CN118086232A - 一种惕佫酰假托品合成酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种惕佫酰假托品合成酶突变体及其应用，涉及生物技术领域，突变体TSS40T相较于野生型TS存在以下突变：第40位氨基酸由丝氨酸突变为苏氨酸，突变体TSS40T的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。大肠杆菌中半合成惕佫酰假托品合成反应式如下：；TSS40T的活性显著高于野生型TS，可以利用生物合成的方式生产惕佫酰假托品。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种惕佫酰假托品合成酶突变体及其应用。
背景技术
托品烷生物碱（Tropane Alkaloid，TA）是一类来源于茄科植物的天然产物，可作为作用于副交感神经的抗胆碱药物。目前托品烷生物碱仍完全依赖于从少数茄科药用植物中提取，包括颠茄（Atropa belladonna）、 曼陀罗（Daturastramonium）和莨菪（Hyoscyamusniger）。其中的惕佫酰假托品（3β-tigloyloxytropane），CAS号为495-83-0，也被称为替格列定（tigloidine），被认为在治疗帕金森症、亨廷顿舞蹈病和痉挛性截瘫等神经退行性疾病中具有潜在的应用价值，且比现有药物阿托品的副作用更小。但是，野生植物中惕佫酰假托品的含量极低，仅为托品烷生物碱资源植物干重的0.005-0.02%，获取困难，严重阻碍了相关药物的开发和应用。
惕佫酰假托品是假托品（3β-tropanol）衍生的托品烷生物碱，其结构由惕佫酸和假托品两个基本单元组成。已有研究发现颠茄根的总蛋白具有催化惕佫酰辅酶A和假托品合成惕佫酰假托品的活性，因此推测植物中的惕佫酰假托品可能由BAHD-酰基转移酶催化，该反应以惕佫酰辅酶A为酰基供体，以假托品为酰基受体，发生酰基转移，从而合成惕佫酰假托品。但目前为止，关于催化该反应的BAHD-酰基转移酶基因仍未被报道。BAHD-酰基转移酶基因的发现是采用生物合成方式生产惕佫酰假托品所必须的。
发明内容
为解决现有技术不足，本发明提供一种惕佫酰假托品合成酶突变体及其应用，提高酶活性，可以利用生物合成方式生产惕佫酰假托品。
为了实现本发明的目的，拟采用以下方案：
第一方面，本发明提供一种惕佫酰假托品合成酶突变体，相较于野生型惕佫酰假托品合成酶存在以下突变：第40位氨基酸由丝氨酸突变为苏氨酸，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
第二方面，本方明提供一种编码上述惕佫酰假托品合成酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示。
第三方面，本方明提供一种表达载体，所述表达载体包括编码上述惕佫酰假托品合成酶突变体的基因。
第四方面，本方明提供一种基因工程菌，所述基因工程菌包括上述表达载体。进一步的，所述基因工程菌为大肠杆菌。
第五方面，本方明提供一种惕佫酰假托品合成酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建表达载体，所述表达载体包括惕佫酰假托品合成酶突变体基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示；
S2、转化基因工程菌，诱导目标蛋白表达、纯化，得到惕佫酰假托品合成酶突变体。
更具体的说，制备方法包括以下步骤：
S1、获得惕佫酰假托品合成酶突变体基因TSS40Topt，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO:4所示；使用引物BamHI-TSopt-F和PstI-TSopt-R扩增TSS40Topt，并将其构建到原核表达载体pMAL-c5x上获得载体pMAL-TSS40Topt；
S2、转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，获得菌株BL21- pMAL-TSS40Topt，诱导目标蛋白表达、纯化，得到惕佫酰假托品合成酶突变体。
第六方面，本方明提供一种所述惕佫酰假托品合成酶突变体在合成惕佫酰假托品中的应用。
第七方面，本方明提供一种所述惕佫酰假托品合成酶突变体在烟草中从头合成惕佫酰假托品中的应用。
第八方面，本方明提供一种所述惕佫酰假托品合成酶突变体在大肠杆菌中半合成惕佫酰假托品中的应用。
来源于绿针假单胞菌的异丁酰辅酶A连接酶PcICS具有体外催化活性：以惕佫酸和辅酶A为底物合成惕佫酰假托品的前体化合物惕佫酰辅酶A。
所述惕佫酰假托品合成酶突变体以惕佫酰辅酶A和假托品为底物合成惕佫酰假托品，同时释放辅酶A进入下一轮催化。
大肠杆菌中半合成惕佫酰假托品合成反应式如下：
。
本发明的有益效果在于：
1、对野生型TS的第40位进行突变，TSS40T的活性显著高于野生型TS，突变体TSS40T对假托品和惕佫酰辅酶A的催化效率均显著提高，可以利用生物合成的方式生产惕佫酰假托品。
2、本发明一种以工程化大肠杆菌为底盘的惕佫酰假托品半合成路线：PcICS使用外源饲喂的惕佫酸和大肠杆菌内源的游离辅酶A合成惕佫酰辅酶A，再在TSS40T的催化下与外源供给的假托品发生酰基转移反应，高效合成惕佫酰假托品，同时释放辅酶A进入下一轮催化。
附图说明
图1为实施例的假托品提取离子流色谱图；
图2为实施例的惕佫酰假托品质谱图；
图3为实施例的包含底物假托品和惕佫酰辅酶A的催化口袋图；
图4为实施例的假托品结合口袋中的关键氨基酸残基图；
图5为实施例的TS和TSH162A的相对活性比较图；
图6为实施例的TS和假托品结合残基突变体的相对活性比较图；
图7为实施例的TS催化假托品酯化物合成的催化机制图；
图8为实施例的一致性蛋白设计图；
图9为实施例的TS假托品进入通道周围的氢键网络图；
图10为实施例的TSS40T假托品进入通道周围的氢键网络图；
图11为实施例的酶活分析图；
图12为实施例的惕佫酰假托品生物合成途径的重建图；
图13为实施例的目标代谢产物分析图；
图14为实施例的托品酮含量图；
图15为实施例的古豆碱含量图；
图16为实施例的假托品含量图；
图17为实施例的惕佫酰假托品含量图；
图18为实施例的大肠杆菌中半合成惕佫酰假托品的生物合成途径图；
图19为实施例的惕佫酰假托品的产量分析图；
图20为实施例的惕佫酰辅酶A提取离子流色谱图；
图21为实施例的惕佫酰辅酶A质谱图。
具体实施方式
实施例1、惕佫酰假托品合成酶TS的克隆与功能鉴定
取适量颠茄须根组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1 .5mL Eppendorf（EP）离心管中，充分振荡后，使用天根生化科技(北京) 有限公司的植物总RNA提取试剂盒DP419提取RNA；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，在分光光度计上测定RNA浓度；以所提取的总RNA为模板，按照天根生化科技（北京）有限公司的FastKing cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA；设计一对基因特异性引物用于从颠茄总cDNA中扩增TS基因，引物序列如下：
TS-F：5’- atggcctcagctgcattgaa -3’
TS-R：5’- ctaaaaataatttgcatatggag -3’。
PCR产物回收后连接pMD 19-T质粒，经测序，获得TS基因序列，序列如SEQ ID NO:1所示。
为了获得足够的蛋白质用于生化表征，根据大肠杆菌的密码子优化TS的编码序列，形成密码子优化版本序列，命名为TSopt，基因序列如SEQ ID NO:3所示。设计一对具有BamHI和PstI限制性位点的引物（BamHI-TSopt-F：5’- cgcGGATCCATGGCAAGCGCGGCCCTGAA -3’；PstI-TSopt-R：5’-cgcCTGCAGctcgagAAAATAATTTGCATACG -3’）扩增TSopt的编码序列，然后将其插入pMAL-c5x以获得原核表达质粒pMAL-TSopt；然后，将质粒pMAL-TSopt转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，获得原核表达菌株BL21-pMAL-TSopt；将其接种在LB液体培养基中，37°C震荡培养至OD600为0.5；加入终浓度为0.25 mM的IPTG，在16°C震荡培养16h，诱导目的蛋白表达；再使用淀粉树脂 Amylose Resin（Smart-Lifesciences）纯化MBP标记的TS蛋白；脱盐后，立即把新鲜蛋白质用于酶活测定；酶活反应体系（总体积50μl）含20μg纯化的TS、1mM 假托品、1mM惕佫酰辅酶A和50mM Tris-HCl（pH 7.2）；热失活的TS用作阴性对照；反应1h，向反应体系中加入等体积甲醇终止反应，混匀后12000 rpm离心，取上清经过滤后用LC-MS（ThermalOrbitrap 120）分析产物；柱温设定为35 ℃，流速0.3 mL/min，进样量3 μL，质谱检测器使用电喷雾离子源（ESI），离子模式为正离子模式。
酶活分析结果表明，TS可催化假托品和惕佫酰辅酶A生成产物惕佫酰假托品（如图1所示），其[M+H]+m/z值为224.1645（图2所示，保留时间为7.67 min，与惕佫酰假托品标准品一致。当TS被加热失活后加入上述反应体系中，未检测到相应的产物。
实施例2
为了探究TS的催化机制，本研究使用Alphafold2预测TS蛋白质模拟结构，并使用Autodock Vina构建TS、假托品和惕佫酰辅酶A的酶底复合物结构。研发人员观察到该家族的保守基序HXXXD中的His162与假托品的氧原子形成氢键，距离约为3.0 Å，可能作为TS催化口袋中的碱性催化剂（如图3所示）。此外，观察到由His162、Ile35、Gln39、Asn298、Leu300、Tyr280和Trp340共同形成的假托品结合口袋（如图4所示）。研发人员推测，His162首先脱去酰基受体底物（假托品）3位羟基上的质子，从而引发其对酰基供体（惕佫酰辅酶A）羰基碳的亲核攻击，辅酶A随后以离去基团的形式从四面体中间体中释放出来，惕佫酰假托品形成（如图7所示）。为了检验这些氨基酸残基在底物结合口袋中的作用，本研究对这些位点进行了丙氨酸扫描分析。委托生物公司合成大肠杆菌密码子优化且相应位点分别被突变为丙氨酸的突变体。使用引物BamHI-TSopt-F和PstI-TSopt-R分别扩增其编码区，将其构建到原核表达载体pMAL-c5x上并转化大肠杆菌BL21，诱导目标蛋白的表达并纯化；再通过体外底物饲喂，评估这些突变体与野生型TS的相对酶活性。结果显示，当His162突变为丙氨酸时，TSH162A完全失去了催化活性（如图5所示）；分别将Ile35、Gln39、Tyr280、Asn298、Leu300和Trp340突变为丙氨酸，突变体相比于野生型TS的催化活性均极显著降低（如图6所示， **表示在P<0.01的独立样本t检验中，野生型TS与其突变体组之间存在显著差异）。从上述结果可知，His162作为关键催化残基，在TS的催化中发挥不可或缺的的作用。
实施例3、定向进化提高TS的催化活性
为了进一步提高TS的催化活性，采用了一致性蛋白设计。以TS为饵蛋白，在NCBI的非冗余蛋白质序列数据库中进行BlastP，获得与TS氨基酸相似性大于50%的全部序列；将TS和上述序列进行氨基酸序列比对；使用Alphafold2预测TS蛋白质模型，并基于对TS蛋白质模型以关键催化残基His162为中心的5Å范围内的残基进行的保守取代分析，观察到只有Ser40（丝氨酸）不符合保守取代模型（如图8所示）；虚拟突变预测发现，Ser40突变为保守取代模型中的Thr40（苏氨酸）会改变假托品周围的氢键网络，Thr40与空间上相邻的无规则卷曲上的Asn135生成了新的氢键，有助于底物口袋的稳定（如图9、图10所示）。
委托生物公司合成大肠杆菌密码子优化且第40位氨基酸突变为苏氨酸的基因TSS40Topt，该基因序列如SEQ ID NO:4所示。使用引物BamHI-TSopt-F和PstI-TSopt-R扩增TSS40Topt，并将其构建到原核表达载体pMAL-c5x上获得载体pMAL-TSS40Topt；转化大肠杆菌BL21，获得菌株BL21- pMAL-TSS40Topt，诱导表达目标蛋白表达、纯化并开展酶动力学分析；结果显示，TSS40T的活性显著高于野生型TS（如图11所示）。如下表1所示，TS和TSS40T对假托品的Km值分别为0.36 mM和0.32 mM，Kcat值分别为6.84 s-1和11.09 s-1；TS和TSS40T对惕佫酰辅酶A的Km值均为0.02mM，Kcat分别为7.38 s-1和11.42 s-1；TSS40T对假托品和惕佫酰辅酶A的催化效率分别是野生型TS的1.85倍和1.69倍。
表1 TS和TSS40T的酶动力学常数测定结果
实施例4、在烟草中从头合成惕佫酰假托品
为了评估TS在惕各酰假托品生物合成中的功能以及其在植物合成生物学的应用，研发人员在N. benthamiana叶片中从头构建了惕各酰假托品生物合成途径。根据TS原始DNA序列，委托生物公司合成第40位氨基酸突变为苏氨酸的基因TSS40T，基因序列如SEQ IDNO:2所示。将已报道的假托品合成上游基因（EnODC、AbPMT、AbMPO、AbPYKS、AbCYP82M3和DsTRII）和惕佫酰假托品合成酶（TS和TSS40T）分别构建到pEAQ-HT载体上。引物如下：
AgeI-TS-F：5’- cgcggatccaatgcgtgattatgaacatgttgt -3’
XhoI-TS-R：5’- cgcctcgagacccagggcctgctgttttg -3’
AgeI-EnODC-F：5’- cgcaccggtatgggttcgaacgccag -3’
XhoI-EnODC-R：5’- cgcctcgagctacggattggaataggc -3’
AgeI-AbPMT-F：5’- cgcaccggtatggaggtcataagcaa -3’
XhoI-AbPMT-R：5’- cgcctcgagtcaaaactcaaccaaa -3’
AgeI-AbPYKS-F：5’- cgcaccggtatgaagttggaaaat -3’
XhoI-AbPYKS-R：5’- cgcctcgagttaaatgggcacactac -3’
AgeI-AbCYP82M3-F：5’- cgcaccggtatgtatgataattttctc -3’
XhoI-AbCYP82M3-R：5’- gcgctcgagctaaaattcataaagcacag -3’
AgeI-DsTRII-F：5’- cgcaccggtatggctggaaggtggaatcttga -3’
XhoI-DsTRII-R：5’- cgcctcgagttaaaaaccacaattagccataagtcc -3’
再通过农杆菌GV3101介导的瞬时转化在烟草叶片中共表达上述基因（如图12所示）。以转化黄色荧光蛋白（YFP）的烟草叶片作为阴性对照。转化5天后收获烟草叶片，并使用LC-MS分析惕佫酰假托品和前体代谢物的含量。
共表达假托品合成上游基因（EnODC、AbPMT、AbMPO、AbPYKS、AbCYP82M3和DsTRII）和突变体TS的烟草叶片中检测到了托品酮、古豆碱、假托品和惕佫酰假托品（如图13-图17所示）。对照组叶片中未检测到惕各酰假托品和相关中间体。把TS换成突变体TSS40T，惕佫酰假托品的含量提高至使用TS时的2.33倍，为6.14 μg.g-1DW（如图17所示）。该结果不仅证实了使用烟草等植物异源生产惕佫酰假托品的可行性，而且TSS40T比TS具有更高的代谢工程价值。
实施例5、在大肠杆菌中半合成惕佫酰假托品
为了评估TS/TSS40T在微生物合成生物学中的应用，本研究设计了大肠杆菌中惕佫酰假托品的半合成路线（如图18所示）。
首先，本研究期望表达TS或TSS40T的大肠杆菌工程菌株能以惕佫酸（Tiglic Acid）和假托品为底物合成惕佫酰假托品。设计一对带SacI和HindIII酶切位点的一对引物：
SacI-TSopt-F：5’- cgcgagctcatggcaagcgcggccctgaa -3’
HindIII-TSopt-R：5’- cgcaagcttaaaataatttgcatacggacttgc -3’
使用上述引物分别扩增TSopt和TSS40Topt，并分别构建在pETDuet-1的多克隆位点1（MCS1），获得载体pETDuet-TSopt和pETDuet-TSS40Topt，转化BL21感受态，获得工程菌株BL21-pETDuet-TSopt和BL21-pETDuet-TSS40Topt；向含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中分别接种上述菌株，37 °C振荡培养至OD600为0.5，加入终浓度为0.05 mM的IPTG和终浓度为250 mg.L-1的假托品和惕佫酸；16°C下继续振荡培养，每隔6小时取1ml培养基，离心过滤菌体后，使用LC-MS分析惕佫酰假托品含量。结果显示，未检测到惕佫酰假托品的产生。推测可能是大肠杆菌中缺少可以将惕佫酸与游离辅酶A连接合成惕佫酰辅酶A的酶，惕佫酰辅酶A供应不足，从而未能成功合成惕佫酰假托品（如图19所示）。
然而，以惕佫酸和游离辅酶A为底物，催化合成惕佫酰辅酶A的基因目前未见报道。考虑到辅酶A连接酶普遍具有一定的底物宽泛性，研发人员选择了一个来源于绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）的异丁酰辅酶A连接酶（Isobutyryl CoA synthetase，PcICS）基因作为候选基因，该基因被报道以惕佫酸的类似化合物异丁酸和游离辅酶A为底物合成异丁酰辅酶A。委托生物公司合成大肠杆菌密码子优化的PcICSopt，PcICSopt基因序列如SEQ ID NO:5所示，使用一对具有BamHI和XhoI限制性位点的引物扩增PcICSopt的编码序列并将其插入质粒pET28a，获得pET28a-PcICSopt。引物如下：
BamHI-PcICSopt-F：5’- cgcggatccatgcgtgattatgaacatgttgt -3’
XhoI-PcICSopt-R：5’- cgcctcgagacccagggcctgctgttttg -3’
然后，将质粒pET28a-PcICSopt转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，获得原核表达菌株BL21-pET28a-PcICSopt；将其接种在LB液体培养基中，37°C震荡培养至OD600为0.5；加入终浓度为0.25 mM的IPTG，在16°C震荡培养16h，诱导目的蛋白表达；再使用HisPur-Ni-NTA树脂（Thermo Fisher Scientific）纯化6×His标记的PcICS蛋白；脱盐后，立即把新鲜蛋白质用于酶活测定；酶活反应体系（总体积50μl）含20μg纯化的PcICS、1mM 惕佫酸、1mM游离辅酶A和50mM Tris-HCl（pH 7.2）；热失活的PcICS用作阴性对照；反应1h，向反应体系中加入等体积甲醇终止反应，混匀后12000 rpm离心，取上清经过滤后用LC-MS（Thermal Orbitrap120）分析产物。柱温设定为35 ℃，流速0.3 mL/min，进样量3 μL，质谱检测器使用电喷雾离子源（ESI），离子模式为负离子模式。酶活分析结果表明， PcICS可催化惕佫酸和游离辅酶A生成产物惕佫酰辅酶A（如图20所示），其[M-H]-m/z值为848.15027，[M-2H]2-m/z值为423.57172（如图21所示），保留时间为7.14 min，与惕佫酰辅酶A标准品一致。阴性对照中未检测到相应的产物。
接下来，用一对含BglII和XhoI的引物扩增PcICS并将其插入到载体pETDuet-TSopt和pETDuet-TSS40Topt的多克隆位点2（MCS2）上，获得质粒pETDuet-TSopt-PcICSopt和pETDuet-TSS40Topt-PcICSopt。引物如下：
BglII-PcICS-F：5’- cgcagatctaatgcgtgattatgaacatgttgt -3’
XhoI-PcICS-R：5’- cgcctcgagacccagggcctgctgttttg -3’
将上述质粒转化BL21感受态，获得工程菌株BL21-pETDuet-TSopt-PcICSopt和BL21-pETDuet-TSS40Topt-PcICSopt；向含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中分别接种上述菌株，37 °C振荡培养至OD600为0.5，加入终浓度为0.05 mM的IPTG和终浓度为250 mg.L-1的假托品和惕佫酸；16°C下继续振荡培养，每隔6小时取1ml培养基，离心过滤菌体后，使用LC-MS分析惕佫酰假托品含量。结果显示，BL21-pETDuet-TSopt-PcICSopt和BL21-pETDuet-TSS40Topt-PcICSopt两种工程菌株都可以利用外源饲喂的惕佫酸和假托品合成惕佫酰假托品（如图19所示）。其中BL21-pETDuet-TSS40Topt-PcICS在饲喂底物60 h后惕佫酰假托品产量达到最高，为357.4 mg.L-1，摩尔转化率达90.9%。
已有研究认为惕佫酰辅酶A是异亮氨酸降解代谢物，在生物体内极其痕量，是制约惕佫酰假托品最终生产效率的关键因素。因此，设计高效的惕佫酰辅酶合成路线也对惕各酰假托品的生产至关重要。总的来说，本研究设计并验证了一种以工程化大肠杆菌为底盘的惕佫酰假托品半合成路线（如图18所示）：PcICS使用外源饲喂的惕佫酸和大肠杆菌内源的游离辅酶A合成惕佫酰辅酶A，再在TSS40T的催化下与外源供给的假托品发生酰基转移反应，高效合成惕佫酰假托品，同时释放辅酶A进入下一轮催化。
以上实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，并不表示是唯一的或是限制本发明。本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的范围情况下，对本发明进行的各种改变或同等替换，均属于本发明保护的范围。
Claims (12)
1.一种惕佫酰假托品合成酶突变体，其特征在于，相较于野生型惕佫酰假托品合成酶存在以下突变：第40位氨基酸由丝氨酸突变为苏氨酸，所述突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。
2.一种惕佫酰假托品合成酶突变体基因，其特征在于，用于编码权利要求1所述惕佫酰假托品合成酶突变体，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示。
3.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求2所述惕佫酰假托品合成酶突变体基因。
4.一种基因工程菌，其特征在于，包括权利要求3所述表达载体。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌。
6.一种惕佫酰假托品合成酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建表达载体，所述表达载体包括惕佫酰假托品合成酶突变体基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示；
S2、转化基因工程菌，诱导目标蛋白表达、纯化，得到惕佫酰假托品合成酶突变体。
7.权利要求1所述惕佫酰假托品合成酶突变体在合成惕佫酰假托品中的应用。
8.权利要求1所述惕佫酰假托品合成酶突变体在烟草中从头合成惕佫酰假托品中的应用。
9.权利要求1所述惕佫酰假托品合成酶突变体在大肠杆菌中半合成惕佫酰假托品中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，来源于绿针假单胞菌的异丁酰辅酶A连接酶PcICS，以惕佫酸和辅酶A为底物合成惕佫酰假托品的前体化合物惕佫酰辅酶A。
11.根据权利要求9所述应用，其特征在于，PcICS以惕佫酸和辅酶A为底物合成惕佫酰辅酶A，所述惕佫酰假托品合成酶突变体以惕佫酰辅酶A和假托品为底物合成惕佫酰假托品，同时释放辅酶A进入下一轮催化。
12.根据权利要求9所述应用，其特征在于，合成反应式如下：
。
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