BR112012019365A2 - método para aumentar a produção de biomassa, ácido nucleico, célula vegetal transgênica, planta transgênica e semente transgênica - Google Patents
método para aumentar a produção de biomassa, ácido nucleico, célula vegetal transgênica, planta transgênica e semente transgênica Download PDFInfo
- Publication number
- BR112012019365A2 BR112012019365A2 BR112012019365-1A BR112012019365A BR112012019365A2 BR 112012019365 A2 BR112012019365 A2 BR 112012019365A2 BR 112012019365 A BR112012019365 A BR 112012019365A BR 112012019365 A2 BR112012019365 A2 BR 112012019365A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- nucleic acid
- glycolate dehydrogenase
- transgenic
- fact
- fusion protein
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 63
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 108030005073 Glycolate dehydrogenases Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 22
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 claims abstract 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 88
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 32
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 21
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 16
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 7
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 6
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 6
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M Glycolate Chemical compound OCC([O-])=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 101150019455 gdh gene Proteins 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 101100235004 Acetobacterium woodii (strain ATCC 29683 / DSM 1030 / JCM 2381 / KCTC 1655 / WB1) lctD gene Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 5
- 101150106953 glcD gene Proteins 0.000 description 5
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 5
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 5
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 101150096901 glcF gene Proteins 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005097 photorespiration Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- ASCFNMCAHFUBCO-UHFFFAOYSA-N 2-phosphoglycolic acid Chemical compound OC(=O)COP(O)(O)=O ASCFNMCAHFUBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 101000717362 Acetabularia peniculus Ribulose bisphosphate carboxylase small subunit, chloroplastic 7 Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010049994 Chloroplast Proteins Proteins 0.000 description 2
- RBNPOMFGQQGHHO-UWTATZPHSA-N D-glyceric acid Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)=O RBNPOMFGQQGHHO-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- 101900314177 Escherichia coli Glyoxylate carboligase Proteins 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 2
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N phosphono 2,3-dihydroxypropanoate Chemical compound OCC(O)C(=O)OP(O)(O)=O KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- ZENKESXKWBIZCV-UHFFFAOYSA-N 2,2,4,4-tetrafluoro-1,3-benzodioxin-6-amine Chemical group O1C(F)(F)OC(F)(F)C2=CC(N)=CC=C21 ZENKESXKWBIZCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichloroindophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C1 CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YCHFCKWRGIPCMO-UHFFFAOYSA-N 2-(phenylhydrazinylidene)acetic acid Chemical compound OC(=O)C=NNC1=CC=CC=C1 YCHFCKWRGIPCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038837 2-Hydroxyacid oxidase 1 Human genes 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-XPULMUKRSA-N 2-hydroxyacetic acid Chemical compound [14C]([14CH2]O)(=O)O AEMRFAOFKBGASW-XPULMUKRSA-N 0.000 description 1
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 101100438273 Arabidopsis thaliana CAN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000566113 Branta sandvicensis Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 244000289527 Cordyline terminalis Species 0.000 description 1
- 235000009091 Cordyline terminalis Nutrition 0.000 description 1
- 102100034289 Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1 Human genes 0.000 description 1
- 108010036781 Fumarate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102100036160 Fumarate hydratase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101150104463 GOS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000641031 Homo sapiens Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1 Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 108010060641 flavanone synthetase Proteins 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 108010029645 galactitol 2-dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010062584 glycollate oxidase Proteins 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- FIJPWGLOBMXXSF-UHFFFAOYSA-M potassium;2-hydroxyacetate Chemical compound [K+].OCC([O-])=O FIJPWGLOBMXXSF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
- C12N15/8269—Photosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
MÉTODO PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE BIOMASSA, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA VEGETAL TRANSGÊNICA, PLANTA TRANSGÊNICA E SEMENTE TRANSGÊNICA
A invenção refere-se a um método para estimular o crescimento das plantas e/ou aprimorar a produção de biomassa e/ou aumentar a fixação de carbono pela planta que compreende introduzir em uma célula vegetal, tecido vegetal ou planta um ou mais ácidos nucleicos, em que a introdução do(s) ácidos (s) nucleico(s) resulta, dentro do cloroplasto, uma expressão de novo de um ou mais polipeptídeos que têm a atividade enzimática de uma glicolato desidrogenase formada a partir de subunidades traducionalmente fundidas de enzimas bacterianas de múltiplas subunidades glicolato desidrogenase.
Description
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A produtividade de colheita é influenciada por muitos fatores, entre os quais, por um lado, os fatores que influenciam a capacidade da planta para produzir biomassa (fotossíntese, absorção de nutriente e água) e, por outro lado, os fatores que influenciam a capacidade da planta para resistir determinados estresses, como, estresses bióticos (insetos, fungos, vírus...) ou estresses abióticos (seca, salinidade, escassez de nutrientes...). Um fator importante que influencia a produção de biomassa é a fotossíntese. À fotossíntese é o mecanismo através do qual as plantas capturam o dióxido de carbono atmosférico e transforma o mesmo em açúcar que, então, é incorporado aos tecidos vegetais criando, deste modo, a biomassa. À fotossíntese é a fonte fundamental de toda a produtividade primária na terra. A maioria das plantas tem um mecanismo fotossintético no qual a enzima cloroplástica RuBisCo (Ribulose- 1 ,5-Bifosfato Carboxilase/Oxigenase) é a enzima principal que captura o dióxido de carbono e transforma o mesmo em açúcar. Estas plantas, que incluem algumas das plantas de cultivo mais importantes, por exemplo, arroz, trigo, cevada, batata, semente de colza, pertencem às autodenominadas plantas C3. Um problema conhecido no mecanismo fotossintético das plantas C3 consiste no fato de que a eficiência da fixação de carbono não é ótima em determinadas condições ambientais, onde parte do carbono fixado é perdida através da atividade alternativa de —RuBisCo, chamada oxigenação. A RuBisCO é capaz de catalisar tanto a carboxilação como a oxigenação de ribulose-1 ,5-bifosfato. O equilíbrio entre estas duas atividades depende principalmente da razão entre CO2/Oz nas folhas, que pode alterar seguindo a reação da planta a determinadas condições ambientais. Cada reação de carboxilação produz duas moléculas de fosfoglicerato que entram no ciclo de Calvin, para formar essencialmente amido e sacarose e regenerar a ribulose-1,5-bifosfato. A reação de oxigenação produz moléculas únicas de — fosfoglicerato e fosfoglicolato. O último é reutilizado no fosfoglicerato através da fotorrespiração (Leegood R.C. et al, 1995). Uma molécula de CO, é liberada para cada duas moléculas de fosfoglicolato produzidas, resultando em uma perda líquida de carbono fixado que reduz essencialmente a produção de açúcares e biomassa. À amônia também é perdida nesta reação, e precisa ser refixada através das reações de consumo de energia no cloroplasto.
A superação da fotorrespiração tem sido relatada como um alvo para aumentar a eficiência máxima da fotossíntese e melhorar sua produtividade (Zhu et al., 2008) e diversas tentativas vêm sendo descritas até agora para reduzir a perda de carbono nas plantas e, portanto, aumentar a produção de açúcares e biomassa.
Kebeish et al. Relataram que as perdas fotorrespiratórias na Arabidopsis thaliana podem ser aliviadas introduzindo-se nos cloroplastos uma via bacteriana para o catabolismo do glicolato fotorrespiratório intermediário (WO 03/100066; Kebeish R. et al., 2007). Os autores miraram primeiro as três subunidades de glicolato desidrogenase de Escherichia coli a cloroplastos de Arabidopsis thaliana e, então, introduziram um glioxilato carboligase de Escherichia coli e semialdeído redutase tartrônica de Escherichia coli para concluir a via que converte glicolato em glicerato paralela à via fotorrespiratória endógena. Esta transformação nuclear gradual com os cinco genes de — Escherichia coli leva às plantas Arabidopsis em que o glicolato cloroplástico é diretamente convertido em glicerato. Estas plantas transgênicas crescem mais rápido, produzem mais biomassa de broto e raiz e contêm mais açúcares solúveis.
No PCT/EP2009/059843, descreve-se um método para aumentar a produção de biomassa e/ou produção de semente e/ou fixação de carbono nas plantas de arroz, em que a planta de arroz é transformada com as três subunidades (g/cD, g/cE e g/cF) de glicolato desidrogenase de Escherichia coli, sema introdução subsequente do glioxilato carboligase de Escherichia coli e semialdeído redutase tartrônica de Escherichia coli.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO O objetivo da presente invenção é explorar as fusões traducionais das subunidades de enzimas de glicolato desidrogenase (GDH) de múltiplas subunidades bacterianas em colheitas que evitam o processo demorado e inconveniente de múltiplas transformações ou de transformação com múltiplos cassetes de expressão. As subunidades bacterianas g/cD, g/cE e g/cF foram fundidas com ligantes flexíveis em diferentes disposições e testadas em cepas de E. coli deficientes em GDH que demonstram que as proteínas de fusão de múltiplas subunidades de GDH recombinante DEFp, EFDp e FDEp são ativas. As construções de melhor desempenho foram transferidas para as plantas de Nicotiana tabacum, arroz e semente de e as plantas transgênicas mostraram crescimento significativamente aumento e taxa fotossintética aprimorada. A presente invenção refere-se a um método para aumentar a produção de biomassa e/ou produção de semente e/ou fixação de carbono em plantas que compreende introduzir no genoma de uma célula vegetal um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase, em que a dita introdução de dito um ácido nucleico resulta em uma expressão de novo de um polipeptídeo sintético que tem a atividade enzimática de um glicolato desidrogenase e em que dito um polipeptídeo está localizado nos cloroplastos da planta produzida. No contexto da invenção, uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase é um polipeptídeo que consiste nas subunidades de um glicolato desidrogenase que são essenciais para a atividade de glicolato desidrogenase, geralmente com ligantes de peptídeo entres estas subunidades.
Na presente invenção selecionou-se a sequência ligante repetitiva (Gly/Ser; adequada para conectar de maneira covalente os domínios bacterianos glcD, glcE e glcF em um formato de poliproteína sem interferir nas propriedades desejadas, tais como, enovelamento, solubilidade e atividade de GDH apropriadas.
Além disso, o ligante não deve ser submetido à clivagem por proteases no citosol da planta, permitindo a superexpressão de poliproteina em cloroplastos.
No contexto da invenção, biomassa é a quantidade de matéria produzida por plantas individuais, ou pela área de superfície na qual as plantas se desenvolvem.
Diversos parâmetros podem ser medidos, a fim de determinar o aumento da produção de biomassa.
Exemplos de tais parâmetros consistem na altura da planta, superfície da folha, peso seco de broto, peso seco de raiz, número de sementes, peso de semente, tamanho de semente.
A produção de semente ou rendimento de semente pode ser medido por planta individual ou por área de superfície, onde as plantas se desenvolvem.
Estes parâmetros geralmente são medidos após um período de crescimento determinado em solo ou em uma etapa específica de crescimento, por exemplo, no final do período vegetativo, e comparados entre as plantas transformadas em um ou mais ácidos nucleicos, de acordo com a invenção e as plantas não transformadas em um ou mais tais ácidos nucleicos.
O aumento da fixação de carbono através da planta pode ser determinado ao medir os parâmetros de troca gasosa e fluorescência da clorofila.
Uma metodologia conveniente, que usa o sistema LI-6400 (Li-Cor) e o software fornecido pelo fabricante, é descrita em R.
Kebeish et al., 2007, e é incorporada no presente documento a título de referência.
O ácido nucleico envolvido no método da invenção codifica um polipeptídeo que tem a atividade enzimática de um glicolato desidrogenase.
A atividade de glicolato desidrogenase pode ser analisada de acordo com Lord J.M. 1972, que usa a tecnologia descrita no exemplo 6 do presente pedido.
5 De maneira alternativa, a análise de complementação com mutantes de E. coli deficiente nas três subunidades que formam o glicolato desidrogenase endógeno ativo pode ser realizada. Estes mutantes de E. coli são incapazes de crescer no glicolato como a única fonte de carbono. Quando a superexpressão de uma enzima nestes mutantes deficientes restabelece o crescimento da bactéria no meio que contém glicolato como a única fonte de carbono, isto significa que esta enzima codifica um equivalente funcional ao glicolato desidrogenase de E. coli. O método e os meios para a análise de complementação são descritos em Bari et al, 2004, e incorporados no presente documento a título de referência.
As moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo que tem a atividade enzimática de um glicolato desidrogenase podem ser produzidas por meio de técnicas de DNA recombinante (por exemplo, PCR), ou por meio de síntese química. A identificação e o isolamento de tais moléculas de ácido nucleico podem ocorrer usando-se as sequências, ou parte destas sequências, das moléculas de ácido nucleico de glicolato desidrogenases ou, como pode ser o caso, as cepas de complemento inversas destas moléculas, por exemplo, através de hibridização, de acordo com os métodos padrões (vide, por exemplo, Sambrook et al., 1989).
O glicolato desidrogenase, para o propósito da invenção, pode ser — qualquer glicolato desidrogenase de ocorrência natural, ou qualquer fragmento ativo deste ou qualquer variante deste, em que alguns aminoácidos (preferencialmente, 1 a 20 aminoácidos, mais preferencialmente, 1 a 10, ainda mais preferencialmente 1 a 5) foram substituídos, adicionados ou excluídos, de modo que a enzima mantenha sua atividade de glicolato desidrogenase.
De acordo com a presente invenção, entende-se que um "ácido nucleico" ou "molécula de ácido nucleico" é uma molécula de polinucleotídeo que pode ser do tipo DNA ou RNA, preferencialmente do tipo DNA e, em particular, de cadeia dupla. A mesma pode ser de origem natural ou sintética. Os ácidos nucleicos sintéticos são gerados in vitro. Os exemplos de tais ácidos nucleicos sintéticos são aqueles que os códons que codificam os polipeptídeos que têm a atividade enzimática de um glicolato desidrogenase, de acordo com a invenção, foram otimizados de acordo com o organismo hospedeiro no qual serão expressos (por exemplo, substituindo-se os códons por aqueles códons muito preferidos ou mais preferidos nas tabelas de uso de códon de tal organismo hospedeiro ou do grupo ao qual tal organismo hospedeiro pertence comparado ao hospedeiro original). Os métodos para otimização de códon são bem conhecidos para a pessoa versada na técnica.
As proteinas de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase são aquelas que consistem na fusão de subunidades de glicolato desidrogenase bacterianas, mais preferencialmente, aquelas que consistem na fusão das três subunidades essenciais codificadas pelo operon gle de E. coli (gil1141710/gb/L43490.1/ECOGLCC). Os polipeptídeos que compreendem as sequências de aminoácido fundidas de SEQ ID NOs: 2 (glcD), 4 (glcE) e 6 (glcF) são mais preferidos, em que estas sequências amino podem ser ligadas por um ligante. Consequentemente, um ácido nucleico que compreende as sequências de polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 pode ser usado para realizar a presente invenção.
O método da invenção abrange a introdução no genoma de uma célula vegetal de um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase, que tem a atividade enzimática de um glicolato desidrogenase, em que o dito polipeptídeo compreende sequências que têm uma identidade de sequência de pelo menos 60, 70, 80 ou 90%, particularmente, pelo menos 95%, 97%, 98% ou pelo menos 99% no nível de sequência de aminoácido com SEQ ID NO: 2, 4, e 6 respectivamente, em que a introdução do ácido nucleico resulta em uma expressão de novo de um polipeptídeo que tem a atividade enzimática de um glicolato desidrogenase e, em que a dita atividade está localizada dentro dos cloroplastos.
O método da invenção abrange também a introdução no genoma de uma célula vegetal de um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase, que tem a atividade enzimática de um glicolato desidrogenase, em que o dito ácido nucleico compreende sequências de ácido nucleico com pelo menos 60, 70, 80 ou 90 %, particularmente, pelo menos 95%, 97%, 98% ou pelo menos 99%, a identidade de sequência com as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, 3,e5,respectivamente, em que a introdução do ácido nucleico resulta em uma expressão de novo de pelo menos um polipeptídeo que tem a atividade enzimática de um glicolato desidrogenase, e em que a atividade está localizada dentro dos cloroplastos.
Para o propósito desta, a "identidade de sequência" de duas sequências de nucleotídeo ou aminoácido relacionadas, expressa como uma porcentagem se refere ao número de posições nas duas sequências otimamente alinhadas que têm resíduos idênticos (x100) divididos pelo número de posições comparadas.
Um vão, isto é, uma posição em um alinhamento, onde um resíduo está presente em uma sequência, porém, não na outra, é referido como uma posição com resíduos não idênticos.
O alinhamento das duas sequências pode ser realizado pelo algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch 1970) em EMBOSS (Rice et al., 2000) para encontrar o alinhamento ótimo ao longo de todo o comprimento das sequências, usando configurações padrões (penalidade de abertura de vão 10, penalidade de extensão de vão 0,5). Uma vez que a sequência de um DNA exógeno é conhecida, podem ser desenvolvidos iniciadores e sondas que reconheçam especificamente estas sequências no ácido nucleico (DNA ou RNA) de uma amostra por meio de uma técnica biológica molecular. Por exemplo, um método PCR pode ser desenvolvido para identificar os genes usados no método da invenção (genes gdh) nas amostras biológicas (tais como, amostras de plantas, material vegetal ou produtos que compreendem material vegetal). Tal PCR é baseado em pelo menos dois "iniciadores", por exemplo, ambos que reconhecem uma sequência dentro da região de codificação gdh usada na invenção (tal como, a região de codificação de SEQ ID NO: 1, 3, 5), ou um que reconhece uma sequência dentro da região de codificação gdh e outro que reconhece uma sequência dentro da sequência peptídica de transito associada oudentrodas regiões regulatórias, tais como, o promotor ou extremidade 3' do gene quimérico que compreende um DNA gdh usado na invenção. Os iniciadores têm preferencialmente uma sequência entre 15 e 35 nucleotídeos que sob condições PCR otimizadas reconhecem especificamente uma sequência dentro do gene quimérico gdh usado na invenção, de modo que um fragmento específico ("fragmento de integração" ou amplicon discriminante) seja amplificado a partir de uma amostra de ácido nucleico que compreende um gene gdh usado na invenção. Isto significa que apenas o fragmento de integração almejado, e não outra sequência no genoma da planta ou DNA exógeno, é amplificado sob condições PCR amplificadas.
O método da invenção abrange também a introdução no genoma de uma célula vegetal de um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase, que tem a atividade enzimática de um glicolato desidrogenase, em que dito um ácido nucleico hibridiza sob condições restritivas em uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 1,3, e 5, em que a introdução do ácido nucleico resulta em uma expressão de novo de um polipeptídeo que tem a atividade enzimática de um glicolato desidrogenase, e em que a dita
— atividade está localizada dentro dos cloroplastos.
As condições de hibridização restritivas, conforme usado no presente documento, se referem particularmente às seguintes condições: imobilizar as sequências de DNA relevantes em um filtro, e pré-hibridizar os filtros a cada 1 a 2 horas em 50% de formamida, 5% de SSPE, 2x reagente de Denhardt e 0,1% de SDS a 42 ºC, ou 1 a 2 horas em 6x
SSC,2xreagente de Denhardt e 0,1% de SDS a 68 ºC.
A sonda marcada por escavação ou rádio desnaturada, então, é diretamente adicionada ao fluido de pré-hibridização e a incubação é realizada por 16 a 24 horas na temperatura apropriada mencionada acima.
Após a incubação, os filtros, então, são lavados por 30 minutos em temperatura ambiente em 2x SSC, 0,1 % de SDS, seguidos
—por2lavagens de 30 minutos cada a 68 ºC em 0,5 x SSC e 0,1% de SDS.
Uma autorradiografia é estabelecida expondo-se os filtros por 24 a 48 horas a uma película de raios-X (Kodak XAR-2 ou equivalente) a -70 ºC com uma tela de intensificação.
Certamente, as condições e parâmetros equivalentes podem ser usados neste processo enquanto ainda retêm as condições de hibridização restritivas desejadas.
A terminologia DNA ou proteína "que compreende" uma determinada sequência X, conforme usada ao longo do texto, se refere a um DNA ou proteína que inclui ou contém pelo menos a sequência X, de modo que outras sequências de nucleotídeo ou aminoácido possam ser incluídas no terminal 5' (ou terminal N) e/ou 3' (ou terminal OC), por exemplo, uma proteína
—marcadora selecionável (a codificação de sequência de nucleotídeo), um peptídeo de trânsito (a codificação de sequência de nucleotídeo), e/ou a sequência líder 5' ou uma sequência final 3. De maneira similar, o uso dos termos "compreendem", "que compreende" ou "compreende" ao longo do texto e das reivindicações neste pedido devem ser entendidos indicando a inclusão de um número inteiro ou etapa estabelecida ou grupo de números inteiros ou etapas, porém, não a exclusão de qualquer número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.
O método da presente invenção consiste em instalar uma atividade de glicolato desidrogenase dentro do cloroplasto. Isto pode ser feito introduzindo-se o ácido nucleico que codifica a atividade de glicolato desidrogenase no genoma nuclear das células vegetais, a sequência de codificação da proteína, então, é fundida a um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto. De maneira alternativa, a atividade de glicolato desidrogenase pode ser colocada no cloroplasto através da transformação direta do genoma do cloroplasto no ácido nucleico que codifica a enzima correspondente.
As técnicas gerais para transformar as células vegetais ou tecidos vegetais podem ser usadas. Uma série de métodos compreende bombardear células, protoplastos ou tecidos com partículas as quais as sequências DNA são ligadas. Outra série de métodos compreende usar, como o meio para transferir para a planta, um gene quimérico que é inserido em um plasmídeo Ti Agrobacterium tumefaciens ou um plasmídeo Ri Agrobacterium rhizogenes.
Outros métodos podem ser usados, tais como, microinjeção ou eletroporação ou, de outro modo, precipitação direta usando PEG. A pessoa versada na técnica pode selecionar qualquer método apropriado e meios para transformar a célula vegetal ou a planta.
Para o propósito de expressar o ácido nucleico que codifica o —polipeptídeo que tem a atividade enzimática, conforme requerido para a presente invenção, em células vegetais, quaisquer sequências regulatórias convenientes podem ser usadas. As sequências regulatórias irão proporcionar iniciação transcricional e traducional, assim como, regiões de terminação, onde
1" a iniciação transcricional pode ser constitutiva ou induzível.
A região de codificação é operavelmente ligada a tais sequências regulatórias.
As sequências regulatórias adequadas são representadas pelo promotor 35S constitutivo.
De maneira alternativa, o promotor da ubiquitina constitutiva pode ser usado, em particular, o promotor da ubiquitina de milho (GenBank: gi19700915). Os exemplos de promotores induzíveis representam os promotores induzíveis leves da pequena subunidade de RUBISCO e os promotores das proteínas de ligação complexas de colheita leve (lhcb). De maneira vantajosa, a região promotora do gene gos2 de Oryza sativa que inclui oUTR5S' do gene GOS2 com íntron (de Pater et al., 1992), a região promotora do gene da pequena subunidade de ribulose-1,5-bifosfato carboxilase de Oryza sativa (Kyozuka J. et al., 1993), ou a região promotora do gene da actina 1 de Oryza sativa (McElroy D. et al., 1990) pode ser usada.
De acordo com a invenção, pode-se fazer uso também, em combinação com o promotor, de outras sequências regulatórias, que estão localizadas entre o promotor e a sequência de codificação, tais como, ativadores de transcrição ("acentuadores"”), por exemplo, o ativador de tradução do vírus do mosaico do tabaco (TMV) descrito no pedido WO 87/07644, ou do vírus etch do tabaco (TEV) descrito por Carrington & Freed 1990, por exemplo, ou íntrons, tal como, o íntron adh! do milho ou íntron 1 de actina do arroz.
Como um terminador regulatório ou sequência de poliadenilação, o uso pode ser feito de qualquer sequência correspondente de origem bacteriana, tal como, por exemplo, o terminador nos de Agrobacterium tumefaciens, de origem viral, tal como, por exemplo, o terminador CaMV 358, ou de origem vegetal, tal como, por exemplo, um terminador histona, conforme descrito no pedido EP 0 633 317. Em uma realização particular da invenção na qual a transformação do genoma nuclear é preferida, um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto emprega-se 5' da sequência de ácido nucleico que codifica um glicolato desidrogenase, em que esta sequência de peptídeo de trânsito é disposta entre a região promotora e o ácido nucleico que codifica o glicolato desidrogenase, a fim de permitir a expressão de uma proteína de fusão de peptídeo de trânsito/glicolato desidrogenase.
O peptídeo de trânsito torna possível direcionar o glicolato desidrogenase para dentro dos plastídeos, mais especificamente, os cloroplastos, em que a proteína de fusão é clivada entre o peptídeo de trânsito e o glicolato desidrogenase quando o último entrar no plastídeo.
O peptídeo de trânsito pode ser um único peptídeo, tal como, um peptídeo de trânsito EPSPS (descrito na patente US 5.188.642) ou um peptídeo de trânsito da pequena subunidade de ribulose biscarboxilase/oxigenase da planta (RUBisCO ssu), por exemplo, o peptídeo de trânsito de cloroplasto derivado do gene ribulose-1 ,5-bifosfato carboxilase de Solanum tuberosum (GenBank: gene gi21562, que codifica a proteína G68077, aminoácidos 1-58), onde apropriado, incluindo alguns aminoácidos da parte de terminal N do RUBisCO ssu maduro (EP 189 707), ou do peptídeo direcionador de cloroplasto do gene rbcS1 da batata (gi21562). Um peptídeo de trânsito pode ser o peptídeo de trânsito de ocorrência totalmente natural (tipo selvagem), um fragmento funcional deste, um mutante funcional deste.
O mesmo também pode ser um peptídeo de trânsito quimérico, em que pelo menos dois peptídeos de trânsito são associados uns aos outros ou em que partes de diferentes peptídeos de trânsito são associados uns aos outros de uma maneira funcional.
Um exemplo de tal peptídeo de trânsito quimérico compreende um peptídeo de trânsito do RuBisCO ssu de girassol fundido à parte de terminal N do RuBisCO ssu de milho, fundido ao peptídeo de trânsito do RuBisCO ssu de milho, conforme descrito na patente EP 508 909. De maneira alternativa, os polipeptídeos podem ser diretamente expressos no cloroplasto que usa a transformação do genoma de cloroplasto. Os métodos para integrar os ácidos nucleicos de interesse no genoma de cloroplasto são conhecidos na técnica, em particular, os métodos baseados no mecanismo de recombinação homóloga. Os vetores e sistemas de seleção — adequados são conhecidos para a pessoa versada na técnica. As sequências de codificação para os polipeptídeos podem ser transferidas em vetores individuais ou em uma construção, onde os quadros abertos de leitura individuais podem ser fundidos em um ou diversos RNAs policistrônicos com locais de ligação de ribossomo adicionados na frente de cada quadro aberto de leitura individual, a fim de permitir a tradução independente. Um exemplo de meios e métodos que podem ser usados para tal integração no genoma de cloroplasto é fornecido, por exemplo, no WO 06/108830, o conteúdo deste é incorporado no presente documento a título de referência. Quando os ácidos nucleicos forem diretamente integrados no genoma de cloroplasto, uma sequência de peptídeo de trânsito não é requerida. Neste caso, o códon de início de tradução (Met) pode ser adicionado à sequência que codifica uma proteina madura para assegurar a iniciação da tradução. O assunto em questão da presente invenção também consiste em ácidos nucleicos que codificam uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase.
Em uma realização particular, o ácido nucleico da invenção codifica uma proteina de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase que compreende uma sequência de aminoácido que direciona a dita proteína para o cloroplasto.
Em outra realização particular, o ácido nucleico da invenção codifica uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase que é a fusão de subunidades de glicolato desidrogenase bacterianas.
Em outra realização particular, o ácido nucleico da invenção codifica uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase que é a fusão das três subunidades codificadas pelo operon gle de E. coli. Em outra realização particular, o ácido nucleico da invenção codifica uma proteina de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase que compreende sequências de aminoácidos que têm pelo menos 60% de identidade de sequência com as sequências de SEQ ID NOs: 2, 4 e 6 respectivamente. Em outra realização particular, o ácido nucleico da invenção codifica uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase que compreende sequências de polinucleotídeos que têm pelo menos 60% de identidade de sequência com as sequências de polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 respectivamente.
O assunto em questão da presente invenção também consiste em células vegetais, tecidos vegetais, plantas e partes ou sementes destas, que compreendem um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase e expressam dentro do cloroplasto um polipeptídeo que tem a atividade enzimática de glicolato desidrogenase.
As realizações particulares dos ácidos nucleicos introduzidos nas células vegetais, tecidos vegetais, plantas e partes ou sementes destas são mencionadas acima.
A presente invenção também se refere a plantas que contêm células transformadas, em particular, plantas que são regeneradas a partir das células transformadas. A regeneração pode ser obtida através de qualquer método adequado. As patentes e pedidos de patente a seguir podem ser citados, em particular, em relação aos métodos para transformar as células vegetais e plantas de regeneração: US 4.459.355, US 4.536.475, US
5.464.763, US 5.177.010, US 5.187.073, EP 267.159, EP 604 662, EP 672 752, US 4.945.050, US 5.036.006, US 5.100.792, US 5.371.014, US 5.478.744, US
5.179.022, US 5.565.346, US 5.484.956, US 5.508.468, US 5.538.877, US
5.554.798, US 5.489.520, US 5.510.318, US 5.204.253, US 5.405.765, EP 442 174, EP486233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 e WO 95/06128.
A presente invenção também se refere a plantas transformadas ou partes destas, que são derivadas através do cultivo e/ou cruzamento das plantas regeneradas acima, e das sementes das plantas transformadas, caracterizadas pelo fato de que elas contêm uma célula vegetal transformada, de acordo com a invenção.
Em uma realização particular da invenção, as plantas transformadas, ou partes destas, são selecionadas a partir de arroz, trigo, cevada, batata, semente de colza, tabaco.
Em uma realização particular da invenção, as sementes transgênicas, e a farinha, óleo ou alimento obtidos a partir destas, são arroz, trigo, cevada, semente de colza ou plantas de tabaco. A presente invenção também se refere a quaisquer produtos, tais como, a farinha, que são obtidos processando-se as plantas, partes destas ou sementes da invenção. Por exemplo, a invenção abrange grãos obtidos a partir do processamento das sementes, de acordo com a invenção, mas, também, a farinha obtida a partir do processamento adicional das sementes ou dos grãos, assim como, qualquer produto alimentício obtido a partir da dita farinha.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1 - sequência de Escherichia coli gel D DNA SEQ ID NO: 2 - sequência de aminoácido codificada por SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3 - sequência de Escherichia coli gel E DNA
SEQ ID NO: 4 - sequência de aminoácido codificada por SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5 - sequência de Escherichia coli gel F DNA SEQ ID NO: 6 - sequência de aminoácido codificada por SEQ ID NOS5
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1: Projeto dos cassetes de fusão de múltiplas subunidades sintéticas. glcD, glcE e glcF: codificação de genes bacterianos para as subunidades D, E e F do ligante GDH. |: (Glya/Ser)3. T: etiqueta de His6.
Seta: local de clivagem com enteroquinase. Os locais de restrição introduzidos são indicados.
Figura 2: Parâmetros de crescimento de linhagens transgênicas e não transgênicas. A: Fenótipo de plantas transgênicas de 4 semanas To que produzem DEFp no cloroplasto. B: Área foliar de plantas de tabaco de 7 semanas. DEFp (n=6), EFDp (n=5), FDEp (n=4), C: plantas não transgênicas N. tabacum cv. Petit Havana SR1 (n=6) EXEMPLO 1: PROJETO DE CONSTRUÇÕES DE GENE DE MÚLTIPLAS SUBUNIDADES
SINTÉTICAS Os cDNAs g/cD, 9/cE e g/cF bacterianos que codificam para as subunidades D, E e F do GDH foram fundidos com um ligante flexível que codifica para o tema (Gly/Ser); em uma construção de gene de múltiplas subunidades (Figura 1). Os locais de restrição indicados na Figura 1 foram introduzidos para permitir a redisposição das subunidades g/cD, g/cE e glcF e a —subclonagem dos cassetes de múltiplas subunidades dentro dos vetores de expressão bacterianos e vegetais. Além disso, os locais de restrição interna (Pstl/Sal/ e Ncol/Xhol) foram introduzidos para facilitar a troca do ligante (Gly/Ser)s com outros ligantes flexíveis. Além disso, a geração de dois cassetes de fusão de genes será possível excluindo-se o cDNA na posição intermediária através dos locais de restrição Sal/Xhol. A etiqueta de His6 de terminal C foi introduzida para permitir a detecção e purificação das proteínas recombinantes. Para evitar uma interferência potencial da etiqueta de His6 na atividade enzimática da enzima GDH de múltiplas subunidades um local de clivagem com enteroquinase é adicionado a montante da etiqueta de His6 que permite a remoção da etiqueta do terminal C. EXEMPLO 2: SÍNTESE DOS CASSETES DE FUSÃO DE MÚLTIPLAS SUBUNIDADES Três cassetes de fusão de múltiplas subunidades que contêm os três cCDNAs de subunidade bactéria em três disposições diferentes glcD-glcE- glcF , glcE-gicF-glcD e gicF-glcD-glcE foram projetados e os genes sintéticos de codificação para os polipeptídeos correspondentes DEFp, EFDp e FDEp, respectivamente, foram sintetizados. Antes da síntese, os genes sintéticos foram códon otimizados para rendimentos de expressão máxima de acordo com o uso de códon de Brassica napus. Além disso, com base em um algoritmo genético, os genes sintéticos foram simultaneamente otimizados por um grande conjunto de parâmetros competentes, tais como, estrutura MRNA secundária, locais de junção ocultos, repetições de codon e tema e conteúdo GC homogêneo. EXEMPLO 3: ANÁLISE DE COMPLEMENTAÇÃO COM MUTANTES DE E. COLI DEFICIENTE
ATIVO Para determinar se DEFp, EFDp e FDEp são capazes de complementar os glicolato oxidase mutantes de E. coli a análise de complementação foi feita com a E. coli mutante JAI55 que transporta a inserção do transposon na subunidade glcD do operon glc e é incapaz de crescer no glicolato como uma única fonte de carbono. A super-expressão de
DEFp, EFDp e FDEp neste mutante restabeleceu o crescimento de bactéria no meio que contém glicolato como a única fonte de carbono, que indica que todas as três poliproteinas são funcionais in vivo e podem complementar a subunidade glcD da enzima EcGO ativa.
EXEMPLO 4: SUBCLONAGEM DE CDNAs DEFP, EFDP E FDEP NOS VETORES DE
EXPRESSÃO DE PLANTA Para avaliar o efeito in vivo das múltiplas subunidades de poliproteínas bacterianas DEFp, EFDp e FDEp na atividade GDH e produção de biomassa em plantas N. tabacum cv. Petit Havanna SR1, os cDNAs que codificam DEFp, EFDp e FDEp foram inseridos em um vetor de expressão de planta que permite que a proteína recombinante seja direcionada para os cloroplastos da célula vegetal. A expressão do transgene é acionada pelo promotor CaMV 358 com a região acentuadora duplicada.
O cDNA DEFp sintetizado foi inicialmente inserido no vetor ponte — pTRAkc que usa os locais de restrição EcoRI e Xbal a montante do terminador CaMV 358 que gera o plasmídeo pTRA-nptll-DEFp. O plasmídeo pTRA contém a região de interação com a matriz do gene do tabaco RB7 (gi3522871 ) e o cassete nptll de pPCVO002 (Konz e Schell, 1986) para a seleção de plantas transgênicas na canamicina (Figura 2). Subsequentemente, o promotor CaMV 358 duplo acentuado constitutivo, a região não traduzida 5' do gene de calcona sintase e do direcionador de cloroplasto sequência do gene rbcS1 da batata foi amplificada através de PCR usando como modelo o plasmídeo pTRAkc-rbes1- cTP. O fragmento PCR amplificado foi, então, subclonado no pTRA-nptll-DEF usando os locais de restrição Ascl e Aatll.
A clonagem de cDNAs EFDp e FDEp no vetor de expressão de planta foi realizada de uma maneira similar. As três construções finais foram designadas: pTRA-35S-rbes-cTP:DEFp, pTRA-35S-rbes- cCTP:EFDp e pTRA- 35S-rbes-cTP:FDEp, respectivamente.
EXEMPLO 5: TRANSFORMAÇÃO E REGENERAÇÃO DA PLANTA DE TABACO Os vetores de expressão de planta foram introduzidos nas células Agrobacterium tumefaciens GV3101 usando um sistema de eletroporação Gene Pulser Il (BioRad, Hercules, CA, USA), de acordo com as instruções do — fabricante. Para investigar o efeito do acúmulo DEFp, EFDp e FDEp nas plantas de tabaco estavelmente transformadas (N. tabacum cv. Petit Havana SR1), as plantas transgênicas To foram geradas através da transformação de disco foliar com recombinante A. tumefaciens (Horsch et al., 1985) usando canamicina como um marcador de seleção. As plantas geradas foram cultivadas na estufa em solo padrão DE73 com um fotoperíodo de 16h de luz natural e temperatura de 22 ºC de dia/20 ºC à noite.
Até 33 plantas transgênicas To foram classificadas para a presença do transgene e da proteína recombinante através da multiplexação de PCR e análise immunoblot, respectivamente. 33-48% das linhas testadas produziram DEFp, EFDp ou FDEp, respectivamente, no tamanho molecular esperado de 142 kDa. Sete linhas To que mostram o nível mais alto das proteínas recombinantes (0,03 a 0,09 % da proteína solúvel total) foram usadas para estabelecer a geração T,;.
EXEMPLO 6: ISOLAMENTO DE CLOROPLASTOS E ENSAIOS ENZIMÁTICOS Cloroplastos intactos foram isolados usando o procedimento descrito por Kleffmann et al., 2007. Estas preparações são livres de atividade de catalase e fumarase contaminante (> 95% de pureza).
As atividades de glicolato desidrogenase foram medidas conforme descrito em Lord J.M., 1972. 100 ug de extrato de proteína de cloroplasto são — adicionados em 100 umol de fosfato de potássio (pH 8,0), 0,2 umol de DCIP, 0,1 ml! 1% (w/v) de PMS, e 10 umol de glicolato de potássio em um volume final de 2,4 ml. Em intervalos de tempo fixos, ensaios individuais são concluídos através da adição de 0,1 ml de 12 M HCI. Após descansar por for 10 min., 0,5 ml de 0,1 M de fenilidrazina-HCI foi adicionado. Permitiu-se que a mistura descansasse por 10 min. adicionais e, então, a extinção devido à formação de glioxilato fenilidrazona foi medida em 324 nm. EXEMPLO 7: LIBERAÇÃO DE C02 A PARTIR DO GLICOLATO MARCADO EM EXTRATOS
DE CLOROPLASTOS 1 uCi de [1, 2-14C]-glicolato (Hartmann Analytics) é adicionado em 50 ug de extrato de proteína de cloroplasto em um tubo de reação hermeticamente fechado de 15-ml. O CO, liberado é absorvido em um tubo de reação de 500 ul contendo 0,5 M de NaOH ligado à parede interna do tubo de 15-ml. As amostras foram incubadas por 5h e a fase gasosa no tubo de reação é frequentemente misturada com uma seringa. EXEMPLO 8: AVALIAÇÃO DO FENÓTIPO DE PLANTAS QUE EXPRESSAM E. coLI GDH O crescimento das plantas transgênicas que produz a proteína recombinante DEFp, EFDp ou FDEp no cloroplasto, foi monitorado pelas medições de área foliar, de acordo com a fórmula: área foliar (om?) = 373 (Porco deram a) + 0011, (rrrmenaterae? As linhagens transgênicas de tabaco To que produzem de maneira constitutiva DEFp, EFDp ou FDEp, respectivamente, mostraram um aumento significativo da área foliar (1,54-, 1,75- e 1,5-dobras, respectivamente p<0,05), comparado às plantas de controle não transgênicas (Figura 2). Além disso, as plantas transgênicas tinham mais folhas que o tipo selvagem SR1 e pequenas folhas adicionais além de grandes. O desempenho fotossintético das plantas transgênicas foi monitorado através de Licor LI-B400 por medições do ponto de assimilação e compensação de CO, aparente. A taxa aparente das condições ambientes sob assimilação de CO? foi significativamente aumentada nas plantas transgênicas DEFp e EFDp comparada àquelas do tipo selvagem. Além disso, as linhagens transgênicas de DEFp tiveram uma redução significativa (P<0,05) de pontos de compensação de CO, (CO, a 54 p.p.m.) comparadas ao controle (CO, a 64 p p.m.), que indica as taxas fotossintéticas mais altas para as linhagens DEFp To.
A biomassa acentuada e a fotorrespiração reduzida foram confirmadas na geração T, (Tabela 1) e To.
Além disso, o desempenho do tipo selvagem e das linhagens transgênicas desenvolvidas sem suplementação com fertilizante foi analisado na geração T,. Sob estas condições, as plantas de tabaco que superexpressam as poliproteinas DEFp, EFDp e FDEp mostraram clorose reduzida e produção de biomassa mais alta que o controle do tipo selvagem.
Tabela 1: Análise de crescimento de DEFp, EFDp ou FDEp que produzem plantas Ti.
Todos os dados se baseiam em quatro replicas biológicas independentes e padronizadas em relação às plantas de controle ázigas (n > 15). As plantas foram desenvolvidas sem ou com 2% de suplementação com fertilizante em água.
NENE: aumento aumento aumento redução de redução de FW DW altura CO, c.P. inibição de +- +- +- O, Fertilizante Fertilizante Fertilizante | oem | s2ors | sesme | sem | o | 5 | emo | ramo | ienes | ssss É ns | 5 Tomados em conjunto, estes dados indicam que as plantas que produzem a poliproteina de glicolato desidrogenase bacteriana em seu cloroplasto têm um aumento significativo de biomassa e taxa fotossintética aprimorada.
Claims (22)
1. MÉTODO PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE BIOMASSA, e/ou produção de semente e/ou fixação de carbono em plantas, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir no genoma de uma célula vegetal um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase, em que a dita introdução do dito um ácido nucleico resulta em uma expressão de novo de um polipeptídeo que tem a atividade enzimática de um glicolato desidrogenase e em que dito um polipeptídeo está localizado nos cloroplastos da planta produzida.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita introdução de dito um ácido nucleico é efetuada no genoma nuclear das células vegetais, e em que dito um ácido nucleico codifica um polipeptídeo que compreende um fragmento de aminoácido que direciona o polipeptídeo para o cloroplasto.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que dita proteina de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase é aquela que consiste na fusão de subunidades de glicolato desidrogenase bacterianas.
4, MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase é aquela que consiste na fusão das três subunidades codificadas pelo operon glc de E. coli.
5. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão de múltiplas subunidades de —glicolato desidrogenase compreende sequências de aminoácidos que têm pelo menos 60% de identidade de sequência com as sequências de SEQ ID NOs: 2, 4 e 6 respectivamente.
6. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5,
caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase compreende sequências de polinucleotídeos que têm pelo menos 60% de identidade de sequência com as sequências de polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 — respectivamente.
7. ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase.
8. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase compreende uma sequência de aminoácido que direciona dita proteína para o cloroplasto.
9. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que dita proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase é aquela que consiste na fusão de subunidades de —glicolato desidrogenase bacterianas.
10. — ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que dita proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase é aquela que consiste na fusão das três subunidades codificadas pelo operon glc de E. coli.
11. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que a dita proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase compreende sequências de aminoácidos que têm pelo menos 60% de identidade de sequência com as sequências de SEQ ID NOs: 2, 4 e ad 6, respectivamente.
12. — ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase compreende sequências de polinucleotídeos que têm pelo menos 60% de identidade de sequência com as sequências de polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 1,3 e 5, respectivamente.
13. “CÉLULA VEGETAL TRANSGÊNICA, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão —demúltiplassubunidades de glicolato desidrogenase.
14. CÉLULA VEGETAL TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a proteina de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase compreende uma sequência de aminoácido que direciona dita proteína para o cloroplasto.
15. — CÉLULA VEGETAL TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que dita proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase é aquela que consiste na fusão de subunidades de glicolato desidrogenase bacterianas.
16. — CÉLULA VEGETAL TRANSGÊNICA, de acordo com uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada pelo fato de que dita proteina de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase é aquela que consiste na fusão das três subunidades codificadas pelo operon glc de E. coli.
17. CÉLULA VEGETAL TRANSGÊNICA, de acordo com uma das reivindicações 13 a 16, caracterizada pelo fato de que dita proteína de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase compreende sequências de aminoácidos que têm pelo menos 60% de identidade de sequência com as sequências de SEQ ID NOs: 2, 4 e 6, respectivamente.
18. — CÉLULA VEGETAL TRANSGÊNICA, de acordo com uma das reivindicações 13 a 17, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica uma proteina de fusão de múltiplas subunidades de glicolato desidrogenase compreende sequências de polinucleotídeos que têm pelo menos 60% de identidade de sequência com as sequências de polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 1, 3 e 5, respectivamente.
19. — PLANTA TRANSGÊNICA, e parte desta, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula vegetal transgênica, conforme definida em uma das reivindicações 13 a 18.
20. — PLANTA TRANSGÊNICA, e parte desta, de acordo com a — reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir de arroz, trigo, cevada, batata, semente de colza, tabaco.
21. SEMENTE TRANSGÊNICA, e farinha, óleo ou alimento obtido a partir desta, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula vegetal transgênica, conforme definida em uma das reivindicações 13 a 18.
22. — SEMENTE TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir de arroz, trigo, cevada, semente de colza, tabaco.
Fig. 1 Aatll Pstt Sal Ncol Xhol | EcoRIN Less de a VAI Not RA O xD Aatll Pstt Sah Necol Xhol L ECORI sussa ISSN ida o as as " álel, Not E a A A dóra See Or a a 91 r Aatil Pstl Sal Necol Xhol ba EcoRI-J. 1 Less: sussa PAlE! Not Da 915 a
Fig. 2
A EEE o Lo DR A A o ANS à a) A am bh a EA seed a a E. SS A E ad a Control: Pa o ll e DEFD-S S o , DEFp-B DEFP2
B 35 : o SS | 7 SS " S SS o o fome o | e e < 1 ms se AN : o p EFDp FDEp Cc
ResumMO “MÉTODO PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE BIOMASSA, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA VEGETAL TRANSGÊNICA, PLANTA TRANSGÊNICA E SEMENTE TRANSGÊNICA”
A invenção refere-se a um método para estimular o crescimento das plantas e/ou aprimorar a produção de biomassa e/ou aumentar a fixação de carbono pela planta que compreende introduzir em uma célula vegetal, tecido vegetal ou planta um ou mais ácidos nucleicos, em que a introdução do(s) ácido(s) nucleico(s) resulta, dentro do cloroplasto, uma expressão de novo de um ou mais polipeptídeos que têm a atividade enzimática de uma glicolato desidrogenase formada a partir de subunidades traducionalmente fundidas de enzimas bacterianas de múltiplas subunidades glicolato desidrogenase.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP10152714 | 2010-02-04 | ||
| EP101527141 | 2010-02-04 | ||
| PCT/EP2011/051505 WO2011095528A1 (en) | 2010-02-04 | 2011-02-03 | A method for increasing photosynthetic carbon fixation using glycolate dehydrogenase multi-subunit fusion protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112012019365A2 true BR112012019365A2 (pt) | 2020-08-25 |
Family
ID=42061919
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112012019365-1A BR112012019365A2 (pt) | 2010-02-04 | 2011-02-03 | método para aumentar a produção de biomassa, ácido nucleico, célula vegetal transgênica, planta transgênica e semente transgênica |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9371538B2 (pt) |
| EP (1) | EP2531602B1 (pt) |
| CN (1) | CN102858982B (pt) |
| AR (1) | AR080128A1 (pt) |
| BR (1) | BR112012019365A2 (pt) |
| CA (1) | CA2788238C (pt) |
| MY (1) | MY169476A (pt) |
| RU (1) | RU2651501C2 (pt) |
| UY (1) | UY33216A (pt) |
| WO (1) | WO2011095528A1 (pt) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2014125077A (ru) | 2011-11-21 | 2015-12-27 | Байер Интеллекчуал Проперти Гмбх | Фунгицидные n-[(тризамещенный силил)этил]-карбоксамидные производные |
| KR20140096391A (ko) | 2011-11-30 | 2014-08-05 | 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 | 살진균성 ｎ-바이시클로알킬 및 ｎ-트리시클로알킬 피라졸-４-(티오)카르복사미드 유도체 |
| EP2797891B1 (en) | 2011-12-29 | 2015-09-30 | Bayer Intellectual Property GmbH | Fungicidal 3-[(pyridin-2-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substituted-1,2,4-oxadiazol-5(2h)-one derivatives |
| BR112014015993A8 (pt) | 2011-12-29 | 2017-07-04 | Bayer Ip Gmbh | composto, composição, método para o controle dos fungos, utilização dos compostos e processo para a produção das composições |
| PL2908642T3 (pl) | 2012-10-19 | 2022-06-13 | Bayer Cropscience Ag | Sposób wzmacniania tolerancji roślin na stres abiotyczny z zastosowaniem pochodnych karboksyamidowych lub tiokarboksyamidowych |
| JP6153619B2 (ja) | 2012-10-19 | 2017-06-28 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | カルボキサミド誘導体を含む活性化合物の組み合わせ |
| US20150259294A1 (en) | 2012-10-19 | 2015-09-17 | Bayer Cropscience Ag | Method of plant growth promotion using carboxamide derivatives |
| JP6104395B2 (ja) | 2012-10-19 | 2017-03-29 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | カルボキサミドまたはチオカルボキサミド誘導体を用いる殺菌剤に対して抵抗性の真菌に対する植物の処理方法 |
| CA2892551A1 (en) * | 2012-11-29 | 2014-06-05 | North Carolina State University | Synthetic pathway for biological carbon dioxide sequestration |
| WO2014170345A2 (en) | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Bayer Cropscience Ag | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| TW201507722A (zh) | 2013-04-30 | 2015-03-01 | Bayer Cropscience Ag | 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類 |
| WO2014177514A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides |
| US20160152998A1 (en) | 2013-06-24 | 2016-06-02 | North Carolina State University | Transgenic Expression Of Archaea Superoxide Reductase |
| WO2015120343A2 (en) | 2014-02-06 | 2015-08-13 | The Regents Of The University Of California | Constructs and systems and methods for engineering a co2 fixing photorespiratory by-pass pathway |
| MA41180A (fr) * | 2014-12-17 | 2017-10-24 | Bayer Cropscience Nv | Plantes caractérisées par une capacité améliorée de fixation du carbone photosynthétique |
| WO2017015321A1 (en) * | 2015-07-20 | 2017-01-26 | North Carolina State University | Synthetic pathway for biological carbon dioxide sequestration |
| CN105950641B (zh) * | 2016-06-18 | 2019-06-14 | 南京农业大学 | 一个嵌合型RbcS cTP基因及其表达载体和应用 |
| EP3802521A1 (de) | 2018-06-04 | 2021-04-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Herbizid wirksame bizyklische benzoylpyrazole |
| CN113215186B (zh) * | 2020-01-17 | 2024-06-04 | 山东舜丰生物科技有限公司 | 光呼吸支路蛋白在调控植物性状中的应用 |
| CN112309495B (zh) * | 2020-10-30 | 2022-12-09 | 山东大学 | 基于机器学习的海藻固碳蛋白预测方法及系统 |
| AR128260A1 (es) | 2022-01-25 | 2024-04-10 | Living Carbon PBC | Composiciones y métodos para mejorar la productividad de la biomasa en plantas |
Family Cites Families (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4420782C1 (de) * | 1994-06-15 | 1995-08-17 | Fluegge Ulf Ingo Prof Dr | DNA-Sequenz, kodierend einen 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter |
| US4459355A (en) | 1982-07-12 | 1984-07-10 | International Paper Company | Method for transforming plant cells |
| US4536475A (en) | 1982-10-05 | 1985-08-20 | Phytogen | Plant vector |
| NL8300698A (nl) | 1983-02-24 | 1984-09-17 | Univ Leiden | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
| US5036006A (en) | 1984-11-13 | 1991-07-30 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
| US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
| US5100792A (en) | 1984-11-13 | 1992-03-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues |
| DE3587548T2 (de) | 1984-12-28 | 1993-12-23 | Plant Genetic Systems Nv | Rekombinante DNA, die in pflanzliche Zellen eingebracht werden kann. |
| DE3687682T2 (de) | 1985-08-07 | 1993-08-19 | Monsanto Co | Glyphosat resistente pflanzen. |
| GB8613481D0 (en) | 1986-06-04 | 1986-07-09 | Diatech Ltd | Translation of mrna |
| US5187073A (en) | 1986-06-30 | 1993-02-16 | The University Of Toledo | Process for transforming gramineae and the products thereof |
| US5177010A (en) | 1986-06-30 | 1993-01-05 | University Of Toledo | Process for transforming corn and the products thereof |
| EP0267159A3 (de) | 1986-11-07 | 1990-05-02 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen |
| US5371014A (en) | 1988-02-12 | 1994-12-06 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Process for the production of optically active 2-hydroxy acid esters using microbes to reduce the 2-oxo precursor |
| US5179022A (en) | 1988-02-29 | 1993-01-12 | E. I. Du Pont De Nemours & Co. | Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues in a non-lethal manner |
| US5565346A (en) | 1988-07-27 | 1996-10-15 | Calgene, Inc. | Transformation and regeneration system for legumes |
| US5550318A (en) | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| ATE160174T1 (de) | 1989-08-09 | 1997-11-15 | Dekalb Genetics Corp | Methoden und zusammensetzungen für die herstellung von stabil transformierten, fruchtbaren mais pflanzen und zellen dafür |
| US5484956A (en) | 1990-01-22 | 1996-01-16 | Dekalb Genetics Corporation | Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin |
| CA2074355C (en) | 1990-01-22 | 2008-10-28 | Ronald C. Lundquist | Method of producing fertile transgenic corn plants |
| EP0442174A1 (en) | 1990-02-13 | 1991-08-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Stable transformation of plant cells |
| US5204253A (en) | 1990-05-29 | 1993-04-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method and apparatus for introducing biological substances into living cells |
| NZ239977A (en) | 1990-11-14 | 1993-08-26 | Pioneer Hi Bred Int | Transforming plants by the use of agrobacterium |
| US5932782A (en) | 1990-11-14 | 1999-08-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles |
| AU9054291A (en) | 1990-11-26 | 1992-06-25 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Herbicidal oxazine ethers |
| FR2673643B1 (fr) | 1991-03-05 | 1993-05-21 | Rhone Poulenc Agrochimie | Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide. |
| EP0539563B2 (en) | 1991-05-15 | 2008-01-23 | Monsanto Technology LLC | Method of creating a transformed rice plant |
| US5405765A (en) | 1991-08-23 | 1995-04-11 | University Of Florida | Method for the production of transgenic wheat plants |
| EP0604662B1 (en) | 1992-07-07 | 2008-06-18 | Japan Tobacco Inc. | Method of transforming monocotyledon |
| US5389226A (en) | 1992-12-17 | 1995-02-14 | Amorphous Technologies International, Inc. | Electrodeposition of nickel-tungsten amorphous and microcrystalline coatings |
| FR2706909B1 (pt) | 1993-06-25 | 1995-09-29 | Rhone Poulenc Agrochimie | |
| ES2220913T3 (es) | 1993-09-03 | 2004-12-16 | Japan Tobacco Inc. | Procedimiento para la transformacion de monocotiledonas utilizando el escutelo de un embrio inmaduro. |
| US6348643B1 (en) * | 1998-10-29 | 2002-02-19 | American Cyanamid Company | DNA sequences encoding the arabidopsis acetohydroxy-acid synthase small subunit and methods of use |
| EP1367127A1 (en) | 2002-05-27 | 2003-12-03 | Bayer CropScience AG | A method for production of plants with suppressed photorespiration and improved CO2 fixation |
| WO2006108830A2 (en) | 2005-04-13 | 2006-10-19 | Bayer Cropscience Sa | TRANSPLASTOMIC PLANTS EXPRESSING α 1-ANTITRYPSIN |
| US20110268865A1 (en) | 2008-08-01 | 2011-11-03 | Bayer Bio Science N.V. | Method for increasing photosynthetic carbon fixation in rice |
-
2011
- 2011-02-03 WO PCT/EP2011/051505 patent/WO2011095528A1/en active Application Filing
- 2011-02-03 CN CN201180008103.7A patent/CN102858982B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-02-03 CA CA2788238A patent/CA2788238C/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-02-03 BR BR112012019365-1A patent/BR112012019365A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-02-03 MY MYPI2012003505A patent/MY169476A/en unknown
- 2011-02-03 EP EP11702047.9A patent/EP2531602B1/en not_active Not-in-force
- 2011-02-03 RU RU2012137500A patent/RU2651501C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-02-03 US US13/577,064 patent/US9371538B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-02-03 AR ARP110100369A patent/AR080128A1/es unknown
- 2011-02-04 UY UY0001033216A patent/UY33216A/es not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102858982A (zh) | 2013-01-02 |
| US20120317683A1 (en) | 2012-12-13 |
| UY33216A (es) | 2011-08-31 |
| CA2788238A1 (en) | 2011-08-11 |
| AR080128A1 (es) | 2012-03-14 |
| CN102858982B (zh) | 2015-05-20 |
| MY169476A (en) | 2019-04-12 |
| CA2788238C (en) | 2019-09-03 |
| RU2012137500A (ru) | 2014-03-10 |
| RU2651501C2 (ru) | 2018-04-19 |
| US9371538B2 (en) | 2016-06-21 |
| EP2531602A1 (en) | 2012-12-12 |
| WO2011095528A1 (en) | 2011-08-11 |
| EP2531602B1 (en) | 2017-05-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9371538B2 (en) | Method for increasing photosynthetic carbon fixation using glycolate dehydrogenase multi-subunit fusion protein | |
| Qiu et al. | The newly identified heat-stress sensitive albino 1 gene affects chloroplast development in rice | |
| Martin-Avila et al. | Modifying plant photosynthesis and growth via simultaneous chloroplast transformation of Rubisco large and small subunits | |
| Sagor et al. | A novel strategy to produce sweeter tomato fruits with high sugar contents by fruit‐specific expression of a single bZIP transcription factor gene | |
| Su et al. | Arabidopsis stromal 70-kD heat shock proteins are essential for plant development and important for thermotolerance of germinating seeds | |
| US20110268865A1 (en) | Method for increasing photosynthetic carbon fixation in rice | |
| BRPI0620315A2 (pt) | seqüencia promotora obtida do arroz e métodos de uso | |
| US10913939B2 (en) | Compositions and methods for expression of nitrogenase in plant cells | |
| JPH09503389A (ja) | 窒素同化の増加を示すトランスジェニック植物 | |
| MX2010013622A (es) | Plantas que tienen rasgos mejorados relacionados con el rendimiento y un metodo para obtenerlas. | |
| JP6163514B2 (ja) | 増強された成長特性を有するトランスジェニック植物 | |
| US20230250443A1 (en) | Transgenic maize plant exhibiting increased yield and drought tolerance | |
| US20150203864A1 (en) | Myb55 promoter and use thereof | |
| ES2560806T3 (es) | Expresión de reguladores de la transcripción que proporcionan tolerancia al calor | |
| TWI534265B (zh) | 用於操縱植物之光合細胞中果聚糖生合成之方法、基因建構體及基因轉殖植物細胞 | |
| WO2009077973A1 (en) | Expression cassettes and methods for increasing plant yield | |
| US20210269818A1 (en) | Thermostable rubisco activase and uses thereof | |
| AU2013228321B2 (en) | Environmental stress-resistant plant with high seed productivity and method for constructing same | |
| JP2001252076A (ja) | 植物孔辺細胞の特異的遺伝子発現プロモーター | |
| JP4059897B2 (ja) | イネニコチアナミンシンターゼ遺伝子プロモーター、およびその利用 | |
| CN112898392B (zh) | 水稻phi1基因在调控植物光合作用中的应用 | |
| KR101509032B1 (ko) | 시아노박테리아 유래 유전자를 이용한 광호흡 억제 및 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체 | |
| Sharwood et al. | Chapter 19 Engineering the Sunflower Rubisco Subunits into Tobacco Chloroplasts: New Considerations | |
| JP4439844B2 (ja) | 植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメント | |
| JP5648822B2 (ja) | 相同組換えを利用したイネアントラニル酸合成酵素の改変 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B11B | Dismissal acc. art. 36, par 1 of ipl - no reply within 90 days to fullfil the necessary requirements | ||
| B350 | Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette] |