CN111826357B

CN111826357B - 三分三非典型iii型聚酮合酶及其应用

Info

Publication number: CN111826357B
Application number: CN201910299608.1A
Authority: CN
Inventors: 肖友利; 李国强; 平羽; 杨盟权
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2021-11-19
Anticipated expiration: 2039-04-15
Also published as: CN111826357A

Abstract

本发明公开了一种三分三非典型III型聚酮合酶AaPYKS，该AaPYKS能够高效地催化N‑甲基‑Δ¹‑吡咯啉与丙二酰辅酶A进行缩合反应来制备4‑(1‑甲基‑2‑吡咯烷基)‑3‑氧代丁酸，反应条件温和，具有工业化开发前景。

Description

三分三非典型III型聚酮合酶及其应用

技术领域

本发明属于生物催化和代谢工程技术领域，具体地说，涉及一种三分三非典型III型聚酮合酶AaPYKS及其在制备4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸中的应用。

背景技术

托品酮(Tropinone)是一个莨菪烷类生物碱，可用于合成阿托品硫酸盐等药物。式III所示化合物4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸是莨菪生物碱的生物合成途径中生成托品酮的重要前体，目前主要从植物中提取得到。

近年来发展的合成生物学技术，通过微生物菌株作为底盘细胞，将目标化合物生物合成途径相关基因导入，实现了植物来源的一些重要药用化合物的异源高效合成(Kotopka BJ,Li Y,Smolke CD.2018.Synthetic biology strategies towardheterologous phytochemical production.Natural product reports.Li S,Li Y,Smolke CD.2018.Strategies for microbial synthesis of high-valuephytochemicals.Nature chemistry 10(4):395-404.)，建立4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的生物合成方法不仅能弥补化学合成方法的不足之处，同时也为以4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸为中间体的尼古丁及托品生物碱的途径解析及异源合成提供基础，对于大规模生产莨菪生物碱具有重要的经济意义。

聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)可以催化式I所示的N-甲基-Δ¹-吡咯啉(N-methylpyrrolinium)与式II所示的丙二酰辅酶A(Malonyl-CoA)发生反应形成化合物III。

茄科植物三分三(Anisodus acutangulus)是我国特有的产托品类生物碱的资源植物，又名三分七、野箊，其干燥品总生物碱含量高达1.2％，托品生物碱总含量比常见的一些茄科植物如颠茄、莨菪、曼陀罗等都要高(Kai G,Zhang A,Guo Y,Li L,Cui L,Luo X,LiuC,Xiao J.2012.Enhancing the production of tropane alkaloids in transgenicAnisodus acutangulus hairy root cultures by over-expressing tropinonereductase I and hyoscyamine-6β-hydroxylase.Molecular BioSystems 8(11):2883-2890.)，并且其转录组数据也被发表(Cui L,Huang F,Zhang D,Lin Y,Liao P,Zong J,KaiG.2015.Transcriptome exploration for further understanding of the tropanealkaloids biosynthesis in Anisodus acutangulus.Molecular Genetics&Genomics290(4):1367-1377.)，因此利用独特生物资源优势对于三分三中与化合物III的生物合成有关的酶类的研究非常重要。

众所周知，化学法合成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸存在环境污染大的问题，导致开发环境友好型的绿色制备工艺很有必要。因此具有反应条件温和、催化效率高、副产物少等优点的生物制备法比如生物酶催化法成为有吸引力和有前途的方法。

发明内容

我们对植物三分三中与4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的合成相关的酶类的功能进行了研究，发现一种三分三非典型III型聚酮合酶(命名为AaPYKS)可以高效催化N-甲基-Δ¹-吡咯啉与丙二酰辅酶A反应生成目标产物III。

这一发现丰富了现有的生物元件库，进一步完善了三分三莨菪生物碱的生物合成途径，可以为莨菪生物碱的途径解析及异源合成提供基础，促进重要药用生物碱的生物合成方法开发。

为了实现4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的生物合成，我们从三分三中筛选出一种氨基酸序列为SEQ ID NO:1的三分三非典型III型聚酮合酶AaPYKS，进行体外催化底物N-甲基-Δ¹-吡咯啉与丙二酰辅酶A的缩合反应，验证了其功能。由于大肠杆菌的遗传背景比较清晰，并且遗传操作容易，我们选其作为底盘细胞探究4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的体内从头合成，希望为工业生产4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸及4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸来源重要生物碱的异源合成提供基础。

其中，SEQ ID NO:1的序列为：

MKLENGQKFGRVHERAEGPAKILAIGTATPFHWVDQSSYPDYYFRVTNSDHLVDLKEKFRRICNRTMISKRHMFLTEEILKKNPNLCSHNEPSFDVRQDILVSEIPKLGKEAALMAIDEWAQPKSKITHLVFCTRSGVDMPGADYQLIKLLGLSPSVQRLMMYQQGCFAGGTMLRLAKDLAENNKGARILVVCAESSAIGFRGPSEPHPDNLIAQALFGDGAAALIIGSDLKPGLERPIFEIVTASQTFVPNGDCHLALHLREMGLTFHCTKDVPPTIAKNVESCLIKAFEPLGISDWNSIFWILHPGGNAIVDQVESTLGLEPNKLRATRNILREYGNLSSACVLFILDEIRKKSGREGLKTSGDGLDLGVLLSFGPGLTIETVVLRSVPI(SEQ ID NO:1)。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种分离的多肽，所述的多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与(a)限定的多肽序列有95％以上同源性，优选地98％以上同源性，更优地99％以上同源性，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。

为表述方便起见，将氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽命名为“三分三非典型III型聚酮合酶”或者“AaPYKS”。

本发明的第二个目的在于提供编码上述多肽的多核苷酸(或称基因)。上述的多核苷酸选自：

(A)编码上述多肽的多核苷酸；

(B)编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(C)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸；

(D)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的同源性≥95％，优选地≥98％，更优地≥99％的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

其中，编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽的多核苷酸序列为SEQ ID NO:2：

ATGAAGTTGGAAAATGGTCAAAAATTTGGGAGGGTTCATGAGAGAGCTGAGGGTCCTGCAAAAATTTTAGCCATTGGAACAGCAACACCTTTCCATTGGGTTGATCAAAGCTCCTATCCTGATTATTATTTCAGGGTTACAAATAGTGACCATTTGGTGGACCTCAAAGAAAAATTTAGACGTATCTGTAACAGAACAATGATTAGCAAGAGGCACATGTTTTTGACAGAGGAAATATTAAAGAAAAATCCGAATTTGTGCTCTCACAATGAGCCATCCTTTGATGTCAGGCAGGACATTTTGGTTTCAGAAATACCAAAACTTGGAAAAGAGGCTGCCCTTATGGCAATTGATGAATGGGCTCAGCCCAAATCCAAAATTACCCATTTAGTCTTTTGCACAAGAAGTGGTGTTGACATGCCCGGTGCAGATTACCAATTAATTAAGCTATTGGGCCTAAGCCCATCAGTTCAACGTTTAATGATGTACCAACAAGGTTGCTTTGCTGGTGGCACGATGCTTAGATTGGCCAAGGACTTAGCTGAGAATAACAAGGGTGCTAGGATACTTGTCGTGTGTGCTGAGAGCTCAGCCATAGGGTTTCGCGGGCCTAGTGAACCTCATCCGGATAACCTAATCGCGCAAGCATTGTTTGGAGATGGAGCGGCCGCTCTTATAATTGGATCGGACCTTAAACCGGGCCTAGAAAGGCCCATTTTCGAGATAGTCACGGCGTCCCAAACATTTGTCCCTAACGGGGACTGTCACCTCGCGTTACACCTACGTGAAATGGGCCTTACATTTCATTGTACCAAGGATGTACCACCAACTATTGCGAAAAATGTTGAGAGTTGCTTAATAAAGGCGTTTGAACCTTTGGGAATTTCAGATTGGAACTCGATCTTTTGGATTCTTCATCCAGGAGGTAATGCAATTGTGGACCAAGTCGAGAGTACATTGGGCCTAGAGCCCAATAAGTTACGGGCCACAAGAAATATCCTTCGAGAATATGGCAATTTGTCAAGTGCATGTGTGTTATTCATATTGGATGAGATTAGAAAGAAATCTGGTAGAGAAGGGCTGAAGACTTCAGGAGATGGGCTGGACTTGGGAGTCCTTTTATCATTTGGGCCTGGGCTTACGATTGAGACAGTTGTGCTTCGTAGTGTGCCCATTTGA(SEQ ID NO:2)。

本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的载体比如质粒。

本发明的第四个目的在于提供转化了上述载体比如质粒的微生物。

优选地，上述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草杆菌。更优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第五个目的在于提供上述多肽(比如三分三非典型III型聚酮合酶)、或者微生物在制备4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸中的用途。

在一种实施方式中，上述用途是以N-甲基-Δ¹-吡咯啉和丙二酰辅酶A为底物原料，在上述多肽(比如三分三非典型III型聚酮合酶)催化下通过缩合反应来制备4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸。

优选地，上述的酶催化反应的反应温度为25-35℃、优选30℃，并且在pH6.5-7.5、优选pH6.8的反应体系中进行缩合反应。优选反应体系为缓冲溶液体系。

本发明的上述多肽(比如三分三非典型III型聚酮合酶AaPYKS)能够以N-甲基-Δ¹-吡咯啉和丙二酰辅酶A为底物，通过缩合反应合成出4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸。这样，本发明为4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的生物法制备提供了一种新的技术构思，由于酶催化反应具有条件温和、绿色环保的优点，具备工业化开发和应用前景。

附图说明

图1显示了AaPYKS基因片段的琼脂糖凝胶电泳照片。

图2显示了AaPYKS纯化蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳照片。

图3显示了的液质联用仪(LC/MS)检测AaPYKS催化反应产物4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的液相质谱图。其中i是反应组；ii是蛋白煮沸(失活)组。

图4显示了4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的离子碎片结果。

图5显示了pET-24a-AaPYKS质粒的结构示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。

本发明的三分三非典型III型聚酮合酶AaPYKS由于氨基酸序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

上述转化体宿主可以是任何适合表达三分三非典型III型聚酮合酶SEQ ID NO:1的微生物，括细菌和真菌。优选微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草杆菌。更优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

当作为生物催化剂用于生产4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸时，本发明的三分三非典型III型聚酮合酶AaPYKS可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

本发明的三分三非典型III型聚酮合酶AaPYKS的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由上海桑尼生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.2，121℃高温高压灭菌20min。

液质联用仪(LC/MS)检测条件：

1)仪器型号：二维液相飞行时间质谱联用仪QTOF6545

2)色谱柱规格：Agilent 300 extend-C18(4.6×150mm，3.5μm)

3)操作条件：温度设定为40℃

流动相A(H₂O+0.1％甲酸)

流动相B(乙腈+0.1％甲酸)

流速：0.35ml/min

洗脱程序：0-1min,2％B；1-2min,2-3％B；2-10min,3-5％B；10-10.5min，5-95％B；10.5-13.5min,95％B；13.5-14min,95-2％B；14-17min,2％B

质谱所用模式：正离子模式；扫描分子量范围：70-1000m/z

其他参数：集率：1.2spectra/s；采集时间：833.3ms/spectrum；气体温度：300℃；

干燥气体：6L/min；雾化器：35psig；vcap:4000V；fragmentor:135V；skimmer:65V；oct 1RF Vpp:750V。用于MS碎片分析的碰撞能量为20V和40V。

实施例1三分三非典型III型聚酮合酶基因的克隆

1.1总RNA的提取与检测

打开超净台和紫外灯，用乙醇烧研钵、钥匙、剪刀。剪下三分三毛状根100mg，液氮中将组织研磨成粉末，分装至Ep管中，液氮挥发后加1ml Trizol-x-100，立即用力震荡或用移液器吹吸5-8次(没有块状物为止)，室温静置5min；用等体积氯仿抽提2次，7500g离心15min；上清液加入等体积提前预冷的异丙醇，混匀后室温放置30min，4℃、10000g离心10min；沉淀加入1ml 75％乙醇进行清洗，4℃、10000g离心10min；沉淀室温干燥10min后溶于25μl DEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用Eppendorf核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。

1.2反转录合成cDNA

采用TakaRa公司提供的PrimeScript反转录试剂盒，合成三分三mRNA第一条互补链cDNA。

1.3三分三非典型III型聚酮合酶(AaPYKS)基因的克隆

根据三分三转录组数据，通过序列比对分析，利用snapGene软件设计一对扩增引物。

正向pET24a-AaPYKS-F(BamH I)：

CGGGATCCATGAAGTTGGAAAATGGTCAAAAATTTGG(SEQ ID NO:3)；

反向pET24a-AaPYKS-R(Xho I)：

CCGCTCGAGAATGGGCACACTACGAAGCACAACTGT(SEQ ID NO:4)。

以三分三的cDNA为模板，按照以下体系[5×phusion buffer 4.0μl，dNTP(2.5mM)1.6μl，引物(2μM)各2μl，DMSO 0.6μl，cDNA 0.5μl，Phusion DNA聚合酶0.2μl，补加ddH₂O至终体积20.0μl]扩增AaPYKS基因，反应程序：98℃预变性30s，98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸1min 30s，30个循环，72℃终延伸5min，16℃保存。扩增的基因片段的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。利用Axygen公司的Agarose Gel Fragment Recovery KitVer.2.0纯化PCR产物，并送上海桑尼公司测序，测序引物为pET24a-AaPYKS-F(BamH I)和pET24a-AaPYKS-R(Xho I)。获得三分三AaPYKS基因序列(SEQ ID NO:2)。

实施例2三分三非典型III型聚酮合酶表达质粒的构建

2.1将测序正确的AaPYKS基因片段用Nano-300仪器测浓度，浓度为105ng/μl。

2.2将AaPYKS用BamHI和XhoI进行双酶切，双酶切反应体系(50μl)如下：H₂O，33μl；10x buffer，5μl；AaPYKS基因片段，10μl；BamHI，1μl；XhoI，1μl(实验所用的限制性内切酶购买自Themro公司)。37℃水浴酶切2h，再利用Axygen公司的Agarose Gel FragmentRecovery Kit Ver.2.0纯化酶切后产物，测得浓度为45ng/μl。

2.3质粒pET-24a(+)为本实验室已有载体，其浓度为50ng/μl。将pET-24a(+)载体用BamHI和XhoI进行双酶切，双酶切反应体系(50μl)如下：H₂O，33μl；10x buffer，5μl；pET-24a(+)载体，10μl；BamHI，1μl；XhoI，1μl(实验所用的限制性内切酶及其缓冲液购买自Themro公司)。37℃水浴酶切2h，再利用Axygen公司的Agarose Gel Fragment RecoveryKit Ver.2.0纯化酶切后产物，测得浓度为10ng/μl。

2.4将双酶切后的AaPYKS基因片段与pET-24a(+)载体进行连接，连接反应体系(10μl)如下：双酶切后AaPYKS基因片段，6.2μl；双酶切后pET-24a(+)载体，0.8μl；5x buffer，2μl；T4连接酶，1μl(实验所用的连接酶及其缓冲液购买自Themro公司)。在25℃条件下连接2h。

2.5将10μl连接产物添加到100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上30min，42℃静置90s，冰上2min。再加入800μl无抗LB，放在37℃，220rpm摇床上复苏1h。3000rpm离心1min，去除800μl上清，剩下100μl上清重悬菌体，涂Kan+抗性平板，放37℃培养箱培养12h。挑单菌落做菌落PCR验证，将正确的阳性克隆挑到5ml Kan+抗性LB试管中，37℃，220rpm摇床培养12h。

2.6将培养12h后的DH5α菌从摇床中取出，使用Axygen公司质粒小提试剂盒进行质粒抽提，抽提完的质粒使用Nano-300测浓度为115ng/μl。并送上海桑尼公司测序，测序引物为通用引物：T7-P和T7-ter，获得pET-24a-AaPYKS质粒。

所构建的pET-24a-AaPYKS质粒的结构如图5所示。

实施例3三分三非典型III型聚酮合酶的表达

3.1将构建好的pET-24a-AaPYKS质粒(浓度为120ng/μl)取1μl，添加到100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰上30min，42℃静置90s，冰上2min。再加入800μl无抗LB，放在37℃，220rpm摇床上复苏1h。3000rpm离心1min，去除800μl上清，剩下100μl上清重悬菌体，涂Kan⁺抗性平板，放37℃培养箱培养12h。挑单菌落做菌落PCR验证，将正确的阳性克隆挑到5ml Kan⁺抗性LB试管中，37℃，220rpm摇床培养6h。将5ml菌体全部转接至1L Kan⁺抗性LB摇瓶中，37℃，220rpm摇床培养。待菌体OD值达到0.6时，加入终浓度为0.3mM的IPTG进行蛋白诱导，在16℃，220rpm摇床中诱导16h。再在4℃，8000rpm，8min条件下收集菌体，收集的菌体放-20℃冰箱保存。

3.2三分三非典型III型聚酮合酶AaPYKS蛋白纯化

取10g菌体，加入50ml 50mM PBS缓冲液(含100mM NaCl，5％甘油)，在冰上重悬菌体。利用细胞破碎仪在4℃，700bar压力，5min条件下进行菌体破碎。18000rpm，离心30min，取全部上清与2mlNi柱结合，再利用25ml 50mM PBS缓冲液(含100mM NaCl，5％甘油)，25ml15mM咪唑、25ml 35mM咪唑、25ml 50mM咪唑、25ml 500mM咪唑溶液梯度洗脱目的蛋白，用SDS-PAGE检测，凝胶电泳检测结果如图2所示。

将500mM咪唑溶液洗脱下来的蛋白用10kDa大小的浓缩管在4℃，2900g离心力条件下进行浓缩。待蛋白体积浓缩至2.5ml时，将蛋白过P10脱盐柱，用3ml 50mM PBS缓冲液(含100mM NaCl，5％甘油)洗脱，并用Bradford法测定蛋白浓度，200μl体积分装到1.5ml EP管中。液氮冷冻，并放-80℃冰箱保存。

纯化的AaPYKS蛋白送北京百泰派克生物科技有限公司进行测序验证，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

实施例4三分三非典型III型聚酮合酶的活性测试

在磷酸缓冲液(10mM，pH 6.8)中配制酶反应体系，反应体积为50μl，包括2mM N-甲基-Δ¹-吡咯啉(NMP)，2mM丙二酰辅酶A(Malonyl-CoA)，20μM实施例3中得到的AaPYKS。在30℃反应20min，再加入50μl终止液(200mM甲酸铵+2％甲酸+2％甲醇)来终止反应。上清过0.22μm滤膜后，利用高分辨质谱进行检测。

检测结果参见图3和图4，图3显示了AaPYKS催化丙二酰辅酶A与N-甲基-Δ¹-吡咯啉反应生成目标产物4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸(如曲线i所示)，但失活的AaPYKS蛋白没有催化活性(如曲线ii所示)。图4的离子碎片验证了产物是目标化合物4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸。

实施例4的结果表明，本发明的三分三非典型III型聚酮合酶SEQ ID NO:1能够有效地催化丙二酰辅酶A与N-甲基-Δ¹-吡咯啉反应生成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸。本领域技术人员显然容易理解，与化学合成法相比，本发明的生物合成法具有绿色环保的天然优势，因而具有工业化开发和应用前景。

还需说明的是，本说明书中对先前公开的文献的列举和论述不应视为承认该文献是现有技术或者是公知常识。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 三分三非典型III型聚酮合酶及其应用

<130> SHPI1910187

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 392

<212> PRT

<213> Anisodus acutangulus

<400> 1

Met Lys Leu Glu Asn Gly Gln Lys Phe Gly Arg Val His Glu Arg Ala

1 5 10 15

Glu Gly Pro Ala Lys Ile Leu Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Phe His

20 25 30

Trp Val Asp Gln Ser Ser Tyr Pro Asp Tyr Tyr Phe Arg Val Thr Asn

35 40 45

Ser Asp His Leu Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Arg Arg Ile Cys Asn

50 55 60

Arg Thr Met Ile Ser Lys Arg His Met Phe Leu Thr Glu Glu Ile Leu

65 70 75 80

Lys Lys Asn Pro Asn Leu Cys Ser His Asn Glu Pro Ser Phe Asp Val

85 90 95

Arg Gln Asp Ile Leu Val Ser Glu Ile Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala

100 105 110

Ala Leu Met Ala Ile Asp Glu Trp Ala Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr

115 120 125

His Leu Val Phe Cys Thr Arg Ser Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp

130 135 140

Tyr Gln Leu Ile Lys Leu Leu Gly Leu Ser Pro Ser Val Gln Arg Leu

145 150 155 160

Met Met Tyr Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Met Leu Arg Leu

165 170 175

Ala Lys Asp Leu Ala Glu Asn Asn Lys Gly Ala Arg Ile Leu Val Val

180 185 190

Cys Ala Glu Ser Ser Ala Ile Gly Phe Arg Gly Pro Ser Glu Pro His

195 200 205

Pro Asp Asn Leu Ile Ala Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala

210 215 220

Leu Ile Ile Gly Ser Asp Leu Lys Pro Gly Leu Glu Arg Pro Ile Phe

225 230 235 240

Glu Ile Val Thr Ala Ser Gln Thr Phe Val Pro Asn Gly Asp Cys His

245 250 255

Leu Ala Leu His Leu Arg Glu Met Gly Leu Thr Phe His Cys Thr Lys

260 265 270

Asp Val Pro Pro Thr Ile Ala Lys Asn Val Glu Ser Cys Leu Ile Lys

275 280 285

Ala Phe Glu Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn Ser Ile Phe Trp Ile

290 295 300

Leu His Pro Gly Gly Asn Ala Ile Val Asp Gln Val Glu Ser Thr Leu

305 310 315 320

Gly Leu Glu Pro Asn Lys Leu Arg Ala Thr Arg Asn Ile Leu Arg Glu

325 330 335

Tyr Gly Asn Leu Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asp Glu Ile

340 345 350

Arg Lys Lys Ser Gly Arg Glu Gly Leu Lys Thr Ser Gly Asp Gly Leu

355 360 365

Asp Leu Gly Val Leu Leu Ser Phe Gly Pro Gly Leu Thr Ile Glu Thr

370 375 380

Val Val Leu Arg Ser Val Pro Ile

385 390

<210> 2

<211> 1179

<212> DNA

<213> Anisodus acutangulus

<400> 2

atgaagttgg aaaatggtca aaaatttggg agggttcatg agagagctga gggtcctgca 60

aaaattttag ccattggaac agcaacacct ttccattggg ttgatcaaag ctcctatcct 120

gattattatt tcagggttac aaatagtgac catttggtgg acctcaaaga aaaatttaga 180

cgtatctgta acagaacaat gattagcaag aggcacatgt ttttgacaga ggaaatatta 240

aagaaaaatc cgaatttgtg ctctcacaat gagccatcct ttgatgtcag gcaggacatt 300

ttggtttcag aaataccaaa acttggaaaa gaggctgccc ttatggcaat tgatgaatgg 360

gctcagccca aatccaaaat tacccattta gtcttttgca caagaagtgg tgttgacatg 420

cccggtgcag attaccaatt aattaagcta ttgggcctaa gcccatcagt tcaacgttta 480

atgatgtacc aacaaggttg ctttgctggt ggcacgatgc ttagattggc caaggactta 540

gctgagaata acaagggtgc taggatactt gtcgtgtgtg ctgagagctc agccataggg 600

tttcgcgggc ctagtgaacc tcatccggat aacctaatcg cgcaagcatt gtttggagat 660

ggagcggccg ctcttataat tggatcggac cttaaaccgg gcctagaaag gcccattttc 720

gagatagtca cggcgtccca aacatttgtc cctaacgggg actgtcacct cgcgttacac 780

ctacgtgaaa tgggccttac atttcattgt accaaggatg taccaccaac tattgcgaaa 840

aatgttgaga gttgcttaat aaaggcgttt gaacctttgg gaatttcaga ttggaactcg 900

atcttttgga ttcttcatcc aggaggtaat gcaattgtgg accaagtcga gagtacattg 960

ggcctagagc ccaataagtt acgggccaca agaaatatcc ttcgagaata tggcaatttg 1020

tcaagtgcat gtgtgttatt catattggat gagattagaa agaaatctgg tagagaaggg 1080

ctgaagactt caggagatgg gctggacttg ggagtccttt tatcatttgg gcctgggctt 1140

acgattgaga cagttgtgct tcgtagtgtg cccatttga 1179

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cgggatccat gaagttggaa aatggtcaaa aatttgg 37

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ccgctcgaga atgggcacac tacgaagcac aactgt 36

Claims

1.一种分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:1。

2.分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码如权利要求1所述的多肽。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，为SEQ ID NO:2。

4.包含如权利要求2所述多核苷酸的载体。

5.转化了如权利要求4所述载体的微生物。

6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草杆菌。

7.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.如权利要求1所述多肽、或者如权利要求5所述微生物在制备4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，以N-甲基-Δ¹-吡咯啉和丙二酰辅酶A为底物原料，在如权利要求1所述多肽催化下通过缩合反应来制备4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，反应温度为25-35℃。