CN113215186A - 光呼吸支路蛋白在调控植物性状中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及光呼吸支路蛋白在调控植物性状中的应用。具体地，本发明提供试剂组合和融合蛋白，所述试剂组合或融合蛋白包括乙醇酸氧化酶或其编码核酸和/或草酸氧化酶其编码核酸和/或过氧化氢酶其编码核酸。将本发明的试剂组合或融合蛋白导入植物细胞中可显著调控植物农艺性状。

Description

光呼吸支路蛋白在调控植物性状中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及光呼吸支路蛋白在调控植物性状中的应用，更具体地，涉及调控植物农艺性状的试剂组合和融合蛋白，及其在调控植物性状中的应用。
背景技术
光呼吸又称为C2循环，是指植物绿色组织利用光能，吸收O2并放出CO2的过程，光呼吸需要叶绿体、线粒体、过氧化物酶体和细胞质的共同参与，并依赖光和O2，两者缺一不可。光呼吸是C3植物中仅次于光合作用的第二大代谢流，正常环境条件下，C3植物光呼吸可消耗其光合产物的25～30％，而高温、干旱、高光等逆境条件下这种损耗会更为严重。高光呼吸不但会降低植物光合效率，而且其释放的CO2对大气的碳排放的贡献也不容小觑；据估测，植物呼吸作用每年能向大气排放30Gt左右的碳，其中大部分来自光呼吸。针对如何降低C3植物高呼吸，提高光能转化效率，科学家们已做了大量的研究探索，例如尝试提高Rubisco的羧化/加氧比或将C4光合机理导入C3植物，然而，局限于技术和理论基础，这两方面至今尚未获得预期效果。
近年来，通过在C3植物叶绿体中构建光呼吸代谢支路从而创建CO2浓缩机制(CCMs)已成为研究的热点。
然而，目前尚未有对粮食作物光呼吸进行代谢的报道。
因此，本领域迫切需与开发一种新的进一步调控植物农艺性状的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的进一步调控植物农艺性状的新方法。
本发明的另一目的在于提供一种新的调控植物农艺性状的试剂组合、方法或融合蛋白，所述的植物性状包括但不限于：(i)光呼吸；和/或(i i)光合速率；和/或(ii i)产量；和/或(iv)生物量；(v)叶绿素含量。进一步的，本发明的试剂组合、方法或融合蛋白可以抑制光呼吸、增强光合作用、提高产量和生物量、增加叶绿素含量。
本发明第一方面提供了一种试剂组合，包括：
(i)第一核酸构建物，或含有所述第一核酸构建物的第一载体，所述第一核酸构建物具有从5’-3’的式I或结构：
P1-Z1-Z2-Z3 (I)或
P1-Z2-Z1-Z3 (I’)
其中，P1为第一启动子，；
Z1为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z2为编码第一光呼吸代谢改造支路蛋白的编码序列，所述第一光呼吸代谢改造支路蛋白为乙醇酸氧化酶(GLO)；
Z3为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列；
(ii)第二核酸构建物，或含有所述第二核酸构建物的第二载体，所述第二核酸构建物具有从5’-3’的式II所示的结构：
P2-Z4-Z5-Z6 (II)或
P2-Z5-Z4-Z6 (II’)
其中，P2为第二启动子；
Z4为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z5为编码第二光呼吸代谢改造支路蛋白的编码序列，所述第二光呼吸代谢改造支路蛋白为草酸氧化酶(OXO)；
Z5为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列；和
(iii)第三核酸构建物，或含有所述第三核酸构建物的第三载体，所述第三核酸构建物具有从5’-3’的式III所示的结构：
P3-Z7-Z8-Z9 (III)或
P3-Z7-Z8-Z9 (III’)
其中，P3为第三启动子；
Z7为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z8为编码第三光呼吸代谢改造支路蛋白的编码序列，所述第三光呼吸代谢改造支路蛋白为过氧化氢酶(CATC)；
Z9为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列。
在另一优选例中，所述第一载体、第二载体、第三载体为相同或不同的载体。
在另一优选例中，所述第一核酸构建物、所述第二核酸构建物、所述第三核酸构建物位于相同的载体或不同的载体。
本发明第二方面提供了一种试剂组合，包括：
(i)第一核酸构建物，或含有所述第一核酸构建物的第一载体，所述第一核酸构建物具有从5’-3’的式I结构：
P1-Z1-Z2-Z3 (I)或
P1-Z2-Z1-Z3 (I’)
其中，P1为第一启动子；
Z1为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z2为编码融合蛋白的编码序列，所述融合蛋白选自下组：乙醇酸氧化酶+草酸氧化酶、乙醇酸氧化酶+过氧化氢酶、草酸氧化酶+过氧化氢酶、乙醇酸氧化酶+草酸氧化酶+过氧化氢酶、或其组合；
Z3为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列；
(ii)第二核酸构建物，或含有所述第二核酸构建物的第二载体，所述第二核酸构建物具有从5’-3’的式II所示的结构：
P2-Z4-Z5-Z6 (II)或
P2-Z5-Z4-Z6 (II’)
其中，P2为第二启动子；
Z4为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z5为编码第三元件的编码序列，所述第三元件为组成所述融合蛋白之外的元件，并且所述第三元件为乙醇酸氧化酶、草酸氧化酶、过氧化氢酶中的一种；
Z6为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列；
当Z2为乙醇酸氧化酶+草酸氧化酶+过氧化氢酶，第二核酸构建物不存在。
在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：GLO+OXO、GLO+CATC、OXO+CATC、GLO+OXO+CATC、或其组合。
在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：OsGLO+OsOXO、OsGLO+KatE、OsOXO+KatE、OsGLO+OsOXO+KatE、或其组合。
在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：OsGLO+OsOXO、OsGLO+OsCATC、OsOXO+OsCATC、OsGLO+OsOXO+OsCATC、或其组合。
在另一优选例中，所述第一启动子选自下组：CaMV 35S、U6、U3、NOS、OCS、Rac1、UBi、Act1、Rss1、Adh1、TA29、或其组合。
在另一优选例中，所述第二启动子选自下组：CaMV 35S、U6、U3、NOS、OCS、Rac1、UBi、Act1、Rss1、Adh1、TA29、或其组合。
在另一优选例中，所述第一载体、第二载体为相同或不同的载体。
在另一优选例中，所述核苷酸连接序列为1-200nt。
在另一优选例中，所述核苷酸连接序列不影响各元件的正常转录和翻译。
在另一优选例中，所述叶绿体信号肽选自下组：rbcS、TPC、RC1、PCS1、或其组合。
在另一优选例中，所述终止子选自下组：NOS终止子、UBQ终止子、或其组合。
在另一优选例中，所述第一核酸构建物、所述第二核酸构建物位于相同的载体或不同的载体。
在另一优选例中，所述GLO、OXO或CATC各自独立地来源于真核生物和/或原核生物。
在另一优选例中，所述GLO、OXO或CATC各自独立地来源于真菌(如酵母菌)、球菌、肠杆菌、弧菌属、厌氧性细菌、分枝杆菌、动物源性细菌。
在另一优选例中，所述GLO、OXO或CATC各自独立地来源于植物和/或微生物。
在另一优选例中，所述GLO、OXO或CATC各自独立地来源于单子叶植物或双子叶植物。
在另一优选例中，所述植物选自下组：十字花科、禾本科、豆科、茄科、伞形科、藜科、猕猴桃科、桑科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。
在另一优选例中，所述GLO、OXO或CATC各自独立地来源于选自下组的一种或多种植物：十字花科、禾本科、豆科、茄科、伞形科、藜科、猕猴桃科、桑科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科。
在另一优选例中，所述GLO、OXO或CATC各自独立地来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、马铃薯、甘薯、紫薯、山药、芋类、木薯、菊薯、水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、小米、大豆、花生、谷子、藜麦、番茄、烟草、油菜、白菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜、粟、花生、猕猴桃、棉花、草莓、牡丹、香水百合、郁金香、桑树、苹果、梨、桃、樱桃、石榴。
在另一优选例中，所述GLO、OXO或CATC各自独立地来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、小麦、大麦、水稻、马铃薯、大豆、玉米、番茄、高粱、小米。
在另一优选例中，所示CATC来源于大肠杆菌。
在另一优选例中，所述GLO选自下组：水稻的GLO3基因(OsGLO3，登录号Os04g0623500)、高粱的GLO3基因(SbGLO3，登录号LOC8074729)、小米的GLO3基因(SiGLO3，登录号GBYO01017938.1)、或其组合。。
在另一优选例中，所述OXO选自下组：水稻的OXO3基因(Os OXO3，登录号Os03g0693900)、高粱的OXO基因(SbOXO，登录号XP_002464052.1)、玉米的OXO基因(ZmOXO，登录号NM_001147384.1)、或其组合。
在另一优选例中，所述CATC选自下组：水稻的CATC基因(Os CATC，登录号Os03g0131200)、高粱的CATC基因(SbCAT，登录号XM_021448587.1)、小米的CATC基因(SiCAT，登录号XM_004985783.4)、大肠杆菌的KatE基因、或其组合。
在另一优选例中，所述乙醇酸氧化酶包括OsGLO3。
在另一优选例中，所述草酸氧化酶包括OsOXO3。
在另一优选例中，所述过氧化氢酶选自下组：OsCATC、KatE、或其组合。
在另一优选例中，所述GLO包括野生型的GLO和突变型的GLO。
在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)和功能增强的突变形式。
在另一优选例中，所述的突变型GLO基因编码的多肽与野生型GLO基因所编码的多肽相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的突变型GLO基因包括与野生型GLO基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地，≥98％或99％)的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的突变型GLO基因包括在野生型GLO基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。
在另一优选例中，所述GLO的氨基酸序列选自下组：
(i)具有SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多肽；
(ii)将如SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述GLO活性的由(i)衍生的多肽；或
(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有所述GLO活性的多肽。
在另一优选例中，所述编码GLO蛋白的GLO基因的核苷酸序列选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:1所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:2所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:2所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％)的多核苷酸；
(d)在SEQ ID NO.:2所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述OXO包括野生型的OXO和突变型的OXO。
在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)和功能增强的突变形式。
在另一优选例中，所述的突变型OXO基因编码的多肽与野生型OXO基因所编码的多肽相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的突变型OXO基因包括与野生型OXO基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地，≥98％或99％)的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的突变型OXO基因包括在野生型OXO基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。
在另一优选例中，所述OXO的氨基酸序列选自下组：
(i)具有SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的多肽；
(ii)将如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述OXO活性的由(i)衍生的多肽；或
(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有所述OXO活性的多肽。
在另一优选例中，所述编码OXO蛋白的OXO基因的核苷酸序列选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:3所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:4所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％)的多核苷酸；
(d)在SEQ ID NO.:4所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述CATC包括野生型的CATC和突变型的CATC。
在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)和功能增强的突变形式。
在另一优选例中，所述的突变型CATC基因编码的多肽与野生型CATC基因所编码的多肽相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的突变型CATC基因包括与野生型CATC基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地，≥98％或99％)的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的突变型CATC基因包括在野生型CATC基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。
在另一优选例中，所述CATC的氨基酸序列选自下组：
(i)具有SEQ ID NO.:5或7所示氨基酸序列的多肽；
(ii)将如SEQ ID NO.:5或7所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述CATC活性的由(i)衍生的多肽；或
(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:5或7所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有所述CATC活性的多肽。
在另一优选例中，所述编码CATC蛋白的CATC基因的核苷酸序列选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:5或7所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:6或10所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:6或10所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％)的多核苷酸；
(d)在SEQ ID NO.:6或10所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体为可转染或转化植物细胞的表达载体。
在另一优选例中，所述的载体为植物表达载体。
在另一优选例中，所述的载体为农杆菌Ti载体。
在另一优选例中，所述的载体为pCambia载体。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：pYL322d1、pYL322d2、pYL1305、pYLTAC380GW、或其组合。
在另一优选例中，所述载体是环状的或者是线性的。
本发明第三方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明第一方面或本发明第二方面所述的试剂组合。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有标签或说明书。
本发明第四方面提供了一种调控植物农艺性状的方法，包括步骤：
(i)提供一植物，作为亲代植物；
(ii)将本发明第一方面或本发明第二方面所述的试剂组合导入所述植物的植物细胞，从而调控植物农艺性状。
在另一优选例中，所述试剂组合中的第一核酸构建物或含所述第一核酸构建物的第一载体、第二核酸构建物或含所述第二核酸构建物的第二载体、第三核酸构建物或含所述第三核酸构建物的第三载体可先后、同时导入。
在另一优选例中，所述“植物的农艺性状”包括：
(i)光呼吸效率或速率；和/或
(ii)光合速率或效率；和/或
(iii)产量或；和/或
(iv)生物量；和/或
(v)叶绿素含量。
在另一优选例中，所述“调控植物的农艺性状”包括：
(i)提高光合速率或效率；和/或
(ii)降低光呼吸效率或速率；和/或
(iii)增加生物量；和/或
(iv)增加产量；和/或
(v)增加叶绿素含量。
在另一优选例中，所述植物细胞来自花、叶芽、胚、悬浮细胞系、愈伤组织、或其组合。
在另一优选例中，所述的愈伤组织用选自下组的植物细胞诱导形成：根、茎、叶、花、和/或种子的细胞。
在另一优选例中，所述导入为通过农杆菌导入。
在另一优选例中，所述导入为通过基因枪导入。
本发明第五方面提供了一种制备基因工程的植物细胞的方法，包括步骤：
(i)将本发明第一方面或本发明第二方面所述的试剂组合转染植物细胞，使得所述试剂组合中的所述构建物与所述植物细胞中的染色体发生重组，从而制得所述基因工程的植物细胞。
在另一优选例中，所述的转染采用农杆菌转化法或基因枪轰击法。
本发明第六方面提供了一种制备基因工程的植物细胞的方法，包括步骤：
(i)将本发明第一方面或本发明第二方面所述的试剂组合转染植物细胞，使得所述植物细胞含有所述试剂组合中的所述构建物，从而制得所述基因工程的植物细胞。
本发明第七方面提供了一种制备基因工程的植物的方法，包括步骤：
将本发明第五方面或本发明第六方面所述方法制备的所述基因工程的植物细胞再生为植物体，从而获得所述基因工程的植物。
本发明第八方面提供了一种基因工程的植物，所述的植物是用本发明第七方面所述的方法制备的。
本发明第九方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白的结构如下式I或I’所示：
A-B (I)或
B-A (I’)
式中，
A为叶绿体信号肽，
B为光呼吸代谢改造支路蛋白，所述光呼吸代谢改造支路蛋白选自下组的两种或两种以上：乙醇酸氧化酶(GLO)、草酸氧化酶(OXO)、过氧化氢酶(CATC)；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。
在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：GLO+OXO、GLO+CATC、OXO+CATC、GLO+OXO+CATC、或其组合。
在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：OsGLO+OsOXO、OsGLO+KatE、OsOXO+KatE、OsGLO+OsOXO+KatE、或其组合。
在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：OsGLO+OsOXO、OsGLO+OsCATC、OsOXO+OsCATC、OsGLO+OsOXO+OsCATC、或其组合。
在另一优选例中，所述乙醇酸氧化酶包括OsGLO3。
在另一优选例中，所述草酸氧化酶包括OsOXO3。
在另一优选例中，所述过氧化氢酶选自下组：OsCATC、KatE、或其组合。
在另一优选例中，所述非肽键包括PEG、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸、肝素或烷基接头。
在另一优选例中，所述叶绿体信号肽选自下组：rbcS、TPC、RC1、PCS1、或其组合。
在另一优选例中，所述连接肽的长度为1-100aa，较佳地，15-85aa，更佳地，25-70aa，更佳地，24-32aa。
在另一优选例中，所述连接肽的氨基酸序列选自下组：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.:9或11-16任一所示的多肽；
(2)将SEQ ID NO.:9或11-16任一所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(1)所述多肽功能的由SEQ ID NO.:9或11-16任一所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.:8所示的氨基酸序列。
本发明第十方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第九方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述的多核苷酸在所述融合蛋白的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。
在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列、或其组合。
本发明第十一方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第十方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。
在另一优选例中，所述载体为植物表达载体。
在另一优选例中，所述的载体为可转染或转化植物细胞的表达载体。
在另一优选例中，所述的载体为农杆菌Ti载体。
在另一优选例中，所述载体选自下组：pYL322d1、pYL322d2、pYL1305、pYLTAC380GW、或其组合。
在另一优选例中，所述的构建物整合到所述载体的T-DNA区。
在另一优选例中，所述载体是环状的或线性的。
本发明第十二方面提供了一种基因工程细胞，所述细胞含有本发明第十方面所述的多核苷酸，或其基因组整合有本发明第十方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的细胞为植物细胞。
在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。
在另一优选例中，所述植物选自下组：十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、茄科、猕猴桃科、桑科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：拟南芥、马铃薯、甘薯、紫薯、水稻、山药、芋类、木薯、菊薯、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、大麦、燕麦、粟、花生、猕猴桃、棉花、草莓、牡丹、香水百合、郁金香、桑树、苹果、梨、桃、樱桃、石榴、或其组合。
在另一优选例中，所述植物包括马铃薯、甘薯、紫薯、山药、芋类、木薯、菊薯。
在另一优选例中，所述的基因工程细胞是用选自下组的方法将权利要求10所述的多核苷酸导入细胞的：农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(PEG)介导法。
本发明第十三方面提供了一种产生本发明第九方面所述的融合蛋白的方法，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养本发明第十二方面所述的基因工程细胞，从而表达融合蛋白；和/或
分离所述融合蛋白。
本发明第十四方面提供了一种本发明第九方面所述的融合蛋白的用途，用于调控植物的农艺性状或制备调控植物的农艺性状的组合物或制剂，其中所述植物的农艺性状选自下组的一种或多种：
(i)光呼吸效率或速率；和/或
(ii)光合速率或速率；和/或
(iii)产量或；和/或
(iv)生物量；和/或
(v)叶绿素含量。
在另一优选例中，所述“调控植物的农艺性状”包括：
(i)降低光呼吸效率或速率；和/或
(ii)提高光合速率或效率；和/或
(iii)增加产量；和/或
(iv)增加生物量；和/或
(v)增加叶绿素含量。
在另一优选例中，所述组合物包括农用组合物。
在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。
在另一优选例中，所述植物选自下组：十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、茄科、猕猴桃科、桑科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：拟南芥、马铃薯、甘薯、紫薯、水稻、山药、芋类、木薯、菊薯、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、大麦、燕麦、粟、花生、猕猴桃、棉花、草莓、牡丹、香水百合、郁金香、桑树、苹果、梨、桃、樱桃、石榴、或其组合。
在另一优选例中，所述植物包括马铃薯、甘薯、紫薯、山药、芋类、木薯、菊薯。
本发明第十五方面提供了一种农用制剂，包括：
(a)本发明第九方面所述的融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体(vector)；和
(b)农学上可接受的载体(carrier)。
在另一优选例中，所述表达载体包括植物表达载体。
在另一优选例中，所述的载体为可转染或转化植物细胞的表达载体。
在另一优选例中，所述的载体为农杆菌Ti载体。
在另一优选例中，所述载体选自下组：pYL322d1、pYL322d2、pYL1305、pYLTAC380GW、或其组合。
在另一优选例中，在农用制剂中，组分(a)的含量0.01％-99％，较佳地，1％－50％，更佳地，10％－30％，以农用制剂的总重计。
在另一优选例中，所述农用制剂还包括其他调控农艺性状的物质。
在另一优选例中，所述其他控农艺性状的物质选自下组：光呼吸抑制剂、光合作用增强剂、或其组合。
在另一优选例中，所述光呼吸抑制剂选自下组：二氧化碳、乙醛酸、谷氨酸、天门冬氨酸、α-羟基磺酸盐、2，3-环氧乙酸、异烟肼、NaHSO3、或其组合。
在另一优选例中，所述光合作用增强剂选自下组：碳酸氢钾、硫酸氢钠、胺鲜脂、氯化胆碱、或其组合。
在另一优选例中，所述农用制剂的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。
本发明第十六方面提供了一种调控植物农艺性状的方法，包括：
给植物施用本发明第十五方面所述的农用制剂，从而调控植物的农艺性状。
在另一优选例中，所述“调控植物的农艺性状”包括：
(i)降低光呼吸效率或速率；和/或
(ii)提高光合速率或效率；和/或
(iii)增加产量；和/或
(iv)增加生物量；和/或
(v)增加叶绿素含量。
在另一优选例中，所述的施用选自下组：喷洒、浇灌、滴灌、喷雾、包被、注射、或其组合。
在另一优选例中，所述的施用可一次性施用、重复施用或连续施用。
在另一优选例中，所述的施用剂量为0.1g/亩－100g/亩，较佳地，1g/亩－20g/亩，更佳地，5g/亩－10g/亩。
在另一优选例中，所述的施用时间为播种前、蕾期、花期。
在另一优选例中，所述的施用方法为施用于植物、植物种子、或围绕植物或种子的土壤中。
在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。
在另一优选例中，所述植物选自下组：十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、茄科、桑科、猕猴桃科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：拟南芥、马铃薯、甘薯、紫薯、
山药、芋类、木薯、菊薯、水稻、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、大麦、燕麦、粟、花生、猕猴桃、棉花、草莓、牡丹、香水百合、郁金香、桑树、苹果、梨、桃、樱桃、石榴、或其组合。
在另一优选例中，所述植物包括马铃薯、甘薯、紫薯、山药、芋类、木薯、菊薯。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是DI载体核心部分；其中，LoxP、1L、2R为重组位点；I-Sce I和PI-Sce I为归位内切酶位点；MCS：多克隆位点。
图2是Pubi-DI载体核心部分；其中，LoxP、1L、2R为重组位点；I-Sce I和PI-Sce I为归位内切酶位点；pUbi：玉米泛素基因启动子；Tnos：nos终止子；MCS：多克隆位点。
图3是2×P35s-DII载体核心部分；其中，LoxP、2L、1R为重组位点；I-Sce I和PI-Sce I为归位内切酶位点；2×P35s：花椰菜花叶病毒35S增强型启动子；T35S：花椰菜花叶病毒35S终止子；MCS：多克隆位点。
图4是pYL1305载体核心部分；其中，LoxP、A2为重组位点；I-Sce I为归为内切酶位点；HPT，潮霉素抗性基因；LB，左边界；RB，右边界。
图5是GOC-pYL1305载体核心部分；其中，LoxP、1L、2RL为重组位点；I-Sce I和PI-Sce I为归位内切酶位点；pUbi：玉米泛素基因启动子；Tnos：nos终止子；2×P35s：花椰菜花叶病毒35S增强型启动子；T35S：花椰菜花叶病毒35S终止子；MCS：多克隆位点；HPT，潮霉素抗性基因；LB，左边界；RB，右边界。
图6显示了转基因植株的阳性检测；CK+：阳性对照；WT：野生型马铃薯；GOC-1，GOC-2为GOC-pBIA13转基因苗。
图7显示了II-GOC植株的GLO、KatE、OxXO酶活的测定(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；
a图：II-GOC植株的GLO酶活测定；b图：II-GOCGOC植株的KatE酶活测定；c图：II-GOCGOC植株的OxO酶活测定。
图8显示了II-GOC植株株高、茎粗的测定(n＝30)(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图9显示了II-GOC植株叶绿素含量的测定(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图10显示了II-GOC植株单株地上部分鲜/干重、单株块茎鲜/干重和薯数的统计分析(n＝30)(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；
a图：II-GOC植株单株地上部分鲜重测定；b图：II-GOC植株单株地上部分干重测定；c图：II-GOC植株单株块茎鲜重测定；d图：II-GOC植株单株块茎干重测定；e图：II-GOC植株单株薯数统计。
图11显示了II-GOC植株的净光合速率以及光呼吸速率指标的测定(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图12显示了III-GOC转基因苗阳性检测结果。
图13显示了III-GOC植株的GLO、CAT、OxO酶活的测定(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
其中，a图：III-GOC植株的GLO酶活测定；b图：III-GOC植株的CAT酶活测定；c图：III-GOC植株的OxO酶活测定。
图14显示了III-GOC植株叶绿素含量的测定(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，将具有特定结构的第一核酸构建物、或含有第一酸构建物的第一载体以及第二核酸构建物或含有第二核酸构建物的第二载体、第三核酸构建物或含有第三核酸构建物的第三载体导入植物中，可显著调控植物的农艺性状，比如，(i)降低光呼吸效率或速率；和/或(ii)提高光合速率或效率；和/或(iii)增加产量；和/或(iv)增加生物量；和/或(v)增加叶绿素含量。并且本发明还获得一种新的融合蛋白，本发明的融合蛋白包括特定的叶绿体信号肽和两种或两种以上的光呼吸代谢改造支路蛋白，本发明的融合蛋白可显著调控植物的农艺性状。此外，本发明还意外发现，将特定结构的核酸构建物或含有特定结构的核酸构建物的载体导入植物细胞，可显著调控植物的农艺性状。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
序列同一性(或同源性)通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。
试剂组合
本发明提供了一种试剂组合，所述试剂组合包括：
(i)第一核酸构建物，或含有所述第一核酸构建物的第一载体，所述第一核酸构建物具有从5’-3’的式I或结构：
P1-Z1-Z2-Z3 (I)或
P1-Z2-Z1-Z3 (I’)
其中，P1为第一启动子，；
Z1为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z2为编码第一光呼吸代谢改造支路蛋白的编码序列，所述第一光呼吸代谢改造支路蛋白为乙醇酸氧化酶(GLO)；
Z3为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列；
(ii)第二核酸构建物，或含有所述第二核酸构建物的第二载体，所述第二核酸构建物具有从5’-3’的式II所示的结构：
P2-Z4-Z5-Z6 (II)或
P2-Z5-Z4-Z6 (II’)
其中，P2为第二启动子；
Z4为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z5为编码第二光呼吸代谢改造支路蛋白的编码序列，所述第二光呼吸代谢改造支路蛋白为草酸氧化酶(OXO)；
Z5为终止子；和
(iii)第三核酸构建物，或含有所述第三核酸构建物的第三载体，所述第三核酸构建物具有从5’-3’的式III所示的结构：
P3-Z7-Z8-Z9 (III)或
P3-Z7-Z8-Z9 (III’)
其中，P3为第三启动子；
Z7为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z8为编码第三光呼吸代谢改造支路蛋白的编码序列，所述第三光呼吸代谢改造支路蛋白为过氧化氢酶(CATC)；
Z9为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列。
本发明提供了另外一种试剂组合，所述试剂组合包括：
(i)第一核酸构建物，或含有所述第一核酸构建物的第一载体，所述第一核酸构建物具有从5’-3’的式I结构：
P1-Z1-Z2-Z3 (I)或
P1-Z2-Z1-Z3 (I’)
其中，P1为第一启动子；
Z1为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z2为编码融合蛋白的编码序列，所述融合蛋白选自下组：乙醇酸氧化酶+草酸氧化酶、乙醇酸氧化酶+过氧化氢酶、草酸氧化酶+过氧化氢酶、乙醇酸氧化酶+草酸氧化酶+过氧化氢酶、或其组合；
Z3为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列；
(ii)第二核酸构建物，或含有所述第二核酸构建物的第二载体，所述第二核酸构建物具有从5’-3’的式II所示的结构：
P2-Z4-Z5-Z6 (II)或
P2-Z5-Z4-Z6 (II’)
其中，P2为第二启动子；
Z4为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z5为编码第三元件的编码序列，所述第三元件为组成所述融合蛋白之外的元件，并且所述第三元件为乙醇酸氧化酶、草酸氧化酶、过氧化氢酶中的一种；
Z6为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列；
当Z2为乙醇酸氧化酶+草酸氧化酶+过氧化氢酶，第二核酸构建物不存在。
本发明的构建物中所用的各种元件可以用常规方法，如PCR方法、全人工化学合成法、酶切方法获得，然后通过熟知的DNA连接技术连接在一起，就形成了本发明的构建物。
将本发明的载体转化植物细胞从而介导本发明的载体对植物细胞染色体进行整合，制得基因工程的植物细胞。
将本发明的基因工程的植物细胞再生为植物体，从而获得基因工程的植物。
将本发明构建好的上述核酸构建物，通过常规的植物重组技术(例如农杆菌转化技术)，可以导入植物细胞，从而获得携带所述核酸构建物(或带有所述核酸构建物的载体)的植物细胞，或获得基因组中整合有所述核酸构建物的植物细胞。
叶绿体信号肽
在本发明中，叶绿体信号肽又成为叶绿体转运肽，可以指如下氨基酸序列：其可以存在目标蛋白的两端，优选存在N端，会指导目标蛋白定位转运进入叶绿体内，所述蛋白可以是成熟蛋白或非成熟蛋白，完成转运后叶绿体信号肽即被信号肽酶切除。叶绿体转运肽通常含有大约20-150个氨基酸，这些信号肽已经被观察到含有某些共同的特征。例如：信号肽所含的带负电荷氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺)非常少(即使有的话)；信号肽的N端区缺少带电氨基酸、甘氨酸和脯氨酸；信号肽的中心区还很可能含有非常高比例的碱性或羟基化氨基酸(例如丝氨酸和苏氨酸)；并且信号肽的C端很可能富含精氨酸，并具有构成两亲性β折叠片结构的能力。
在本发明中，本发明的叶绿体信号肽为特定的信号肽，如rbcS叶绿体信号肽(StTP-58AA，简称NPTPC)、PCS1、TPC叶绿体信号肽，它可显著提高导入效率。
NPTPC的氨基酸及核苷酸序列：
NPTPC的氨基酸序列:
MASSVISSAAVATRTNVTQAGSMIAPFTGLKSAATFPVSRKQNLDITSIASNGGRVRC(SEQ IDNO.:17)
编码NPTPC的核苷酸序列:
ATGGCTTCCTCTGTTATTTCCTCTGCAGCTGTTGCTACACGCACCAATGTTACACAAGCTGGCAGCATGATTGCACCTTTCACTGGTCTCAAATCTGCTGCTACTTTCCCTGTTTCAAGGAAGCAAAACCTTGACATCACTTCCATTGCTAGCAATGGTGGAAGAGTTAGGTGC(SEQ ID NO.:18)
PCS1的氨基酸及核苷酸序列：
PCS1的氨基酸序列:
MASSVISSAAVATRTNVTQAGSMIAPFTGLKSAATFPVSRKQNLDITSIASNGGRVRCMQVWPPINMKKYETLSYLPDLTMSSTVKVAVATPRMSIKASM(SEQ ID NO.:19)
编码PCS1的核苷酸序列:
ATGGCTTCCTCTGTTATTTCCTCTGCAGCTGTTGCTACACGCACCAATGTTACACAAGCTGGCAGCATGATTGCACCTTTCACTGGTCTCAAATCTGCTGCTACTTTCCCTGTTTCAAGGAAGCAAAACCTTGACATCACTTCCATTGCTAGCAATGGTGGAAGAGTTAGGTGCATGCAGGTATGGCCACCAATTAACATGAAGAAGTACGAGACACTCTCATACCTTCCTGATTTGACTATGAGCTCAACCGTCAAGGTCGCCGTCGCCACCCCCAGGATGTCAATCAAGGCCTCCATG(SEQ ID NO.:20)
TPC的氨基酸及核苷酸序列：
TPC的氨基酸序列:
MAPSVMASSATTVAPFQGLKSTAGMPVARRSGNSSFGNVSNGGRIRCM(SEQ ID NO.:21)
编码TPC的核苷酸序列：
atggccccctccgtgatggcgtcgtcggccaccaccgtcgctcccttccaggggctcaagtccaccgccggcatgcccgtCgcccgccgctccggcaactccagcttcggcaacgtcagcaatggcggcaggatcaggtgcATG(SEQ ID NO.:22)
光呼吸代谢改造支路蛋白
在本发明中，光呼吸代谢改造支路蛋白包括乙醇酸氧化酶(GLO)、过氧化氢酶(CAT)、草酸氧化酶(OXO)，三种蛋白在植物体内形成一条代谢通路。GLO在氧的参与下将光呼吸中间产物乙醇酸(glycolate)氧化为草酸(Oxalate)和过氧化氢(H2O2)，CAT将过氧化氢氧化为水和氧气,OXO在氧的参与下将草酸氧化为CO2，所产生的CO2直接进入卡尔文循环。该光呼吸支路发生在叶绿体内，减少了乙醇酸进入过氧化物酶、线粒体的代谢步骤，缩短了代谢过程，实现CO2在叶绿体内的富集，抑制了光呼吸，增强了光合效率。
本发明中所述的光呼吸代谢改造支路蛋白可以来自真核生物和原核生物。
在一优选实施方式中，所述光呼吸代谢改造支路蛋白包括选自下组的两种或两种以上：(a)OsGLO3；(b)OsOXO3；(c)OsCATC或KatE(又称为EcCAT)。本发明中，在植物中共构建三种光呼吸改造支路，分别命名为I-GOC、II-GOC、I II-GOC。I-GOC构建于水稻中，包括分别编码OsGLO3、OsOXO3、OsCAT蛋白的三种基因；II-GOC构建于马铃薯中，包括分别编码OsGLO3、OsOXO3、KatE蛋白的三种基因；III-GOC构建于马铃薯中，包括分别编码融合蛋白(OsGLO3*OsCAT)、OsOXO3的基因。本发明所保护的光呼吸改造支路并不局限于本发明所公开的GOC类型，构成改造支路的三个基因均可以采用不同来源的、具有一定同源性、功能相近的同源基因进行替换，形成新的GOC支路；进一步的，所述的三个基因可以分别独立的构建于一个或多个载体中，也可以由两个融合与另外一个分别独立的构建于一个或多个载体中，还可以三个基因融合构建于一个载体中，基于本发明所改进的各种GOC支路均包含在本发明的范围内，其效果基本达到或优于本发明所公开的GOC支路的效果。
本发明所构建的GOC支路可适用于植物，较佳地，在C3植物中应用，更佳地，在双子叶植物中应用，更佳地，在薯类作物中应用。
本发明所述的“GOC支路”“GOC光呼吸支路”“光呼吸代谢改造支路”、“光呼吸支路”可以互换使用。
GLO、OXO、CATC蛋白及其编码核酸
如本文所用，术语“GLO蛋白”、“Glycolate oxidase”“乙醇酸氧化酶”可互换使用。
如本文所用，术语“OXO蛋白”、“Oxalate oxidase gene”“草酸氧化酶”可互换使用。
如本文所用，术语“CATC蛋白”、“catalase”、“过氧化氢酶”可互换使用。
本发明涉及一种GLO蛋白及其变体，在本发明的一个优选例中，所述GLO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
本发明还涉及一种OXO蛋白及其变体，在本发明的一个优选例中，所述OXO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
本发明还涉及一种CATC蛋白及其变体，在本发明的一个优选例中，所述CATC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5或7所示。
本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.:1或3或5或7所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。
所述“相同或相似功能”主要是指具有调控植物农艺性状的功能，比如(i)降低光呼吸效率或速率；和/或(ii)增加光合速率或效率；和/或(iii)增加产量；和/或(iv)增加生物量；和/或(v)增加叶绿素含量。
本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有GLO蛋白、或OXO蛋白或CATC蛋白或其活性的GLO蛋白、或OXO蛋白或CATC蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然GLO蛋白、或OXO蛋白或CATC蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。
本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表I进行氨基酸替换而产生。
表I
Figure BDA0002371363830000211
Figure BDA0002371363830000221
本发明还包括与本发明的天然GLO蛋白、或OXO蛋白或CATC蛋白具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明包括天然GLO蛋白、或OXO蛋白或CATC蛋白类似物与天然GLO蛋白、或OXO蛋白或CATC蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。
本发明还提供了编码GLO蛋白、或OXO蛋白或CATC蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于水稻和大肠杆菌，但是来源于其它类似的植物(尤其是与水稻属于同一科或属的植物)或其他类似的细菌的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ ID NO.:2或4或6或10所示)具有一定同源性(保守性)的GLO、或OXO或CATC或KatE的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。
根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
融合蛋白
如本文所用，“本发明融合蛋白”、或“多肽”均指本发明所述的融合蛋白。本发明融合蛋白的结构如下式I或I’所示：
A-B(I)
B-A(I’)
式中，
A为叶绿体信号肽，
B为光呼吸代谢改造支路蛋白，所述光呼吸代谢改造支路蛋白选自下组的两种或两种以上：乙醇酸氧化酶(GLO)、草酸氧化酶(OXO)、过氧化氢酶(CATC)；各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。
在本发明中，连接肽的长度对融合蛋白的活性有影响，优选的连接肽的长度为1-100aa，较佳地，15-85aa，更佳地，20-70aa，更佳地，24-32aa。
一种优选的连接肽如SEQ ID NO.:9或11-16任一所示的多肽所示。
如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO.:8所示的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
Figure BDA0002371363830000251
Figure BDA0002371363830000261
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:8所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在一优选实施方式中，本发明的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示。
农用制剂
可将本发明的活性物质(本发明的融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体(vector)以常规的方法制备成农用制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、用活性物质浸渍的天然的和合成的材料、在多聚物中的微胶囊、用于种子的包衣剂。
这些制剂可用已知的方法生产，例如，将活性化合物与扩充剂混合，这些扩充剂就是液体的或液化气的或固体的稀释剂或载体，并可任意选用表面活性剂即乳化剂和/或分散剂和/或泡沫形成剂。例如在用水作扩充剂时，有机溶剂也可用作助剂。
用液体溶剂作稀释剂或载体时，基本上是合适的，如：芳香烃类，例如二甲苯，甲苯或烷基萘；氯化的芳香或氯化的脂肪烃类，例如氯苯，氯乙烯或二氯甲烷；脂肪烃类，例如环己烷或石蜡，例如矿物油馏分；醇类，例如乙醇或乙二醇以及它们的醚和脂类；酮类，例如丙酮，甲乙酮，甲基异丁基酮或环已酮；或不常用的极性溶剂，例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜，以及水。
就液化气的稀释剂或载体说，指的是在常温常压下将成为气体的液体，例如气溶胶推进剂，如卤化的烃类以及丁烷，丙烷，氮气和二氧化碳。
固体载体可用研磨的天然矿物质，例如高岭土，粘土，滑石，石英，活性白土，蒙脱土，或硅藻土，和研磨合成的矿物质，例如高度分散的硅酸，氧化铝和硅酸盐。供颗粒用的固体载体是碾碎的和分级的天然锆石，例如方解石，大理石，浮石，海泡石和白云石，以及无机和有机粗粉合成的颗粒，和有机材料例如锯木屑，椰子壳，玉米棒子和烟草梗的颗粒等。
非离子的和阴离子的乳化列可用作乳化剂和/或泡沫形成剂。例如聚氧乙烯-脂肪酸酯类，聚氧乙烯-脂肪醇醚类，例如烷芳基聚乙二醇醚类，烷基磺酸酯类，烷基硫酸酯类，芳基磺酸酯类以及白蛋白水解产物。分散剂包括，例如木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。
在制剂中可以用粘合剂，例如羧甲基纤维素和以粉末，颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物，例如阿拉伯胶，聚乙烯基醇和聚乙烯醋酸酯。
可以用着色剂例如无机染料，如氧化铁，氧化钻和普鲁士蓝；有机染料，如有机染料，如偶氮染料或金属钛菁染料；和用痕量营养剂，如铁，猛，硼，铜，钴，铝和锌的盐等。
在本发明中，所述“农用制剂”通常是农用植物生长调节剂，其含有本发明的融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体(vector)作为调控植物农艺性状的活性成分；以及农业上可接受的载体。
如本文所用，所述“农业上可接受的载体”是用于将本发明的融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体(vector)传送给植物的农药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的农业上可接受的载体选自下组：水、缓冲液、DMSO、表面活性剂如Tween-20、或其组合。任何本领域技术人员已知的农业上可接受的载体均可用于本发明中。
本发明的农用制剂可与其他调控植物农艺性状的物质制成一种混合物存在于它们的商品制剂中或从这些制剂制备的使用剂型中，这些其他的调控植物农艺性状的物质包括(并不限于)：光呼吸抑制剂，选自：二氧化碳、乙醛酸、谷氨酸、天门冬氨酸、α-羟基磺酸盐、2，3-环氧乙酸、异烟肼、NaHSO3；光合作用增强剂，选自碳酸氢钾、硫酸氢钠、胺鲜脂、氯化胆碱。
本发明所述的农用制剂的剂型可以是多种多样的，只要能够使活性成分有效地到达植物体内的剂型都是可以的，从易于制备和施用的立场看，优选的农用制剂是一种喷雾剂或溶液制剂。
本发明所述的农用制剂通常含有占所述农用制剂总重量的0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％的本发明的融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体(vector)。商品制剂或使用剂型中的本发明化合物的浓度可在广阔的范围内变动。商品制剂或使用剂型中的本发明的融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体(vector)的浓度可从0.0000001-100％(g/v)，最好在0.0001与1％(g/v)之间。
调控植物的农艺性状
在本发明中，还提供了一种调控植物农艺性状的方法，具体地，给植物施用本发明所述的农用制剂，从而调控植物的农艺性状，所述调控植物的农艺性状包括：
(i)降低光呼吸效率或速率；和/或
(ii)提高光合速率或效率；和/或
(iii)增加产量；和/或
(iv)增加生物量；和/或
(v)增加叶绿素含量。
载体构建
本领域技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白编码DNA序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。
本发明载体中的启动子可以为组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子。优选在植物中适用的启动子。
本发明所述的组成型启动子是指受其调控下的基因表达水平大体恒定，不受时空及外界因素的影响，在多数植物组织中均可以表达而且在不同组织部位的表达水平没有显著差异。所述的组成型启动子包括椰菜花叶病病毒(CaMV)35S启动子，泛素1启动子(Ubi-1)、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子、胭脂碱合酶启动子(NOS)、pEmu启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、章鱼碱合酶(OCS)、水稻肌动蛋白-1启动子(Rac1)、水稻蔗糖合成基因(Rss1)启动子、玉米乙醇脱氢酶基因Adh1启动子、烟草花药绒层细胞特异性启动子TA29、和来自本领域技术人员已知的多种植物基因的其它转录起始区域。
本发明所述的组织特异性启动子是指受其调控的基因只在某些特定的部位或器官中表达，这种特异性通常以特定的组织细胞和化学、物理信号为基础。将外源基因在转基因植物中定位表达不但可以降低植物负担、减轻对作物农艺性状的影响，还可以提高外源基因在特定部位的浓度，增加转基因的效果。本发明的光呼吸改造支路的构建载体在必要条件下可以采用组织特异性启动子，以驱动其在某个组织部位，如植物地上部分，进一步的如植物叶片、种子、果实等部位高效表达。所述的组织特异型启动子包括：果实特异性启动子，如果实特异型启动子主要有E8、2A11、2A12、PG、MCP I、B33和ACC氧化酶启动子；茎叶特异表达启动子，如磷二激酶基因(pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK)启动子、捕光叶绿素a/b蛋白复合体基因(CAB)启动子、核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因(rbcS)启动子等。
本发明所述的诱导型启动子是指在某些物理或化学信号的刺激下，这类启动子驱动的目的基因的转录水平可以大幅度提高。所述的诱导型启动子包括:可通过缺氧或冷应激诱导的Adh1启动子，可通过热应激诱导的Hsp70启动子，可通过光诱导的PPDK启动子和PEP羧化酶(pepcarboxylase)启动子；同样可用的是化学诱导的启动子，如安全剂诱导的In2-2启动子，雄性激素诱导的ERE启动子，和Axig1启动子等。
为了增加重组效率，本发明选择特定的适用于植物细胞的启动子，比如NOS启动子、35S启动子、DD45启动子、U6启动子、Lat52启动子等。
一般的，为了增加蛋白的活性，蛋白间一般通过一些柔性短肽连接，即Linker(连接肽序列)。优选的，该Linker可以选用XTEN。
在本发明中，所述载体没有特别限制，任何双元载体都可以，不限于pCambia载体，也不限于这两种抗性，只要满足如下要求的载体都可以用在本发明中：(1)能通过农杆菌介导，转化进入植物中；(2)让RNA正常转录；(3)让植物获得新的性状。
表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。
在一优选实施方式中，所述载体选自下组：pYL322d1、pYL322d2、pYL1305、pYLTAC380GW、或其组合。
遗传转化
将上述载体通过合适的方法导入到植物受体中。导入方法包括但不局限于：农杆菌转染法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(PEG)介导法等。受体植物包括但不限于拟南芥、马铃薯、甘薯、紫薯、山药、芋类、木薯、菊薯、水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、花生、谷子、藜麦、番茄、烟草、油菜、白菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜、粟、花生、猕猴桃、棉花、草莓、牡丹、香水百合、郁金香、桑树、苹果、梨、桃、樱桃、石榴。
对于用本发明方法进行植物基因组重组后的植物细胞或组织或器官，可以用常规方法再生获得相应的基因工程的植株。例如，通过农杆菌浸花法获得基因工程的植株。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，将特定结构的核酸构建物或含有特定结构的核酸构建物的载体导入植物细胞，可显著调控植物的农艺性状，比如，(i)光合速率；和/或(ii)生物量；和/或(iii)叶绿素。
(2)本发明首次发现，本发明的融合蛋白可显著调控植物的农艺性状，比如，(i)光合速率；和/或(ii)生物量；和/或(iii)叶绿素。
(3)该呼吸支路中，未产生NADH、ATP等还原量，在高温高光等逆境条件下不产生光氧化胁迫。
(4)本发明全部或部分采用植物自身的基因，降低生物排斥的可能性，具有更高的安全性。
(5)本发明首次发现，本发明的融合蛋白显著提高光合速率、增加生物量、增加叶绿素。该发明对深入阐明高光效机理、对作物与可再生能源生产、甚至对减少CO2排放均具有深远意义，在实际应用中可以将GOC光呼吸代谢改造支路转入不同的C3植物中以培育更加高产想的品种。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。
实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成及测序工作由北京奥科生物技术有限公司完成。
实施例中所用的材料：粳稻为常规市售产品。
Pubi-DI，对载体pYL322d1(由华南农业大学刘耀光研究员提供，Zhu,Q.,Yu,S.,etal.Development of"Purple Endosperm Rice"by Engineering AnthocyaninBiosynthesis in the Endosperm with a High-Efficiency Transgene StackingSystem.Molecular plant,2017,10(7):918-929)改造获得。改造方法为首先利用常规的分子克隆手段对pYL322d1的多克隆位点的两个NotI间进行改造，改造后的载体命名为DI，载体图谱见图1。然后利用常规的分子克隆手段在DI的多克隆位点内的XbaI与PstI之间插入Pubi启动子序列及BamHI与SmaI之间插入Tnos终止子序列，载体图谱见图2。其中，Pubi启动子序列和Tnos终止子序列来源于载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(由华南农业大学刘耀光研究员提供，Ma,X.,Zhang,Q.,et al.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.Molecularplant 2015,8:1274-1284)。
2×P35s-DII，对载体pYL322d2(由华南农业大学刘耀光研究员提供，Zhu,Q.,Yu,S.,et al.Development of"Purple Endosperm Rice"by Engineering AnthocyaninBiosynthesis in the Endosperm with a High-Efficiency Transgene StackingSystem.Molecular plant,2017,10(7):918-929)改造获得。改造方法为利用常规的分子克隆手段在载体pYL322d2的多克隆位点内的EcoRI与XhoI之间插入2×P35s启动子序列及SalI与Hind III之间插入T35S终止子序列，载体图谱见图3。其中，2×P35s启动子序列和T35S终止子序列来源于载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(由华南农业大学刘耀光研究员提供)。
pYL1305，由华南农业大学刘耀光研究员提供。该载体由商业载体pCAMBIA1305.1改造而得，改造方法为利用常规分子克隆手段在pCAMBIA1305.1载体的多克隆位点区的PstI单酶切插入loxP/Cre同源重组序列，载体图谱见图4。其中，loxP/Cre同源重组序列来源于载体pYLTAC380GW。pYLTAC380GW在文献“Zhu,Q.,Yu,S.,et al.Development of"PurpleEndosperm Rice"by Engineering Anthocyanin Biosynthesis in the Endosperm witha High-Efficiency Transgene Stacking System.Molecular plant,2007,10(7):918-929”中公开。
实施例1 II-GOC光呼吸支路对水稻性状的调控作用
本发明用OsGLO、KatE和OsOXO共表达，在水稻中构建II-GOC光呼吸支路。
1.1TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3、TPC-KatE融合蛋白表达基因的获得
(1)TPC-OsGLO3融合蛋白表达基因的获得
根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的关于OsGLO3和TPC的cDNA序列设计引物。
以粳稻2周的幼苗叶片cDNA为模板，在引物OsGLO3-F和OsGLO3-R，引物TPC-1F和TPC-1R的引导下，用常规方法分别扩增OsGLO3与TPC基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化OsGLO3(约1100bp)与TPC(约150bp)的DNA片段；将上述回收片段经过BglII酶切消耗后，用T4连接酶连接，并作为模板，在引物TPC-1F与OsGLO3-R的引导下，进行第二轮PCR扩增。反应结束后，对扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化TPC-OsGLO3的DNA片段(约1300bp)，将片段克隆到pMD18-T载体上，获得pMD18-TPC-OsGLO3载体，测序。
(2)TPC-OsOXO3融合蛋白表达基因的获得
根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的关于OsOXO3和TPC的cDNA序列设计引物。
以粳稻2周的幼苗叶片cDNA为模板，在引物OsOXO3-F和OsOXO3-R，引物TPC-1F和TPC-2R的引导下，用常规方法分别扩增OsOXO3与TPC基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化OsOXO3(约700bp)与TPC(约150bp)的DNA片段；将上述回收片段经过KpnI酶切消耗后，用T4连接酶连接，并作为模板，在引物TPC-1F与OsOXO3-R的引导下，进行第二轮PCR扩增。反应结束后，对扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化TPC-OsOXO3的DNA片段(约900bp)，将片段克隆到pMD18-T载体(购自TAKARA公司)上，获得pMD18-TPC-OsOXO3载体，测序。
(3)TPC-katE融合蛋白表达基因的获得
根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的关于katE的cDNA序列设计引物。
以粳稻2周的幼苗叶片cDNA为模板，在引物KatE-F和KatE-R，引物TPC-1F和TPC-2R的引导下，用常规方法分别扩增KatE与TPC基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化KatE(约1500bp)与TPC(约150bp)的DNA片段；将上述回收片段经过KpnI酶切消耗后，用T4连接酶连接，并作为模板，在引物TPC-1F与KatE-R的引导下，进行第二轮PCR扩增。反应结束后，对扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化TPC-KatE的DNA片段(约1700bp)，将片段克隆到pMD18-T载体(购自TAKARA公司)上，获得pMD18-TPC-KatE载体，测序。
实施例1.2TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3、TPC-KatE融合蛋白表达盒序列的获得
(1)TPC-OsGLO3融合蛋白表达盒Pubi-TPC-OsGLO3-Tnos的获得
根据TPC-OsGLO3融合蛋白表达基因序列设计引物，以实施例1.1所述pMD18-TPC-OsGLO3载体为模板，在引物TPC-OsGLO3-F和TPC-OsGLO3的引导下，用常规方法扩增TPC-OsGLO3基因，电泳回收后将该基因克隆入重组供体载体Pubi-DI(载体图谱见图2)多克隆位点的PstI和BamHI酶切位点之间，得到载体Pubi-DI-TPC-OsGLO3。
根据Pubi-DI载体上的Pubi启动子序列和Tnos终止子序列设计引物，以上述Pubi-DI-TPC-OsGLO3载体为模板，在引物Pubi-F和Tnos-R的引导下，用常规方法扩增TPC-OsGLO3基因表达盒Pubi-TPC-OsGLO3-Tnos，电泳回收后将该表达盒克隆入pMD18-T载体得到载体pMD18--Pubi-TPC-OsGLO3-Tnos。送北京奥科生物技术有限公司测序。
(2)TPC-OsOXO3融合蛋白表达表达盒2×P35s-TPC-OsOXO3-T35s的获得
根据TPC-OsOXO3融合蛋白表达基因序列设计引物，以实施例1.1中所述pMD18-TPC-OsOXO3载体为模板，在引物TPC-OsOXO3-F和TPC-OsOXO3-R的引导下，用常规方法扩增TPC-OsOXO3基因，电泳回收后将该基因克隆入植物瞬时表达载体2×P35s-DII多克隆位点的EcoRI和BamHI酶切位点之间，得到载体2×P35s-DII-TPC-OsOXO3。
根据2×P35s-DII载体上的2×P35s启动子序列和T35s终止子序列设计引物，以上述2×P35s-DII-TPC-OsOXO3载体为模板，在引物2×P35s-F和T35s-R的引导下，用常规方法扩增TPC-OsOXO3基因表达盒2×P35s-TPC-OsOXO3-T35s，电泳回收后将该表达盒克隆入pMD18-T载体得到载体pMD18-2×P35s-TPC-OsOXO3-T35s，并进行测序。
(3)TPC-KatE融合蛋白表达表达盒Pubi-TPC-KatE-Tnos的获得
根据TPC-KatE融合蛋白表达基因序列设计引物，以实施例1.1中所述pMD18-TPC-KatE载体为模板，在引物TPC-KatE-F和TPC-KatE-R的引导下，用常规方法扩增TPC-KatE基因，电泳回收后将该基因克隆入重组供体载体Pubi-DI(载体图谱见图2)多克隆位点的HindIII和SpeI酶切位点之间，得到载体Pubi-DI-TPC-KatE。
以上述Pubi-DI-TPC-KatE载体为模板，在上述引物Pubi-F和Tnos-R的引导下，用常规方法扩增TPC-KatE基因表达盒Pubi-TPC-KatE-Tnos，电泳回收后将该表达盒克隆入pMD18-T载体得到载体pMD18-Pubi-TPC-KatE-Tnos，并进行测序。
实施例1.3 GOC光呼吸代谢支路改造载体GOC-pYL1305的获得
以Pubi-DI-TPC-OsGLO3、2×P35s-DII-TPC-OsOXO3和Pubi-DI-TPC-KatE为供体载体，pYL1305(载体图谱见图4)为受体载体，参考Lin等人的方法(Lin L,Liu Y G,Xu X,etal..Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigene assemblyand transformation vector system.Proceedings of the National Academy ofSciences,2003,100(10):5962-5967)，通过三轮重组，最终获得GOC光呼吸代谢改造支路载体GOC-pYL1305，载体图谱如图5所示。具体重组方法如下：
(1)供体质粒和受体质粒的准备
收集过夜的菌液10mL，采用质粒小量提取试剂盒提取质粒，电泳检测并测质粒浓度，质粒浓度控制在100～200ng/μL。
(2)供体质粒与受体质粒共转重组
按供体受体质粒摩尔比3：1的比例混合质粒3～4μL，混匀后按热激转化的方法转化NS3529感受态细胞(购买于Takara，Japan)；涂布500μL转化菌液于准备好的双抗LB平板上，培养过夜；奇数轮重组使用含50mg/L卡那霉素和17mg/L氯霉素的LB平板，偶数轮重组使用50mg/L卡那霉素和50mg/L氨苄青霉素的LB平板。
(3)洗板与质粒提取
用无菌水将过夜培养的平板上的菌落洗下，离心收集菌体；采用质粒提取试剂盒提取质粒，回收后的质粒测浓度，控制在200ng/μL左右。
(4)质粒酶切
采用归位内切酶I-SceI(奇数轮)或PI-SceI(偶数轮)37℃酶切2h，酶切后的质粒转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(购买于Takara，Japan)并涂布与含50mg/L卡那霉素的LB平板上，培养过夜。
(5)重组子的筛选
进行菌液PCR筛选阳性克隆，一次检验94个克隆，没有发现阳性克隆的情况下，重复一次，筛选出阳性克隆后进行测序确认；上游引物和测序引物均为I-CeuI-F(5′-CCAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCG-3′)，检测的下游引物根据目标基因接入供体的方向选择，如果目标基因的接入方向与MCS的标注方向相同(上游为LoxP位点)，采用接入目标基因的反向引物，反之采用正向引物。
实施例2 II-GOC对马铃薯性状的调控作用
本实验例利用水稻乙醇酸氧化酶(OsGLO)、大肠杆菌过氧化氢酶(KatE)和水稻草酸氧化酶(OsOXO)共表达，在马铃薯中构建II-GOC光呼吸支路。
2.1、载体构建
(1)E35S-PCS1-DII的构建：以pBIA13-PCS1-eGFP质粒为模板，用引物EcoRI-PCS1-F与KpnI-PCS1-R扩增PCS1基因序列，利用EcoRI与KpnI双酶切构建于载体E35S-DII上，引物序列如下：
EcoRI-PCS1-F：5’-GACTGAATTCATGGCTTCCTCTGTTATT-3’(SEQ ID NO.:23)
Kpn I-PCS1-R：5'-CCATGGTACCCATGGAGGCCTTGATTGA-3’(SEQ ID NO.:24)
(2)E35S-PCS1-OXO3--DII的构建：以pBIA13-CPTPC-OsOXO3-eGFP质粒为模板，用引物KpnI-OXO3-F与BamHI-OXO3-R扩增OsOXO3基因序列，利用KpnI与BamHI双酶切构建于载体E35S-PCS1-DII上，引物序列如下：
KpnI-OXO3-F：5’-CATGGGTACCATGGAGTACGGCTTCAAA-3’(SEQ ID NO.:25)
BamHI-OXO3-R：5'-GATCGGATCCTTAGTACCCGCCGGTGAA-3’(SEQ ID NO.:26)
(3)XNOS-NPTPC-GLO3-DI重组供体的构建，使用PTPC-KpnI-F和NPTPC-EcoRV-R从马铃薯cDNA中扩增NPTPC马铃薯叶绿体信号肽序列，使用GLO3-EcoRV-F和GLO3-SmaI-zR从GOC-1305中扩增GLO3序列，由课题组沈博然博士构建，通过EcoRV酶切位点搭桥连接OsGLO3和NPTPC，最后通过KpnI和SmaI连入载体pDI-NOSpt，引物序列如下：
PTPC-KpnI-F：TATAGGTACCATGGCTTCCTCTGTTAT(SEQ ID NO.:27)
NPTPC-EcoRV-R：TCGAGATATCGCACCTAACTCTTCCACCAT(SEQ ID NO.:28)
GLO3-EcoRV-F：AGATGATATCATGGAGCTAATCACAAACGT(SEQ ID NO.:29)
GLO3-SmaI-NR：TAATCCCGGGATGGTGATGGTGATGATGCC(SEQ ID NO.:30)
(4)XNOS-NPTPC-EcCAT-DI重组供体的构建
使用PTPC-KpnI-F和NPTPC-SalI-R从马铃薯cDNA中扩增NPTPC马铃薯叶绿体信号肽序列，使用EcCAT-SalI-F和EcCAT-SmaI-NR从大肠杆菌DNA中扩增EcCAT序列，通过SalI酶切位点搭桥连接EcCAT和NPTPC，最后通过KpnI和SmaI连入载体pDI-NOSpt，引物序列如下：
PTPC-KpnI-F：TATAGGTACCATGGCTTCCTCTGTTAT(SEQ ID NO.:31)
NPTPC-SalI-R:AGATGTCGACGCACCTAACTCTTCCACCAT(SEQ ID NO.:32)
EcCAT-SalI-F GGTGGTCGACATGTCGCAACATAACGAAAA(SEQ ID NO.:33)
EcCAT-SmaI-NR TAATCCCGGGGGCAGGAATTTTGTCAATCT(SEQ ID NO.:34)
(5)以pBIA13为受体载体，与供体载体XNOS-NPTPC-GLO3-DI进行第一轮loxP/Cre同源重组；与供体载体E35S-PCS1-OXO3-DII进行第二轮loxP/Cre同源重组；与供体载体35S-NPTPC-KatE-DI进行第三轮loxP/Cre同源重组，最终获得多基因表达载体XNosGLO3-E35S-OXO3-35SKatE-pBIA13(命名：II-GOC-pBIA13；简称II-GOC)。
2.2、转化农杆菌
(1)冻融法转化农杆菌感受态细胞
将分装好LB4404农杆菌感受态细胞置于冰中解冻5min，加入待转化质粒(1μg以上)后冰浴30min，转入液氮中90s，再转入37℃直至溶解，加入1mL SOC培养液，200rpm，28℃摇动培养2h，涂抹于LB板(含利福平和卡那霉素)，28℃倒置培养2d。
(2)农杆菌转化子的鉴定与储存
将上述抽提的农杆菌质粒(步骤2长出菌落)DNA热激转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将菌液涂抹于LB板(含卡那霉素)培养过夜。第二天挑1个单菌落进行摇菌过夜，送至测序公司测序以确保为阳性转化子。确定为阳性转化子后，将阳性转化子在LB液(含相应抗生素)中摇菌过夜约20h，取500μL收集菌液，加入等体积30％的甘油于1.5mL离心管中-80℃保存备用。
2.3、遗传转化
(1)块茎开始建立
马铃薯种薯清洗切开，放入GA3(2mg L-1)浸泡30min，半埋于沙盘催芽(保持湿度)，约3周后取芽备用。取下芽用清水冲洗30min，在无菌条件下，75％酒精处理1min，0.1％升汞处理8min，然后用无菌水清洗5次，在无菌滤纸上晾干后切成带节的小段接入MS培养基上培养。挑选长势好无菌苗按一叶一节剪开，在MS培养基上扩繁。在试管苗快速繁殖的过程中，逐渐淘汰含有共生菌的材料，获得的无菌苗可以用于试管薯诱导。
(2)试管薯开始建立
试管薯切开，每个薯块可以切3个左右，接到MS培养基上，10天左右就可以大量取芽快速繁殖或诱导试管薯。
(3)试管苗开始建立
长期保存的试管苗，每20天可以扩繁一次。每颗苗的顶芽带2片叶可以用来继续繁殖，下面的茎段，按一叶一节剪开，进入试管薯诱导。
(4)试管薯的诱导
挑选长势好试管苗茎段(一叶一节)，接入试管薯诱导培养基(MS培养基添加80gL-1的蔗糖，加2g L-1活性炭)，于光照8h，黑暗16h，温度为20℃培养箱中培养。大概8-12周之后便可采收试管薯进行马铃薯遗传转化。
(5)转化
从-80℃冰箱取出已制备好的农杆菌菌种在YEB(含利福平50mg L-1+卡那霉素50mg L-1)培养基划板，置于28℃培养箱暗培养2天。挑单克隆于10mL YEB(含利福平50mgL-1+卡那霉素50mg L-1)液体培养基中，28℃200rpm培养24小时至菌液呈橙黄色。取2mL培养好的农杆菌种子菌液加入40mL YEB(含卡那霉素50mg L-1)中，28℃200rpm培养5小时，菌液的OD值约为0.5-0.7。将菌液转入50mL离心管，4℃4000rpm离心6min收集菌液。弃上清，加入20mL液体MS培养基，吸打混匀备用。
在培养皿中加入少量液体MS培养基，将采收试管薯转入培养皿中，切片，厚度约1-2mm。将切好的薯片转入装有浸染菌液的离心管中。将离心管横放于超净工作台上，静置10min，期间轻轻晃动一到两次。弃去浸染液，将薯片转移到铺有滤纸的培养皿中吸干浸染液转入P1培养基(MS培养基，添加6-BA 0.5mg L-1+ZT 2.0mg L-1+GA3 0.2mg L-1+IAA1.0mg L-1，蔗糖30g L-1)。浸染后的材料暗培养48小时，转入P2培养基(P1培养基添加200mg L-1头孢霉素，75mg L-1卡那霉素，蔗糖30g L-1)上进行分化筛选培养。在2周内产生的侧芽都需要及时剪除，14d更换一次培养基，直至薯薄片分化出芽，随后剪下幼芽(1-2cm)，转移到P3培养基(MS培养基添加200mg L-1头孢霉素、50mg L-1卡那霉素，蔗糖30g L-1)生根筛选。
将获得生根苗进行扩繁，后进行移栽。移栽前将幼苗根部培养基清洗干净，以防止根上附有培养基而导致根腐烂。洗干净后把幼苗移栽为土培。
2.4、转基因植株的阳性检测
在硫酸卡那霉素筛选培养基中筛选出18株II-GOC转基因植株苗和，移到室外种植进行初步表型观察，筛选出有表型II-GOC转基因株系的II-GOC-1，II-GOC-2进行NPTII基因扩增检测。通过CTAB法提取II-GOC马铃薯转基因苗的DNA；以DNA为模板，采用特异性引物进行NPTII基因的扩增。如图6所示，获得II-GOC-1，II-GOC-2转基因植株均为阳性苗。
CK+：阳性对照；WT：野生型马铃薯；II-GOC-1，II-GOC-2为II-GOC-pBIA13转基因苗
2.5、分析检测
(1)GLO、KatE、OxO的酶活性测定
(1)GLO活性测定
取0.1g马铃薯叶片，加入0.5mL磷酸缓冲液PBS(100mM，pH 8.0)和少量石英砂置于冰上充分研磨，12000rpm，4℃，离心15min，收集上清液体重复离心一次，取上清液作为酶活测定的粗酶液。
GLO粗酶液反应体系：
磷酸缓冲液PBS(100mM，pH 8.0) 520μL
4-氨基安替吡啉(4-amino-antipyrine，30mM) 100μL
辣根过氧化物酶体(150U mL-1，现配现用) 10μL
苯酚(现配现用) 110μL
FMN(1mM) 100μL
往反应液加入30μL粗酶液并摇匀，于30℃条件下保温5min，加入5μL乙醇酸(100mM)启动反应后测A520在1min内吸光值的变化，反应温度为30℃。
空白对照是以等体积的dH2O代替乙醇酸。
标准曲线的制作：以标准H2O2代替乙醇酸，使其终浓度为10、20、30、40、50μM，制作标准曲线为y＝175.74x+0.2358，R＝0.9982(y代表H2O2浓度μM，x代表OD520吸光值)。GLO酶活力(nmol H2O2 min-1mg-1蛋白)：即在一分钟内，每毫克蛋白产生的H2O2的nmol数。
(2)KatE活性测定
粗酶液的制备同上。
CAT粗酶液反应体系：
磷酸缓冲液PBS(50mM，pH 7.5) 10mL
标准H2O2 26.4μL
加入适量粗酶液摇匀后测A240在1min内吸光值的变化。
标准曲线为y＝x/46.3，y为H2O2浓度μM，x代表OD240吸光值。CAT酶活力(μmo H2O2min-1mg-1蛋白)：即在一分钟内，每毫克蛋白产生的H2O2的μmol数。
(3)OxO酶活性测定
取0.1g叶片加入0.4mL Tris-HCl(100mM，pH 8.0)和少量石英砂充分研磨(置于冰上)，4℃，12000rpm离心15min，取上清(粗酶液)待用。
OxO粗酶液反应体系：
显色液(pH 3.8) 400μL
过氧化物酶体(2.5U mL-1) 20μL
草酸(20mM) 20μL
dH2O 60μL
加入适量粗酶液，反应30min后测A555，反应温度为30℃。
标准曲线的制作：取适量显色液分别加入0、20、50、80、100nmol H2O2，使总体积为0.5mL，在555nm下测定吸光值，制作标曲y＝52.083x-1.5309(y是H2O2物质的量nmol，x是OD555吸光值)。
(2)叶绿素含量的测定
将马铃薯叶片剪成细丝状后称取0.01g，加入1.8mL叶绿素提取液，静置过夜至样品完全发白(室温避光)，分别在663nm(叶绿素a吸收峰)和645nm(叶绿素b吸收峰)测定吸光值。按公式Chla＝12.7A663-2.69A645和Chlb＝22.9A645-4.68A663计算出叶绿素a和叶绿素b的浓度，总叶绿素的浓度即为二者之和。
(3)光合作用相关参数的测定
(3.1)净光合速率的测定
净光合速率的测定见3.2.12。
(3.2)光强响应曲线的测定：
LI-6800内置程序自动完成。测定时设置参数：气流500μmol s-1；温度25℃；CO2浓度400μmol mol-1；测定前先1600m-2s-1光诱导0.5h。光强梯度从高到低为2200、2000、1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、300、200、150、100、80、50、20、0，每个光强下都停留大约2-3min后，测定净光合速率。
(3.3)CO2响应曲线测定：
使用CO2钢瓶，由LI-6800内置程序自动完成。测定时设置参数：气流500μmol s-1；温度25℃，CO2浓度400μmol mol-1；光强1600μmol m-2s-1，测定前先光诱导0.5h。CO2浓度梯度从高到低为1600、1400、1200、1000、800、600、400、300、200、100、80、60、40、20μmolmol-1，每一浓度下适应4-6min后测定净光合速率。
(3.4)光呼吸速率的测定
利用CO2钢瓶及2％氧的氮气瓶完成。测定时设置参数：气体流量500μmol s-1，温度25℃，光强1600μmol m-2s-1，CO2浓度400μmol mol-1。分别在常氧(21％)和低氧(2％)条件下测定光合速率，光呼吸即为两者光合速率差值。
(4)马铃薯叶面积、生物量和产量的测定
(1)叶面积：随机选取大田3株马铃薯植株，将每株马铃薯叶片全部摘下，从每株全部叶子中随机抽取25片将叶脉对齐，在叶脉两侧各打孔两个(孔面积1cm2)，将100小圆叶放置烘箱75℃烘干称取干重，记录a(单位g)，则马铃薯叶面积与干重之比为100/a。每个株系随机取15株马铃薯植株，每株叶片全部摘下烘干，称干重，记录为b(单位g)。则每株马铃薯叶面积(cm2)＝(100/a)×b。
(2)鲜/干重：随机选取马铃薯植株样品分为地上部分和地下部分，称取鲜重并记录，然后放置烘箱先105℃杀青30min，再75℃烘至恒重，称取干重并记录(单位g)。
2.6、实验结果
(1)II-GOC植株中GLO、KatE和OXO的酶活性分析
为了进一步分析II-GOC支路中目的基因催化作用，本研究对II-GOC植株GLO、KatE和OxO酶活性进行测定，结果如图7(a-b)所示，II-GOC-1和II-GOC-2转基因株系GLO酶活性相对野生型分别提高了29.1％和23.9％(p<0.05)；KatE酶活性相对野生型分别提高了15.8％和17.2％(p<0.05)。由于野生型马铃薯叶片中检测不到OXO酶活性，因此转基因植株中测到的OXO酶活应由导入的OsOXO3基因表达引起的。如图7c显示，II-GOC植株OXO酶均有表达，但绝对酶活性相对较低。上述结果表明，II-GOC支路中目的蛋白均能在马铃薯叶绿体中表达产生催化活性。
(2)盆栽II-GOC植株的生长性状
将获得II-GOC转基因独立株系种在土里进行表型观察，在马铃薯块茎膨胀期发现II-GOC植株在表型上与野生型有一定的差异，表现在主茎变粗，株高增加和叶色稍微变绿等；本研究对II-GOC植株的生长形态指标进行了统计分析(图8)。结果如图8(a-b)所示，II-GOC-1和II-GOC-2植株的株高相对野生型分别提高了1.62％和2.77％；茎粗分别提高了3.69％和3.77％。
(3)盆栽II-GOC植株的叶绿素含量测定
在块茎膨胀期发现II-GOC植株相对野生型叶色稍微变绿，尤其II-GOC-2株系更为明显，因此取马铃薯叶片进行叶绿素含量的测定分析。结果表明，II-GOC-1和II-GOC-2株系总叶绿素相对野生型分别提高了7.54％和15.20％；叶绿素a分别提高了6.67％和15.18％；叶绿素b分别提高了11.39％和15.24％。II-GOC-2叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素提高幅度均达到了统计学上的显著性差异(图9)。
(4)盆栽II-GOC植株的生物量和产量
II-GOC支路能有效促进马铃薯生长，本研究进一步对II-GOC植株生物量和产量进行统计分析，发现相对野生型，II-GOC-1和II-GOC-2单株地上部分鲜重、干重分别增加了9.65-22.18％和5.9-10.4％；相应地，单株块茎鲜重、干重分别增加了10.34-11.14％和11.8-14.7％，均有显著性差异；单株薯数均增加3-5个，表明了II-GOC支路的引入起了类似效果，提高了马铃薯生物量和产量(图10，a-e)
(5)盆栽II-GOC植株的净光合速率与光呼吸测定
在块茎膨胀期对II-GOC转基因植株光合和光呼吸指标进行测定。如图11(a-b所示，野生型植株净光合速率为23.32±1.58μmol CO2 m-2s-1；光呼吸速率为8.68±1.23μmolCO2 m-2s-1；II-GOC-1和II-GOC-2植株净光合速率分别为24.96±1.65μmol CO2 m-2s-1和26.05±2.00CO2 m-2s-1；光呼吸速率分别为8.11±0.65μmol CO2 m-2s-1和7.64±1.42μmolCO2 m-2s-1。相对野生型，II-GOC植株光合速率提高了7.02-11.68％；光呼吸速率下降了6.59-12.01％。本研究结果与以往报道相似，在马铃薯叶绿体中创建II-GOC光呼吸代谢支路，同样能有效分流光呼吸代谢，抑制光呼吸而有效提高了植物的光合效率。
测定参数设置：光强1600μmol m-2s-1、温度25℃、CO2浓度400μmol，n＝30。
2.7、实验结论
本发明构建的包含OsGLO、OsOXO、KatE的II-GOC光呼吸支路可以在马铃薯中有效的发挥作用，增加GOC植株胞间CO2浓度，提高光合速率，降低光呼吸速率，增加株高、茎粗，提高叶绿素含量，提高生物量、产量。
实施例3 III-GOC对马铃薯性状的调控作用
本发明将融合蛋白(OsGLO3*OsCAT)和OsOXO3共表达，构建III-GOC支路。
3.1、载体构建
以pBIA13为受体载体，与NOS-StTP-80AA-GLO3CATC-DI进行第一轮loxP/Cre同源重组，与供体载体E35S-PCS1-OXO3-DII进行第二轮loxP/Cre同源重组；最终获得多基因表达载体35SGLO3CATC-E35SOXO3-pBIA13(命名为III-GOC-pBIA13；简称(III-GOC)。
3.2转化农杆菌、遗传转化、分析检测方法等具体参见实施例2
3.3在硫酸卡那霉素筛选培养基中筛选出23株III-GOC转基因苗，移到室外种植进行初步表型观察，筛选出有表型III-GOC转基因株系III-GOC-5和III-GOC-6进行NPTII基因扩增检测。通过CTAB法提III-GOC马铃薯转基因苗的DNA；以DNA为模板，采用特异性引物进行NPTII基因的扩增。如图12所示，获得III-GOC-5，III-GOC-6。
3.4结果分析
(1)酶活性的测定
本研究对III-GOC植株GLO、CAT酶活性进行测定，结果如图13(a-c)所示，相对野生型，III-GOC植株GLO酶活性相对野生型提高了9.62-14.3％；CAT酶活提高了2.03-8.32％，由于野生型马铃薯叶片不含有OxO，所测得转基因株系OxO酶活由OsOXO3基因引起，但III-GOC植株OxO酶活表达量较低。
(2)盆栽植株叶绿素含量的测定
III-GOC植株叶绿素含量的测定结果显示，相对野生型，III-GOC-5和III-GOC-6转基因植株总叶绿素分别提高了13.42％和3.28％；叶绿素a分别提高了13.33％和0.62％；叶绿素b分别提高了13.83％和1.72％。III-GOC-6叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素提高幅度均达到了统计学上的差异(图14)。
(3)盆栽III-GOC植株地上生物量和产量的统计分析
本研究对盆栽III-GOC植株生物量和产量进行统计分析，结果显示，相对野生型，III-GOC植株单株地上部分鲜重/干重分别提高了0.4-9.9％和0.28-3.6％。
3.5实验结论
本发明构建的包含(OsGLO3*OsCAT)和OsOXO3的III-GOC改造支路可在马铃薯中有效发挥作用，增加叶绿素含量和植物生物量、产量。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 山东舜丰生物科技有限公司
华南农业大学
<120> 光呼吸支路蛋白在调控植物性状中的应用
<130> P2019-1880
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 367
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
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Lys Leu Pro Lys Met Ile Tyr Asp Tyr Tyr Ala Ser Gly Ala Glu Asp
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Arg Leu Gly Arg Arg Glu Ala Asp Ile Lys Asn Arg Phe Asn Leu Pro
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<213> 水稻(Oryza sativa)
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tacgtcaagt tccactggaa gcccacctgc ggcgtcaagt cgctgctcga cgacgaggcc 720
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cgcttcgact tcgacccgct cgacgtcacc aagacgtggc ccgaggacat cgtcccgctg 900
cagcccgtgg ggaggatggt gctcaaccgc aacatcgaca acttcttctc ggagaacgag 960
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<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
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Ser Asp Ile Thr Lys Ala Asp Phe Leu Ser Asp Pro Asn Lys Ile Thr
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Pro Val Phe Val Arg Phe Ser Thr Val Gln Gly Gly Ala Gly Ser Ala
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Asp Thr Val Arg Asp Ile Arg Gly Phe Ala Thr Lys Phe Tyr Thr Glu
180 185 190
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Gln Asp Ala His Lys Phe Pro Asp Phe Val His Ala Val Lys Pro Glu
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Asp Tyr Val Ser Leu Gln Pro Glu Thr Leu His Asn Val Met Trp Ala
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Met Ser Asp Arg Gly Ile Pro Arg Ser Tyr Arg Thr Met Glu Gly Phe
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Gly Ile His Thr Phe Arg Leu Ile Asn Ala Glu Gly Lys Ala Thr Phe
275 280 285
Val Arg Phe His Trp Lys Pro Leu Ala Gly Lys Ala Ser Leu Val Trp
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Glu Leu Trp Glu Ala Ile Glu Thr Gly Asp Phe Pro Glu Tyr Glu Leu
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Gly Phe Gln Leu Ile Pro Glu Glu Asp Glu Phe Lys Phe Asp Phe Asp
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Leu Leu Asp Pro Thr Lys Leu Ile Pro Glu Glu Leu Val Pro Val Gln
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Arg Val Gly Lys Met Val Leu Asn Arg Asn Pro Asp Asn Phe Phe Ala
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Glu Asn Glu Gln Ala Ala Phe His Pro Gly His Ile Val Pro Gly Leu
385 390 395 400
Asp Phe Thr Asn Asp Pro Leu Leu Gln Gly Arg Leu Phe Ser Tyr Thr
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Asp Thr Gln Ile Ser Arg Leu Gly Gly Pro Asn Phe His Glu Ile Pro
420 425 430
Ile Asn Arg Pro Thr Cys Pro Tyr His Asn Phe Gln Arg Asp Gly Met
435 440 445
His Arg Met Gly Ile Asp Thr Asn Pro Ala Asn Tyr Glu Pro Asn Ser
450 455 460
Ile Asn Asp Asn Trp Pro Arg Glu Thr Pro Pro Gly Pro Lys Arg Gly
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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Met Asp Pro Tyr Lys His Arg Pro Ser Ser Ser Phe Asn Gly Pro Leu
1 5 10 15
Trp Ser Thr Asn Ser Gly Ala Pro Val Trp Asn Asn Asn Asn Ser Leu
20 25 30
Thr Val Gly Ser Arg Gly Pro Ile Leu Leu Glu Asp Tyr His Leu Val
35 40 45
Glu Lys Leu Ala Asn Phe Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val
50 55 60
His Ala Arg Gly Ala Ser Ala Lys Gly Phe Phe Glu Val Thr His Asp
65 70 75 80
Ile Thr His Leu Thr Cys Ala Asp Phe Leu Arg Ala Pro Gly Val Gln
85 90 95
Thr Pro Val Ile Val Arg Phe Ser Thr Val Ile His Glu Arg Gly Ser
100 105 110
Pro Glu Thr Leu Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ala Ile Lys Phe Tyr Thr
115 120 125
Arg Glu Gly Asn Trp Asp Leu Val Gly Asn Asn Phe Pro Val Phe Phe
130 135 140
Ile Arg Asp Gly Met Lys Phe Pro Asp Met Val His Ser Leu Lys Pro
145 150 155 160
Asn Pro Lys Ser His Val Gln Glu Asn Trp Arg Ile Leu Asp Phe Phe
165 170 175
Ser His His Pro Glu Ser Leu His Met Phe Thr Phe Leu Phe Asp Asp
180 185 190
Ile Gly Ile Pro Ala Asp Tyr Arg His Met Asp Gly Ser Gly Val Asn
195 200 205
Thr Tyr Thr Leu Val Asn Arg Ala Gly Lys Ser His Tyr Val Lys Phe
210 215 220
His Trp Lys Pro Thr Cys Gly Val Lys Ser Leu Leu Asp Asp Glu Ala
225 230 235 240
Val Thr Val Gly Gly Thr Asn His Ser His Ala Thr Gln Asp Leu Tyr
245 250 255
Asp Ser Ile Ala Ala Gly Asn Phe Pro Glu Trp Lys Leu Phe Ile Gln
260 265 270
Thr Ile Asp Pro Asp His Glu Asp Arg Phe Asp Phe Asp Pro Leu Asp
275 280 285
Val Thr Lys Thr Trp Pro Glu Asp Ile Val Pro Leu Gln Pro Val Gly
290 295 300
Arg Met Val Leu Asn Arg Asn Ile Asp Asn Phe Phe Ser Glu Asn Glu
305 310 315 320
Gln Leu Ala Phe Cys Pro Gly Ile Ile Val Pro Gly Ile Tyr Tyr Ser
325 330 335
Asp Asp Lys Leu Leu Gln Thr Arg Ile Phe Ser Tyr Ser Asp Thr Gln
340 345 350
Arg His Arg Leu Gly Pro Asn Tyr Leu Leu Leu Pro Pro Asn Ala Pro
355 360 365
Lys Cys Ala His His Asn Asn His Tyr Asp Gly Phe Met Asn Phe Met
370 375 380
His Arg Asp Glu Glu Val Asp Tyr Phe Pro Ser Arg Tyr Asp Pro Ala
385 390 395 400
Lys His Ala Pro Arg Tyr Pro Ile Pro Ser Ala Thr Leu Thr Gly Arg
405 410 415
Arg Glu Lys Val Val Ile Ala Lys Glu Asn Asn Phe Lys Gln Pro Gly
420 425 430
Glu Arg Tyr Arg Ser Trp Asp Pro Ala Arg Gln Asp Arg Phe Ile Lys
435 440 445
Arg Trp Ile Asp Ala Leu Ser Asp Pro Arg Leu Thr His Glu Ile Arg
450 455 460
Ser Ile Trp Leu Ser Tyr Trp Ser Gln Ala Asp Arg Ser Leu Gly Gln
465 470 475 480
Lys Leu Ala Ser Arg Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
485 490 495
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Met Glu Leu Ile Thr Asn Val
500 505 510
Ser Glu Tyr Glu Gln Leu Ala Lys Gln Lys Leu Pro Lys Met Ile Tyr
515 520 525
Asp Tyr Tyr Ala Ser Gly Ala Glu Asp Gln Trp Thr Leu Lys Glu Asn
530 535 540
Arg Glu Ala Phe Ser Arg Ile Leu Phe Arg Pro Arg Ile Leu Ile Asp
545 550 555 560
Val Ser Arg Ile Asn Met Ala Thr Asn Val Leu Gly Phe Asn Ile Ser
565 570 575
Met Pro Ile Met Ile Ala Pro Ser Ala Met Gln Lys Met Ala His Pro
580 585 590
Glu Gly Glu Leu Ala Thr Ala Arg Ala Ala Ser Ala Ala Gly Thr Ile
595 600 605
Met Thr Leu Ser Ser Trp Ser Thr Ser Ser Val Glu Glu Val Asn Ser
610 615 620
Ala Ala Pro Gly Ile Arg Phe Phe Gln Leu Tyr Val Tyr Lys Asp Arg
625 630 635 640
Asn Ile Val Arg Gln Leu Val Arg Arg Ala Glu Leu Ala Gly Phe Lys
645 650 655
Ala Ile Ala Leu Thr Val Asp Thr Pro Arg Leu Gly Arg Arg Glu Ala
660 665 670
Asp Ile Lys Asn Arg Phe Asn Leu Pro Pro His Leu Val Leu Lys Asn
675 680 685
Phe Glu Ala Leu Asp Leu Gly Lys Met Asp Lys Thr Asn Asp Ser Gly
690 695 700
Leu Ala Ser Tyr Val Ala Ser Gln Val Asp Arg Ser Leu Ser Trp Thr
705 710 715 720
Asp Val Lys Trp Leu Gln Thr Ile Thr Ser Leu Pro Ile Leu Val Lys
725 730 735
Gly Val Met Thr Ala Glu Asp Thr Arg Leu Ala Val Glu Ser Gly Ala
740 745 750
Ala Gly Ile Ile Val Ser Asn His Gly Ala Arg Gln Leu Asp Tyr Val
755 760 765
Pro Ala Thr Ile Ser Cys Leu Glu Glu Val Val Arg Glu Ala Lys Gly
770 775 780
Arg Leu Pro Val Phe Leu Asp Gly Gly Val Arg Arg Gly Thr Asp Val
785 790 795 800
Phe Lys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Ser Gly Val Phe Ile Gly Arg Pro
805 810 815
Val Leu Phe Ser Leu Ala Val Asp Gly Glu Ala Gly Val Arg Lys Val
820 825 830
Leu Gln Met Leu Arg Asp Glu Leu Glu Leu Thr Met Ala Leu Ser Gly
835 840 845
Cys Thr Ser Leu Ala Glu Ile Thr Arg Asn His Val Ile Thr Asp Ser
850 855 860
Asp Arg His His His His His His
865 870
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 10
<211> 2262
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 10
atgtcgcaac ataacgaaaa gaacccacat cagcaccagt caccactaca cgattccagc 60
gaagcgaaac cggggatgga ctcactggca cctgaggacg gctctcatcg tccagcggct 120
gaaccaacac cgccaggtgc acaacctacc gccccaggga gcctgaaagc ccctgatacg 180
cgtaacgaaa aacttaattc tctggaagac gtacgcaaag gcagtgaaaa ttatgcgctg 240
accactaatc agggcgtgcg catcgccgac gatcaaaact cactgcgtgc cggtagccgt 300
ggtccaacgc tgctggaaga ttttattctg cgcgagaaaa tcacccactt tgaccatgag 360
cgcattccgg aacgtattgt tcatgcacgc ggatcagccg ctcacggtta tttccagcca 420
tataaaagct taagcgatat taccaaagcg gatttcctct cagatccgaa caaaatcacc 480
ccagtatttg tacgtttctc taccgttcag ggtggtgctg gctctgctga taccgtgcgt 540
gatatccgtg gctttgccac caagttctat accgaagagg gtatttttga cctcgttggc 600
aataacacgc caatcttctt tatccaggat gcgcataaat tccccgattt tgttcatgcg 660
gtaaaaccag aaccgcactg ggcaattcca caagggcaaa gtgcccacga tactttctgg 720
gattatgttt ctctgcaacc tgaaactctg cacaacgtga tgtgggcgat gtcggatcgc 780
ggcatccccc gcagttaccg caccatggaa ggcttcggta ttcacacctt ccgcctgatt 840
aatgccgaag ggaaggcaac gtttgtacgt ttccactgga aaccactggc aggtaaagcc 900
tcactcgttt gggatgaagc acaaaaactc accggacgtg acccggactt ccaccgccgc 960
gagttgtggg aagccattga aacaggcgat tttccggaat acgaactggg cttccagttg 1020
attcctgaag aagatgaatt caagttcgac ttcgatcttc tcgatccaac caaacttatc 1080
ccggaagaac tggtgcccgt tcagcgtgtc ggcaaaatgg tgctcaatcg caacccggat 1140
aacttctttg ctgaaaacga acaggcggct ttccatcctg ggcatatcgt gccgggactg 1200
gacttcacca acgatccgct gttgcaggga cgtttgttct cctataccga tacacaaatc 1260
agtcgtcttg gtgggccgaa tttccatgag attccgatta accgtccgac ctgcccttac 1320
cataatttcc agcgtgacgg catgcatcgc atggggatcg acactaaccc ggcgaattac 1380
gaaccgaact cgattaacga taactggccg cgcgaaacac cgccggggcc gaaacgcggc 1440
ggttttgaat cataccagga gcgcgtggaa ggcaataaag ttcgcgagcg cagcccatcg 1500
tttggcgaat attattccca tccgcgtctg ttctggctaa gtcagacgcc atttgagcag 1560
cgccatattg tcgatggttt cagttttgag ttaagcaaag tcgttcgtcc gtatattcgt 1620
gagcgcgttg ttgaccagct ggcgcatatt gatctcactc tggcccaggc ggtggcgaaa 1680
aatctcggta tcgaactgac tgacgaccag ctgaatatca ccccacctcc ggacgtcaac 1740
ggtctgaaaa aggatccatc cttaagtttg tacgccattc ctgacggtga tgtgaaaggt 1800
cgcgtggtag cgattttact taatgatgaa gtgagatcgg cagaccttct ggccattctc 1860
aaggcgctga aggccaaagg cgttcatgcc aaactgctct actcccgaat gggtgaagtg 1920
actgcggatg acggtacggt gttgcctata gccgctacct ttgccggtgc accttcgctg 1980
acggtcgatg cggtcattgt cccttgcggc aatatcgcgg atatcgctga caacggcgat 2040
gccaactact acctgatgga agcctacaaa caccttaaac cgattgcgct ggcgggtgac 2100
gcgcgcaagt ttaaagcaac aatcaagatc gctgaccagg gtgaagaagg gattgtggaa 2160
gctgacagcg ctgacggtag ttttatggat gaactgctaa cgctgatggc agcacaccgc 2220
gtgtggtcac gcattcctaa gattgacaaa attcctgcct ga 2262
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
His His His His Pro Gly Gly Ser Val Lys Lys Arg
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly
1 5 10
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
Ser Ala Pro Gly Thr Pro
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
Ser Ala Pro Gly Thr Pro Ser Arg
1 5
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe
1 5 10
<210> 17
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
Met Ala Ser Ser Val Ile Ser Ser Ala Ala Val Ala Thr Arg Thr Asn
1 5 10 15
Val Thr Gln Ala Gly Ser Met Ile Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser
20 25 30
Ala Ala Thr Phe Pro Val Ser Arg Lys Gln Asn Leu Asp Ile Thr Ser
35 40 45
Ile Ala Ser Asn Gly Gly Arg Val Arg Cys
50 55
<210> 18
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
atggcttcct ctgttatttc ctctgcagct gttgctacac gcaccaatgt tacacaagct 60
ggcagcatga ttgcaccttt cactggtctc aaatctgctg ctactttccc tgtttcaagg 120
aagcaaaacc ttgacatcac ttccattgct agcaatggtg gaagagttag gtgc 174
<210> 19
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
Met Ala Ser Ser Val Ile Ser Ser Ala Ala Val Ala Thr Arg Thr Asn
1 5 10 15
Val Thr Gln Ala Gly Ser Met Ile Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser
20 25 30
Ala Ala Thr Phe Pro Val Ser Arg Lys Gln Asn Leu Asp Ile Thr Ser
35 40 45
Ile Ala Ser Asn Gly Gly Arg Val Arg Cys Met Gln Val Trp Pro Pro
50 55 60
Ile Asn Met Lys Lys Tyr Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr
65 70 75 80
Met Ser Ser Thr Val Lys Val Ala Val Ala Thr Pro Arg Met Ser Ile
85 90 95
Lys Ala Ser Met
100
<210> 20
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
atggcttcct ctgttatttc ctctgcagct gttgctacac gcaccaatgt tacacaagct 60
ggcagcatga ttgcaccttt cactggtctc aaatctgctg ctactttccc tgtttcaagg 120
aagcaaaacc ttgacatcac ttccattgct agcaatggtg gaagagttag gtgcatgcag 180
gtatggccac caattaacat gaagaagtac gagacactct cataccttcc tgatttgact 240
atgagctcaa ccgtcaaggt cgccgtcgcc acccccagga tgtcaatcaa ggcctccatg 300
<210> 21
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
Met Ala Pro Ser Val Met Ala Ser Ser Ala Thr Thr Val Ala Pro Phe
1 5 10 15
Gln Gly Leu Lys Ser Thr Ala Gly Met Pro Val Ala Arg Arg Ser Gly
20 25 30
Asn Ser Ser Phe Gly Asn Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys Met
35 40 45
<210> 22
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
atggccccct ccgtgatggc gtcgtcggcc accaccgtcg ctcccttcca ggggctcaag 60
tccaccgccg gcatgcccgt cgcccgccgc tccggcaact ccagcttcgg caacgtcagc 120
aatggcggca ggatcaggtg catg 144
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
gactgaattc atggcttcct ctgttatt 28
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
ccatggtacc catggaggcc ttgattga 28
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
catgggtacc atggagtacg gcttcaaa 28
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
gatcggatcc ttagtacccg ccggtgaa 28
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
tataggtacc atggcttcct ctgttat 27
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
tcgagatatc gcacctaact cttccaccat 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
agatgatatc atggagctaa tcacaaacgt 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
taatcccggg atggtgatgg tgatgatgcc 30
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
tataggtacc atggcttcct ctgttat 27
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 32
agatgtcgac gcacctaact cttccaccat 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 33
ggtggtcgac atgtcgcaac ataacgaaaa 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 34
taatcccggg ggcaggaatt ttgtcaatct 30
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 35
ccaactataa cggtcctaag gtagcg 26

Claims (16)

1.一种试剂组合，其特征在于，包括：
(i)第一核酸构建物，或含有所述第一核酸构建物的第一载体，所述第一核酸构建物具有从5’-3’的式I或结构：
P1-Z1-Z2-Z3 (I)或
P1-Z2-Z1-Z3 (I’)
其中，P1为第一启动子，；
Z1为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z2为编码第一光呼吸代谢改造支路蛋白的编码序列，所述第一光呼吸代谢改造支路蛋白为乙醇酸氧化酶(GLO)；
Z3为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列；
(ii)第二核酸构建物，或含有所述第二核酸构建物的第二载体，所述第二核酸构建物具有从5’-3’的式II所示的结构：
P2-Z4-Z5-Z6 (II)或
P2-Z5-Z4-Z6 (II’)
其中，P2为第二启动子；
Z4为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z5为编码第二光呼吸代谢改造支路蛋白的编码序列，所述第二光呼吸代谢改造支路蛋白为草酸氧化酶(OXO)；
Z5为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列；和
(iii)第三核酸构建物，或含有所述第三核酸构建物的第三载体，所述第三核酸构建物具有从5’-3’的式III所示的结构：
P3-Z7-Z8-Z9 (III)或
P3-Z7-Z8-Z9 (III’)
其中，P3为第三启动子；
Z7为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z8为编码第三光呼吸代谢改造支路蛋白的编码序列，所述第三光呼吸代谢改造支路蛋白为过氧化氢酶(CATC)；
Z9为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列。
2.一种试剂组合，其特征在于，包括：
(i)第一核酸构建物，或含有所述第一核酸构建物的第一载体，所述第一核酸构建物具有从5’-3’的式I结构：
P1-Z1-Z2-Z3 (I)或
P1-Z2-Z1-Z3 (I’)
其中，P1为第一启动子；
Z1为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z2为编码融合蛋白的编码序列，所述融合蛋白选自下组：乙醇酸氧化酶+草酸氧化酶、乙醇酸氧化酶+过氧化氢酶、草酸氧化酶+过氧化氢酶、乙醇酸氧化酶+草酸氧化酶+过氧化氢酶、或其组合；
Z3为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列；
(ii)第二核酸构建物，或含有所述第二核酸构建物的第二载体，所述第二核酸构建物具有从5’-3’的式II所示的结构：
P2-Z4-Z5-Z6 (II)或
P2-Z5-Z4-Z6 (II’)
其中，P2为第二启动子；
Z4为任选的编码叶绿体信号肽的编码序列；
Z5为编码第三元件的编码序列，所述第三元件为组成所述融合蛋白之外的元件，并且所述第三元件为乙醇酸氧化酶、草酸氧化酶、过氧化氢酶中的一种；
Z6为终止子；
并且，“-”为键或核苷酸连接序列；
当Z2为乙醇酸氧化酶+草酸氧化酶+过氧化氢酶，第二核酸构建物不存在。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或权利要求2所述的试剂组合。
4.一种调控植物农艺性状的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供一植物，作为亲代植物；
(ii)将权利要求1或权利要求2所述的试剂组合导入所述植物的植物细胞，从而调控植物农艺性状。
5.一种制备基因工程的植物细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)将权利要求1或权利要求2所述的试剂组合转染植物细胞，使得所述试剂组合中的所述构建物与所述植物细胞中的染色体发生重组，从而制得所述基因工程的植物细胞。
6.一种制备基因工程的植物细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)将权利要求1或权利要求2所述的试剂组合转染植物细胞，使得所述植物细胞含有所述试剂组合中的所述构建物，从而制得所述基因工程的植物细胞。
7.一种制备基因工程的植物的方法，其特征在于，包括步骤：
将权利要求5或权利要求6所述方法制备的所述基因工程的植物细胞再生为植物体，从而获得所述基因工程的植物。
8.一种基因工程的植物，其特征在于，所述的植物是用权利要求7所述的方法制备的。
9.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构如下式I或I’所示：
A-B (I)或
B-A (I’)
式中，
A为叶绿体信号肽，
B为光呼吸代谢改造支路蛋白，所述光呼吸代谢改造支路蛋白选自下组的两种或两种以上：乙醇酸氧化酶(GLO)、草酸氧化酶(OXO)、过氧化氢酶(CATC)；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。
10.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求9所述的融合蛋白。
11.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求10所述的多核苷酸。
12.一种基因工程细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求10所述的多核苷酸，或其基因组整合有权利要求10所述的多核苷酸。
13.一种产生权利要求9所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养权利要求12所述的基因工程细胞，从而表达融合蛋白；和/或
分离所述融合蛋白。
14.一种权利要求9所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于调控植物的农艺性状或制备调控植物的农艺性状的组合物或制剂，其中所述植物的农艺性状选自下组的一种或多种：
(i)光呼吸效率或速率；和/或
(ii)光合速率或速率；和/或
(iii)产量或；和/或
(iv)生物量；和/或
(v)叶绿素含量。
15.一种农用制剂，其特征在于，包括：
(a)权利要求9所述的融合蛋白、或其编码基因、或其表达载体(vector)；和
(b)农学上可接受的载体(carrier)。
16.一种调控植物农艺性状的方法，其特征在于，包括：
给植物施用权利要求15所述的农用制剂，从而调控植物的农艺性状。
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