糖合成相关的功能 基因，为提高中华被毛孢多糖合成的产量提供更多选择。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种来自真 菌中药中华被毛孢的己酮糖激酶。
本发明的第二个目的在于提供所述中华被毛孢己酮糖激酶的编码基因。
本发明的第三个目的在于提供所述中华被毛孢己酮糖激酶及其编码基因的 应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明基于基因组与转录组测序初步得到了真菌中药中华被毛孢的己酮糖 激酶，进一步通过对中华被毛孢参与D-果糖-1-磷酸出发合成虫草多糖主要前体 单糖D-果糖的己酮糖激酶(ketohexokinasee，EC:2.7.1.3)及其编码基因进行深 入研究，提供了中药中华被毛孢参与D-果糖-1-磷酸出发合成虫草多糖主要前体 单糖D-果糖的己酮糖激酶、编码基因及其应用。
本发明首先提供一种来自真菌中药中华被毛孢的己酮糖激酶，其氨基酸序列 如A)或B)所示：
A.SEQ ID NO:1所示氨基酸序列；
B.以上A经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，与A所限 定的氨基酸序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％ 或99％同源性的仍具有相同功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。
本发明提供了一种来自真菌中药中华被毛孢的D-果糖-1-磷酸出发合成虫草 多糖主要前体单糖D-果糖的己酮糖激酶，所述酶具有SEQ ID NO:1所示氨基酸 序列70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同源性， 优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(记为ket蛋白)；该酶可催化D-果糖-1- 磷酸制备D-果糖。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO:1所示氨基 酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只 要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在70％、75％、80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上，均属于本发明保护范围之列。 具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变 体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用 亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
由D-果糖-1-磷酸生物合成D-果糖的路径如下所示：
因此本发明还提供所述中华被毛孢己酮糖激酶在生物催化D-果糖-1-磷酸制 备D-果糖中的应用。
进一步地，所述应用为将中华被毛孢己酮糖激酶、中华被毛孢己酮糖激酶体 外重组蛋白或中华被毛孢己酮糖激酶的重组菌发酵培养获得的湿菌体经细胞破 碎后的破碎混合液为催化剂，以D-果糖-1-磷酸为底物，制备D-果糖。
本发明还提供一种真菌中药己酮糖激酶的编码基因，其核苷酸序列如A)至 C)中的任意一种：
A.SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；
B.严格条件下与A所限定的核苷酸杂交，且编码SEQ ID NO:1所示氨基酸 的核苷酸序列；
C.与A所限定的核苷酸序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％或99％同源性，且编码SEQ ID NO:1所示氨基酸的核苷酸序列。
本发明还提供上述中华被毛孢己酮糖激酶的编码基因，即己酮糖激酶基因， 所述基因具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列70％、75％、80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％或99％以上同源性，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示(记 为ket基因)。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO:2所示多核苷酸的变 体，只要其与该多核苷酸具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％或99％以上同源性，且编码SEQ ID NO:1所示氨基酸的核苷酸序列均属于本 发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的 多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括 取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多 核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质 上改变其编码的肽蛋白的功能。
所述己酮糖激酶基因可用于构建能够生物催化D-果糖-1-磷酸制备D-果糖的 基因工程菌用于直接催化或分离纯化得到充足的己酮糖激酶重组蛋白，以用于进 一步催化D-果糖-1-磷酸制备D-果糖，提高D-果糖或其衍生物的产量。
本发明还提供含有所述己酮糖激酶基因的重组表达载体。
本发明还提供含有所述重组表达载体的重组菌。
本发明还提供所述己酮糖激酶基因、所述重组表达载体或所述重组菌在构建 能够生物催化D-果糖-1-磷酸制备D-果糖的基因工程菌或真菌中药己酮糖激酶重 组蛋白中的应用。
进一步地，所述应用为构建含有所述中华被毛孢己酮糖激酶基因的重组表达 载体，将重组表达载体转化至宿主表达菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培 养，培养液分离纯化获得含有中华被毛孢己酮糖激酶的菌体细胞或再分离纯化得 到中华被毛孢己酮糖激酶重组蛋白。
本发明的重点在于提供SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:2所 示的核苷酸序列及其功能应用，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该 氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域 技术人员来说均是显而易见的。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种来自真菌中药中华被毛孢的己酮糖激酶及其编码基因，所 述真菌中药中华被毛孢己酮糖激酶其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码 基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述真菌中药中华被毛孢己酮糖激酶参 与D-果糖-1-磷酸出发合成虫草多糖主要前体单糖D-果糖。本发明所提供的己酮 糖激酶编码基因可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过 调节D-果糖生物合成基因的表达，赋予宿主D-果糖的高表达性，为扩大D-果糖 或其衍生物多糖的产量提供了有效途径。
附图说明
图1为真菌中药中华被毛孢己酮糖激酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图。
图2为重组表达质粒pET-28a/ket物理图谱。
图3为己酮糖激酶SDS-PAGE图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1真菌中药中华被毛孢总RNA的提取
提取真菌中药中华被毛孢的总RNA利用TRIzol试剂，具体实验步骤如下： (1)采用液氮进行研磨：1g新鲜菌体中反复加入液氮，并且充分研磨至粉末状， 将其分装至预冷的1.5mL离心管中，用1mL TRIzol进行混匀，于冰上静置5min， 使蛋白复核酸合物得到完全分离。(2)RNA的分离：向管中加入0.2mL氯仿， 震荡混匀15s后，于冰上静置2～3min，在4℃、12000rpm条件下离心15min， 分层后取上层水相。(3)RNA的沉淀：向管中加入500μL异丙醇后，于冰上静 置10min，在4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清。(4)RNA的洗涤：向 管中加入1mL 75％(v/v)乙醇，悬起沉淀，于冰上静置10min，在7500rpm、4℃ 条件下离心15min；重复以上洗涤步骤。(5)RNA的溶解：将管子放于冰上， 敞开干燥5～10min，加适量DEPC水进行溶解。
实施例2真菌中药中华被毛孢RNA样品的测序
首先，提取真菌中药样品的总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集其 mRNA。并加入fragmentation buffer将其mRNA打断成短片段(150～700bp)，以 mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条其cDNA链，然后再合成第二条 cDNA链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化后，并加入EB缓冲液洗脱，进行末 端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳选择片段大小，最后 进行PCR扩增，建好的测序文库采用Illumina GA IIx进行测序。
实施例3真菌中药中华被毛孢RNA短读序列的组装及Unigene的功能注释
首先，使用SOAPdenovo短reads组装软件(Li,Zhu et al.De novo assembly ofhuman genomes with massively parallel short read sequencing[J].Genome Res,2010, 20:265-272.)从头组装转录组。其次，采用paired-end reads方法对Scaffold做补洞处理，最后得到两端不能再延长、含N最少的Unigene序列。其次，利用蛋白 数据库Swiss-Prot、nr、COG和KEGG对Unigene序列进行blastx比对 (evalue<0.00001)，采用比对结果最好的蛋白确定Unigene的序列方向。如不同 数据库之间的比对结果有矛盾，则按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的优先级确 定Unigene的序列方向。
接着，将得到Unigene的蛋白功能注释、Pathway注释、COG功能注释和GeneOntology(GO)功能注释。通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库 nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(evalue<0.00001)，得到跟给定Unigene具有最 高序列相似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。
实施例4真菌中药中华被毛孢多糖生物合成途径的分析
根据KEGG代谢途径注释中的果糖和甘露糖代谢途径(map00051)，已注释 的酶是已检测到的真菌中药中国被毛孢果糖和甘露糖代谢途径相关酶类，检测到 了从D-果糖-1-磷酸出发合成虫草多糖主要前体单糖D-果糖的己酮糖激酶1个 Unigene。通过NCBI中的ORFFinder软件在线检测，找出了这个基因的开放阅 读框(SEQ ID NO:2)并得到了相应的蛋白质序列(SEQ ID NO:1)。
实施例5真菌中药中华被毛孢己酮糖激酶ket基因引物设计
运用GENE RUNNER引物设计软件根据预测得到的基因开放阅读框DNA 序列设计引物，用于克隆真菌中药中华被毛孢合成代谢虫草多糖主要前体单糖 D-果糖的己酮糖激酶基因(SEQ ID NO:2)，引物由苏州泓迅生物科技有限公司 合成，引物序列如下所列：
ket基因：正向引物：5’ATA GAA TTC ATG CTG CGC GCG ACG 3’
反向引物：5’AGG AAG CTT TCA CTA GAC GAC GTA 3’
ket基因长度为720bp。
实施例6真菌中药中华被毛孢cDNA第一链的制备
按照实施例1所提供的方法对真菌中药中华被毛孢进行总RNA的提取，得 到总RNA后按下述进行真菌中药中华被毛孢cDNA第一链的合成，用于后续各 基因克隆实验。
采用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)从TotalRNA 中反转录合成cDNA第一链，实验步骤如下：
(1)在Microtube管中配制下列混合液。
(2)变性、退火操作有利于模板RNA的变性以及反转录引物和模板的特异 性退火，可提高反转录反应效率，所以在PCR仪上进行变性、退火反应，条件 设置如下：65℃，5min。
(3)退火后离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底 部。
(4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。
(5)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应。
42℃ 15～30min
70℃ 15min
一般情况，在真核生物mRNA 3’末端都有一个PolyA结构，A碱基的数量 在十至几百个不等，利用这一结构可以利用Oligo(dT)引物，在反转录酶的作用 下，以mRNA为模板合成cDNA第一链。本发明采用由TaKaRa独自开发的dT 区域的序列为引物，如果获得的mRNA完整性较好，那么通过逆转录过程可以 得到物种中所有酶蛋白编码基因的cDNA第一链。
实施例7真菌中药中华被毛孢合成代谢虫草多糖主要前体单糖D-果糖的己酮糖激酶ket基因的克隆、表达以及蛋白活力的检测
1、己酮糖激酶ket基因的PCR扩增
以实施例6中得到的cDNA第一链为模板，用实施例5中合成的ket基因引 物5’-ATAGAA TTC ATG CTG CGC GCG ACG-3’、5’-AGG AAG CTT TCA CTA GAC GAC GTA-3’进行PfuDNA聚合酶PCR扩增反应，反应条件设置如下：
Pfu PCR扩增反应体系：
Pfu DNA Ploymerase PCR扩增条件：
2、己酮糖激酶ket基因PCR产物凝胶电泳检测
具体检测方法为：(1)将配制好的0.9％的琼脂糖凝胶用微波炉加热使其溶 解均匀；(2)取15mL凝胶，待凝胶冷却至50℃左右时，加入1μL染色液Gold view， 混合均匀后倒入电泳凝胶板上，除去气泡后插入点样梳；(3)凝胶凝固后，小心 取出点样梳，将胶板放入电泳槽中，在电泳槽中加入TAE电泳缓冲液；(4)取5μL 样品然后加入6×Loading Buffer1.5μL和ddH2O 4μL混合后用移液枪上样，上样 量为10μL；(5)连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色； (6)开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm；(7)当样品跑过胶板的2/3 时可终止电泳；(8)切断电源后，将凝胶取出放入凝胶成像仪中观察、拍照。
转录组测序预测己酮糖激酶ket基因的大小为720bp，琼脂糖凝胶电泳结果 表明已成功扩增出了己酮糖激酶ket基因，实际大小与预测大小一致，见图1， 测序显示序列与SEQ ID NO:2一致。
3、己酮糖激酶ket基因PCR产物的加碱基A处理以及纯化
由于Pfu DNA聚合酶PCR产物末端为平端，所以在胶回收后还需进行加碱 基A处理、纯化后才可用于T载体连接。胶回收产物加碱基A体系如下：
PCR仪中72℃加A碱基20min，最后用AxyPrep PCR清洁试剂盒纯化。
4、己酮糖激酶ket基因与克隆载体的连接
克隆载体pMD18-T Vector购自TaKaRa公司(TaKaRa code D101A)，将己 酮糖激酶ket基因与克隆载体连接构建重组质粒pMD18-T/ket连接体系和连接条 件如下：
连接体系：
连接条件：16℃，16h；灭活：65℃，15min。
5、己酮糖激酶ket重组质粒pMD18-T/ket的转化
将重组质粒pMD18-T/ket转入大肠杆菌E.coli JM109中构建分别携带己酮 糖激酶ket基因的重组菌E.coli JM109/pMD18-T/ket。具体步骤为：⑴将10μL反 应体系转至感受态细胞E.coli JM109中，冰浴30min；⑵热击：42℃，90s；⑶ 冰浴：2-3min；⑷加入800μL液体LB，37℃，250rpm，1h；⑸涂布平板(含 Amp抗性)；⑹37℃培养箱培养过夜。
6、己酮糖激酶E.coli JM109/pMD18-T/ket阳性重组菌的筛选
菌落PCR可不必提取基因组DNA，而直接以菌体热解后暴露的DNA为模 板进行PCR扩增，该方法操作简便、快捷、可以快速鉴定菌落是否为含有目的 质粒的阳性菌落，在转化、鉴定中较为常见。
在实验中，将接种到液体培养基中对应的单菌落进行菌落PCR，用于验证 是否正确转入目的基因。首先，用牙签挑取单菌落加入含50μL无菌水的1.5mL 离心管中，沸水浴30min。然后，离心以上清液作为模板，进行PCR扩增，PCR 程序设定为Taq酶扩增一般程序。最后采用0.9％的琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR 产物。
7、己酮糖激酶重组质粒pMD18-T/ket的测序
对菌落PCR检测出的阳性重组菌液体LB培养基培养过夜后，取4mL菌液 提取质粒，方法按AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提供的操作说明。测序由苏州 泓迅生物科技有限公司完成。经测序验证，序列SEQ ID NO:2已经重组至 pMD18-T/ket中。
8、己酮糖激酶重组表达质粒pET-28a/ket的构建
实验根据外源基因在大肠杆菌中表达的原则，以及表达载体pET-28a和己酮 糖激酶ket基因酶切位点比对情况，确定了EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点，并对 重组大肠杆菌E.coli JM109/pMD18-T/ket进行液体LB试管摇床培养、重组质粒 提取。
己酮糖激酶ket基因的重组质粒pMD18-T/ket及表达载体pET-28a用 EcoRⅠ/HindⅢ限制性内切酶在37℃分别酶切处理6h，酶切体系如下所示：
EcoRⅠ/HindⅢ双酶切体系：
酶切结束后65℃灭活15min，然后分别用Axygen DNA凝胶回收试剂盒进 行回收、纯化。
己酮糖激酶ket基因及表达载体pET-28a经双酶切、纯化后再用T4连接酶 16℃连接过夜，构建重组表达质粒pET-28a/ket，构建得到的己酮糖激酶重组表达 质粒pET-28a/ket图谱见图2。连接体系组成如下：
连接体系：
9、己酮糖激酶重组表达质粒pET-28a/ket的转化以及阳性单克隆的筛选
分别将构建好的己酮糖激酶重组表达质粒pET-28a/ket热激转化至E.coli BL21宿主菌中，然后涂布到含有卡那霉素(Kan)抗性(50mg/L)的LB琼脂 平板上，37℃培养过夜。从平板上随机挑选单菌落，以各功能基因的引物进行 PCR扩增，挑选阳性克隆。
10、己酮糖激酶重组菌E.coli BL21/pET-28a/ket的诱导表达
将鉴定为阳性的单克隆接种于5mL含有Kan抗性(50mg/L)的LB液体培 养基中，37℃、250r/min培养过夜。取1mL培养物，将其转接于50mL含有Kan 抗性(50mg/L)的LB液体培养基中37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600约 为0.6～0.8左右。向培养物中分别加入一定浓度(240mg/L)的IPTG诱导培养 8h。收集菌体供电泳分析以及酶活检测。
11、己酮糖激酶重组菌E.coli BL21/pET-28a/ket表达产物SDS-PAGE分析
以转入空载体的E.coli BL21菌及未加入诱导剂IPTG的重组菌作为对照。 鉴定为阳性的重组菌经IPTG诱导培养一定时间(8h)后，取0.5mL诱导培养物， 离心收集菌体，重悬于50μL蒸馏水中，加入50μL上样缓冲液，混匀后煮沸10min， 进行SDS-PAGE电泳分析，图3为重组菌E.coli BL21/pET-28a/ket表达的己酮糖 激酶ket(经测序验证其氨基酸序列为SEQID NO:1所示)的SDS-PAGE图。
12、己酮糖激酶重组菌E.coli BL21/pET-28a/ket的蛋白活性检测
酶液制备：称取收集的重组菌E.coli BL21/pET-28a/ket湿菌体0.5g(干重0.1g)用磷酸盐缓冲液(50mM、pH8.0)15mL悬浮，超声破碎(功率360W、破碎2s、 间隔2s、共超声破碎6min)后用作催化用酶。
己酮糖激酶ket转化体系：在50mL转化瓶中加入E.coli BL21/pET-28a/ket 超声破碎菌体10mL、0.1g的D-果糖-1-磷酸，30℃、150r/min转化2～3h，转化 结束后，离心取上清备以后续检测。
经过检测和计算表明，己酮糖激酶重组菌E.coli BL21/pET-28a/ket所表达的 己酮糖激酶对底物(D-果糖-1-磷酸)的最优转换数约为6.8S-1，表明此酶对底物 具有良好的催化效率，可生物催化D-果糖-1-磷酸制备D-果糖。
序列表
<110> 北京中医药大学深圳医院（龙岗）（深圳市龙岗区中医院）
<120> 中华被毛孢己酮糖激酶及其编码基因和应用
<141> 2021-11-02
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 239
<212> PRT
<213> 中华被毛孢(Hirsutella sinensis)
<400> 1
Leu Arg Ala Thr Ser Leu Ala Val Arg Arg Gly Gly Asn Cys Pro Asn
1 5 10 15
Thr Leu Glu Val Leu Glu Gln Leu Leu Ala Ala His Arg Asp Pro Glu
20 25 30
Asp Asp Val Gly Thr His Leu Val Ser Pro Leu Pro Ala Arg Ser Ser
35 40 45
Pro Ala Thr Gly Arg Ile Leu Ala Ser Phe Gly Pro Arg Ala Arg Ala
50 55 60
Asp Phe Ala His Cys Leu Tyr Arg Asp Ala Cys Ser Glu Pro Ala Ser
65 70 75 80
Ser Tyr Ile Ile Arg Ser Glu Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ile Val Asn
85 90 95
His Ser Cys Leu Pro Glu Met Thr Ala Arg Glu Phe Glu Gly Val Val
100 105 110
Gly Ala Phe Val Ser His Pro Asp Ser Trp Trp His Phe Glu Gly Arg
115 120 125
Ile Pro Glu Thr Thr Leu Ala Cys Ile Arg Leu Leu Arg Asn Arg Leu
130 135 140
Pro Ala Ala Arg Ile Ser Val Glu Leu Glu Lys Pro Gly Arg Gln Gly
145 150 155 160
Leu Thr Glu Leu Ala Ala Glu Ala Asp Val Val Phe Tyr Ser Arg Ser
165 170 175
Trp Ala Glu Ser Arg Gly His Gln Ser Ala Glu Ala Cys Leu Thr Gly
180 185 190
Glu Gln Arg Arg Gln Arg Ser Leu Gly Leu Cys Thr Trp Gly Ala Asp
195 200 205
Gly Ala Ala Ala Met Ser Gln Pro Phe Gly Lys Cys Leu Cys Phe Pro
210 215 220
Val Glu His Gln Pro Gly Gly Ile Ser Val Val Glu Tyr Val Val
225 230 235
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> 中华被毛孢(Hirsutella sinensis)
<400> 2
ctgcgcgcga cgagcctcgc cgtccgccgc ggaggcaact gtcccaacac gctcgaggtc 60
ctcgagcagc tcctcgccgc ccaccgggac cccgaagacg atgtcggcac gcatctcgtc 120
tcccccctcc cggcgcggtc ctcgcccgcc accggccgca ttctcgcctc ctttgggccc 180
cgggcccgcg ccgactttgc ccactgcctc taccgcgacg cgtgctccga gcctgccagc 240
agctacatca tccgcagcga ggccacgggc agccgcacca tcgtcaacca cagctgtctg 300
cccgagatga cggcccgcga gttcgagggc gtcgtgggcg cctttgtctc gcaccccgac 360
tcttggtggc actttgaggg tcgcatccca gaaacaacgc tggcctgcat ccgcctgctg 420
cgaaaccgcc tgcccgcagc ccgcatcagc gttgaactgg agaagccagg ccgccagggc 480
ctcaccgagt tggcggccga agccgacgtt gtattttact ccaggtcttg ggccgagagc 540
cgcggccacc agtctgccga agcatgtctc accggcgagc agcgacgaca aaggtccctg 600
ggcctgtgta cctggggcgc agacggcgcg gcggccatgt ctcagccctt tgggaaatgt 660
ctttgcttcc ccgtcgagca ccaacctgga ggaatttccg tcgtcgagta cgtcgtctag 720

Claims (8)

1. 一种中华被毛孢己酮糖激酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述中华被毛孢己酮糖激酶在生物催化D-果糖-1-磷酸制备D-果糖中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为将权利要求1所述中华被毛孢己酮糖激酶、或其体外重组蛋白或其重组菌发酵培养获得的湿菌体经细胞破碎后的破碎混合液为催化剂，以D-果糖-1-磷酸为底物，制备D-果糖。
4. 权利要求1所述中华被毛孢己酮糖激酶的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.含有权利要求4所述中华被毛孢己酮糖激酶的编码基因的重组表达载体。
6.含有权利要求5所述重组表达载体的重组菌。
7.权利要求4所述编码基因、权利要求5所述重组表达载体或权利要求6所述重组菌在构建能够生物催化D-果糖-1-磷酸制备D-果糖的基因工程菌或中华被毛孢己酮糖激酶重组蛋白中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用为构建含有权利要求4所述中华被毛孢己酮糖激酶基因的重组表达载体，将重组表达载体转化至宿主表达菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有中华被毛孢己酮糖激酶的菌体细胞或再分离纯化得到中华被毛孢己酮糖激酶重组蛋白。
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