CN105316297B - 一种黑莓cad类基因及其对皮刺的改良应用 - Google Patents

一种黑莓cad类基因及其对皮刺的改良应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种黑莓CAD类基因及其对皮刺的改良应用。本发明黑莓CAD类基因RuCAD，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，该基因的开放阅读框具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列。本发明首次从悬钩子植物黑莓基因组中克隆得到一种黑莓CAD类编码基因RuCAD，并验证了该基因的功能。将本发明的RuCAD利用植物表达载体导入黑莓多皮刺品种叶片外植体细胞可获得转化植株。过量表达本发明RuCAD的黑莓转化株与野生型相比，虽然在株型和生长势上没有受到影响，但茎刺总数和主茎刺密度数值均明显低于对照，说明RuCAD基因对减少黑莓主茎皮刺数目有着重要影响。

Description

一种黑莓CAD类基因及其对皮刺的改良应用
技术领域
本发明涉及一种黑莓CAD类基因及其对皮刺的改良应用，属于植物基因工程领域。
背景技术
黑莓（Blackberry）为蔷薇科悬钩子属（RubusL.）植物，原产于欧洲和北美洲，是近年来国内兴起的第三代果树小浆果果树的重要成员之一，因其果实独特的风味和丰富的营养价值受到国内外市场的青睐。黑莓是典型的灌木类型树种，它具有生态适应性较强、易栽培、成林快、对条件要求较低、投入少而产出较早等特征，在种植的第二年即可开花结果，是低山丘陵地区调整种植业结构高收益的经济果类品种之一。作为悬钩子类果树，黑莓的大多数品种有皮刺，遍布于枝条、叶柄及叶脉上，使得收获和栽培管理十分不便。在果树栽培上无疑希望植株各个器官光滑无刺，目前国内外尚无在分子水平上对林木皮刺发生机理进行系统研究的报道。
国内黑莓育种工作近几年才逐渐得到重视，进展较为缓慢，原因主要在于黑莓具有复杂的遗传背景，且存在杂交结实率及杂交种子出苗率均较低的问题。因而常规杂交育种方法对已有黑莓品种进行种质改良有很大的局限性。随着生物技术的不断发展，植物基因工程作为现代植物改良育种的有效手段，其中许多新的方法被运用于果树育种中。若能通过黑莓叶片外植体直接再生途径实现内源基因在不同基因型中的遗传转化，将会为黑莓育种提供便捷的转基因途径及其技术保障。木质素是植物体内一种重要的次生代谢物质，主要广泛存在于维管植物的机械组织、输导组织和保护组织的细胞次生壁中，增强植物体的机械强度，是植物细胞壁的骨架物质。植物体合成木质素单体及其聚合物是一系列酶催化完成的生物化学反应，其中肉桂醇脱氢酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD，EC1.1.1.195）作为限速酶控制木质素合成的特异途径的最后一步反应，依赖辅酶NADPH 将3 种肉桂醛（松柏醛、香豆醛、芥子醛）还原生成相应的 3 种肉桂醇（松柏醇、香豆醇、芥子醇），且研究已证明其活性与木质素含量和木质素单体的比例有关，可以通过降低或提高CAD活性减少或增加木质素的合成。诸多研究表明 CAD 基因在木质素合成中发挥着极其重要的调控作用，在不影响植物生长发育的前提下，利用CAD改变木质素的成分或者降低木质素的含量已成为当前研究的热点。本发明将克隆的一个黑莓RuCAD基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导方法转入多刺基因型品种中，通过分子和表型鉴定，获得了少刺黑莓种质。
发明内容
1、本发明目的在于提供一种黑莓CAD类基因及其对皮刺的改良应用方法。
2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案包括了以下5个步骤：
（1）黑莓内源基因CAD的cDNA全长克隆及正义转化载体构建；
（2）含有内源基因的农杆菌菌液制备；
（3）农杆菌侵染黑莓离体叶片及叶片再生；
（4）黑莓阳性再生植株中内源基因转化子的鉴定。
（5）黑莓遗传转化株皮刺的表型鉴定。
其中步骤（1）的具体方法如下：
1）参照Boysenberry转录组测序结果SEQ ID NO.1设计RuCAD cDNA全长特异性引物CAD-F：5‘- GTAggatccAAAATGGTGGCATCTGCAGAGC -3’，；CAD-R：5‘- CGggatccGGAGCTGGCCT TCAATGTGTTT -3’。利用PCR法获得扩增产物，扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，回收扩增产物，并连接到pUM-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，置于LB固体平板（含100mg/L Amp）上筛选重组子。阳性重组子经质粒提取和PCR鉴定后测序。
2）将含有目的基因RuCAD的载体和pBI121载体分别用BamH I酶切4 h，将酶切后的载体片段和目的基因片段分别胶回收，之后利用T4连接酶连接，连接后载体转化感受态大肠杆菌DH5α，提取阳性重组子质粒，设计和合成35S启动子和gfp正反向引物，经目的基因扩增及与35S启动子和gfp 引物结合扩增，均能扩出预期条带者为基因正向插入载体pBI-35S-gfp:CAD构建成功。
3）利用冻融法将上述正义过表达载体pBI-35S-gfp:CAD转入根癌农杆菌EHA105，经含有Kan和Rif的YEB培养基筛选后，将转化成功的菌经YEB液体培养基培养后提取质粒，经PCR扩增验证目的基因载体转入农杆菌。
步骤（2）的具体方法如下：
1）感染前3~4d，取保存的携带有过表达载体pBI-35S-gfp:CAD的EHA105农杆菌菌株，在含有Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L固体YEB平板培养基上划线培养活化，28℃恒温培养36~48 h。
2）挑取活化板上单菌落，接种于1 mL含Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L的液体YEB培养基中，置于28℃恒温摇床，180~200 rpm，培养24~36 h。至农杆菌生长至对数平台期，吸取50 μL农杆菌培养液转入50 mL新鲜的YEB液体培养基（含有Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L）中，置于28℃恒温摇床，180~200 rpm，培养12~24 h，监测OD600值。
3）取OD600值达到0.5~1.0的农杆菌菌液，转移至50 mL无菌离心管中，4000~5000rpm室温离心5 min，弃上清液，收集菌体。用灭菌MS0液体培养基（含100 μmol/L AS）重悬，稀释至OD600值0.3~0.5，作为侵染液备用。
步骤（3）的具体方法如下：
1）取继代培养30~40 d的黑莓试管苗中上部展开叶片，剪去叶尖和叶缘并保留2~3mm的叶柄作为外植体，正面向上接种于预培养培养基上进行预培养。预培养培养基中附加25 g/L的蔗糖和5.6 g/L琼脂，高压灭菌前调pH至5.8~6.0。
2）取步骤（2）中制备的菌液，将预培养的叶片置入其中浸泡7~10 min，吸去多余附着菌液后接种于共培养培养基上培养3 d。
3）将共培养后的叶片用无菌水冲洗后转移至抑菌培养基上暗培养10 d。
4）抑菌培养结束后将叶片用无菌水冲洗和滤纸吸干后转移至选择培养基上进行抗性筛选，2~3周后无抗生素抗性的不定芽生长点白化和死亡，培养40 d后仍存活的为抗性不定芽。
5）将选择培养基上的抗性不定芽切下，转移至增殖培养基上继续培养，每隔20 d更换1次培养基，芽生长至2~3cm时置于生根培养基上诱导生根，最终形成抗性植株用于阳性鉴定。
步骤（4）的具体方法如下：
1）对于阳性植株，用RuCAD目的基因引物、以及35S启动子正向引物和RuCAD目的基因反向引物组合、gfp基因引物不同类型扩增相结合进行PCR扩增，验证所转化的内源基因的整合情况。
2）在初步鉴定目的基因转化成功的基础上，根据基因序列设计特异性引物，采用SYBR GREEN 染料法，以植物保守的Tub 为内参基因，使用荧光定量PCR 仪（Roche 公司）做相对定量检测，分析基因表达情况，表达量与对照有差异者初步判定转化成功。
步骤（5）的具体方法如下：
1）转化植株的表型性状鉴定：经PCR和荧光定量PCR鉴定阳性的植株生根后3周移栽到穴盘中，精细管理。生长1个月后植株生长至10 cm高度时对转化幼苗及其对照进行了表型性状调查，调查叶片数、株高、主茎粗度、主茎高度等，对主茎刺数、倒1叶至倒5叶叶柄刺数和叶柄长进行调查，计算主茎刺密度、倒1叶至倒5叶叶柄刺密度。每个转化株将所有不定芽得到苗进行平均，对照品种调查5株取其平均。
2）转化植株CAD酶活性测定：CAD酶液提取和活性测定参照Goffner等（Planta，1992，188(1)：48-53）在桉树上的方法进行。移苗3个月后转化植株长至约30 cm高度时，分别取各转化株和对照株顶端新生叶片以及2 cm茎尖0.2 g左右样品，在冰上用0.1 M Tris-HCl缓冲液（pH8.8）（含1%PVP和15 mM巯基乙醇）充分研磨匀浆后，14000×g离心20 min，样品定容至5mL后取100 μL用Bradford法测定蛋白浓度。取各样品上清液200 μL，在3 mL总反应体积中加入0.1 M Tris-HCl（pH8.8）反应液，松柏醛或芥子醛100 μM，NADPH 100 μM，反应5 min后以反应时间0作参比测定A340。酶活性以1min变化0.001吸光值为1个酶活性单位，结果以Ug-1FW表示，测定3次重复。
3、35S启动子和绿色荧光蛋白（gfp）基因被用于辅助鉴定，它们的特异性正向和反向引物分别为，35S-F：5‘- GCTCCTACAAATGCCATCA -3’； 35S-R：5‘-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’。gfp-F：5‘-GTAAACGGCCACAAGTTCAG-3’；gfp-R：5‘-TACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’。
4、抗生素卡那霉素（Kan）的使用浓度为10 mg/L。
5、预培养培养基组成为：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L；共培养培养基组成为：MS+6-BA1.0 mg/L+IAA0.5 mg/L+AS 100 μmol/L；抑菌培养培养基组成为：MS+6-BA1.0 mg/L+IAA0.5 mg/L+AS 100 μmol/L+ Cef 500 mg/L；选择培养培养基组成为：MS+6-BA1.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L +Kan 10 mg/L+ Cef 500 mg/L；继代培养培养基组成为：MS+6-BA0.5 mg/L+IAA 0.1 mg/L+ Kan 10 mg/L；生根培养基组成为：1/2MS +NAA 0.03 mg/L+ Kan 10 mg/L。
附图说明
1、图1：黑莓叶片直接再生途径遗传转化流程；
A：无菌苗培育 B：健壮的叶片外植体取样 C：叶片预培养 D：叶片和农杆菌共培养
E：抑菌培养 F：抗性芽筛选。
2、图2：利用目的基因（A）、gfp报告基因（B）、35S-F与CAD-R（C）不同引物组合鉴定Kiowa基因型品种RuCAD转化植株。
3、图3：Kiowa品种RuCAD转化植株的荧光定量PCR检测。
4、图4：Kiowa 品种遗传转化株以松柏醛和芥子醛为底物CAD酶活性。
A：松柏醛底物下转化株和对照株叶片和茎尖中的CAD活性比较；B：芥子醛底物下转化株和对照株茎尖中的CAD活性比较。
具体实施方式
实施例1. 黑莓RuCAD内源基因的cDNA克隆及正义转化载体构建
利用RNA提取试剂盒（RP3301）提取Boysenberry品种叶片总RNA，利用2 μg RNA和Oligo18(T)引物进行cDNA第一链合成，步骤参照反转录试剂盒（PR6601）说明进行。参照Boysenberry转录组测序结果设计RuCAD cDNA特异性引物CAD-F：5‘-GTAggatccAAAATGGTGGCATCTGCAGAGC -3’，；CAD-R：5‘- CGggatccGGAGCT GGCCTTCAATGTGTTT -3’。PCR扩增采用20 µL反应体系，包括2 µL 10×buffer, 0.2 µL 10 mmol/L dNTPs, 2 µL 10 pmol/µL引物，0.2 µL 5 U/µL Taq酶，1 µL cDNA模板，ddH2O 14.6 µL。PCR反应程序为，94oC预变性5 min，94oC变性30 s，60oC退火30 s，72oC延伸60 s，35个循环后72oC延伸10 min。扩增产物均用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离。利用胶回收试剂盒（DP1601）进行PCR产物回收，将回收产物连接到pUM-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，置于LB固体平板（含100 mg/L Amp）上筛选重组子。阳性克隆经质粒提取（DP1001）和PCR鉴定后送交测序。
利用特异性引物扩增后，经凝胶电泳，与Marker相比，在1,000 bp左右有唯一条带。测序结果显示，得到的克隆载体中含有RuCAD cDNA全长，大小1,086 bp，可用于后续载体构建。
将含有目的基因RuCAD的载体和pBI121载体分别用BamH I进行单酶切，将酶切后的载体片段14,758 bp和目的基因片段1,086 bp分别胶回收后用T4连接酶连接。连接后载体转化感受态大肠杆菌DH5α，提取阳性重组子质粒，经RuCAD目的基因引物扩增、35S-F和CAD-R引物相结合扩增、CAD-F和gfp-R引物相结合扩增，均能扩出预期条带者（分别为1,281bp和1,736 bp）为基因正向插入载体pBI-RuCAD构建成功，未扩出者示为基因反向插入。将转化后的农杆菌提取质粒，利用RuCAD正反向引物进行扩增，结果出现目的条带1,086 bp，从而验证正义转化载体pBI-RuCAD已成功转入农杆菌，可用于后续遗传转化。
实施例2. 含有内源基因的农杆菌菌液制备
感染前3~4d，取保存的携带有过表达载体pBI-35S-gfp:CAD的EHA105农杆菌菌株，在含有Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L固体YEB平板培养基上划线培养活化，28℃恒温培养箱培养36~48 h。挑取活化板上单菌落，接种于1 mL含Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L的液体YEB培养基中，置于28℃恒温摇床，180~200 rpm，培养24~36 h。至农杆菌生长至对数平台期，吸取50 μL农杆菌培养液转入50 mL新鲜的YEB液体培养基（含有Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L）中，置于28℃恒温摇床，180~200 rpm，培养12~24 h，监测OD600值。
取上述OD600值达到0.5~1.0的农杆菌菌液，转移至50 mL无菌离心管中，4000~5000rpm室温离心5 min，弃上清液，收集菌体。用灭菌MS0液体培养基（含100μmol/L AS）重悬，稀释至OD600值为0.3~0.5，作为侵染液备用。
实施例3. 农杆菌菌株的黑莓离体叶片直接再生法转化
1）无菌苗叶片的获得
建立黑莓品种‘Kiowa’品种大田植株当年生新梢上带腋芽的茎段的无性繁殖系（如图1A），在培养基MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L上继代培养40 d至2~3 cm高时取上部2~3片叶片备用（如图1B），剪取茁壮叶片的边缘，留0.5 mm叶柄。
2）抗生素卡那霉素（Kan）临界浓度的筛选
将黑莓‘Kiowa’叶片接在含有不同浓度Kan的再生培养基上，观察不定芽再生情况，选出能抑制不定芽再生的最低Kan浓度，共设置浓度处理：0、1、3、5、7、10、15（mg/L），每个浓度设3次重复，每次重复设30个外植体。可以看出（表1），黑莓离体叶片对Kan比较敏感，随着Kan浓度的增大，叶片不定芽的再生率显著降低。当Kan浓度大于等于 10 mg /L时能完全抑制叶片不定芽的再生。Kan 10 mg/L可以作为黑莓抗性芽筛选的临界浓度。
表1 不同浓度卡那霉素对叶片再生不定芽的影响
Kan浓度(mg/L) 不定芽再生率(%)
0 52.22 aA
1.0 46.69 abA
3.0 41.67 bA
5.0 28.89 cB
7.0 9.72 dC
10.0 0.00 eC
15.0 0.00 eC
3）黑莓叶片的预培养
取继代培养30~40 d的黑莓试管苗中上部叶片，剪去叶尖和叶缘（如图1C），保留2~3 mm叶柄，作为外植体，正面向上接种于预培养培养基MS+6-BA1.0 mg/L+IAA0.5 mg/L上进行预培养。预培养培养基中附加25 g/L蔗糖和5.6 g/L 琼脂，高压灭菌前调pH至5.8~6.0。
4）农杆菌浸染
取出经过2 d预培养的叶片，用已制备好的MS0侵染液浸泡7~10 min，中间轻轻摇动2~3次使叶片与农杆菌充分接触。
5）共培养
用无菌滤纸吸去叶片边缘多余的附着菌液，晾干后将其接种于不含有抗生素的共培养培养基MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L+AS 100μmol/L上，暗培养3 d（如图1D）。
6）抑菌培养
共培养3d后将叶片用含Cef的无菌水和普通无菌水各冲洗3次后用无菌滤纸吸干，之后转移至MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L抑菌培养基（含AS 100 μmol/L和Cef 500mg/L）上暗培养1~2周（如图1E）。
7）选择培养
抑菌培养结束后将叶片用含Cef的无菌水和普通无菌水各冲洗3次后用无菌滤纸吸干，之后转移至MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L培养基（含Cef 500 mg/L和Kan 10 mg/L）上进行选择培养，约2周后出现绿色可见芽点。经2~3周抗性筛选，无抗生素抗性的不定芽生长点白化和死亡（如图1F）。培养40 d后统计各品种芽数和抗性芽百分数。经不定芽诱导后， Kiowa品种转化RuCAD基因直接再生不定芽比例可达69.01%，PCR阳性芽比例4.23%。
8）抗性芽继代和生根培养
将选择培养基上抗性不定芽切下，转移至继代培养基MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.1mg/L+ Kan 10 mg/L培养基上继续培养，每隔20 d更换1次培养基。芽生长至2~3cm时，置于含10 mg/L Kan生根培养基1/2MS +NAA 0.03 mg/L+ Kan 10 mg/L上诱导生根，生根后移栽到基质中，精细管理后成活率达100%，最终形成转化苗，用于分子鉴定。
实施例3. 农杆菌菌株介导的RuCAD内源转化子的鉴定
对Kiowa得到的Kan抗性植株利用CTAB法提取叶片DNA，利用RuCAD目的基因引物（1,086 bp）、以及35S启动子正向引物和RuCAD目的基因引物（1,281 bp）组合、gfp基因引物（650 bp）结合进行PCR扩增验证。图2为RuCAD基因转化Kiowa的PCR扩增结果，5-1、5-2和5-5利用目的基因（图2-A）和gfp报告基因（图2-B）引物均扩出预期条带，而将35S正向引物和目的基因引物相组合仅5-1、5-2能扩出目的条带（图2-C）。
对初步鉴定目的基因转化成功的植株，利用实时定量PCR检测目的基因表达量，表达量与对照有差异者最终判定转化成功。用随机引物将野生型和转基因植株叶片的RNA反转录成cDNA，去除基因组DNA后配制反转录反应：5×qRT SuperMixII 2 μL，RNA溶液8 μL，反应条件：25℃ 10 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。根据基因序列设计特异性引物，采用SYBR GREEN 染料法，以植物保守的Tub 为内参基因，使用荧光定量PCR 仪（Roche 公司）做相对定量检测，分析基因表达情况。根据目的基因的序列设计荧光定量PCR基因引物如下：GCAD-F：5‘-GGACCGCCTTGTTAAAGCAG-3’，GCAD-R：5‘-CAATCTCATCCCACCACCGA-3’，理论大小为116 bp。内参Tubulin基因引物如下：Tub-F ：5‘CTCGAGCGCGTCAATGTCTA-3’， Tub-R：5‘-AGTGTAGTGACCTTTCGCCC-3’，理论大小为192 bp。PCR反应体系配制为：2×qPCR Master Mix10 μL，正向引物（10 μM） 0.4 μL，反向引物（10 μM）0.4 μL，模板（cDNA）2 μL，补ddH2O 至总体积25 μL。荧光定量PCR 扩增条件的设置：扩增曲线：94℃ 30s；94℃ 5s，53℃ 30s，循环45 次，53℃单点检测信号。溶解曲线：95℃ 0s，60℃ 15s，95℃ 0s，连续检测信号。PCR反应结束后分析荧光值变化曲线以及溶解曲线，通过比较2-△△Ct的方法进行基因表达水平的相对定量分析 (Livak and Schmittgen, 2001)。将5-1、5-2利用荧光定量PCR鉴定目的基因表达情况（图3）。发现相对于野生型WT，5-1相比之下表达量显著下降，5-2表达量显著上升，证明获得了目的基因表达的转化植株。
实施例4. 转化株皮刺的表型鉴定
转基因苗生根移栽1个月后，对各PCR阳性株和荧光定量PCR阳性株初步进行了基础表型性状观察和刺密度调查，见表2和表3。
表2 RuCAD 转化株与对照表型性状比较
叶片数目 株高/cm 茎粗/mm 茎高/cm 茎刺总数 主茎刺密度/个/cm
KWT 7.3 8.2 1.83 4.63 7.3 1.59
5-1 5.5 6.4 1.47 1.80 0.5 0.25
5-2 5.0 6.1 1.82 4.00 4 0.99
5-5 4.0 3.6 0.85 0.60 0 0
从表2数据中可以大致看出，RuCAD基因转化黑莓Kiowa品种后，与对照KWT相比，3株阳性植株在生长势上均弱于对照，除5-2在基部茎粗和茎高与对照相当之外，其他生长性状以及5-1和5-5所有生长性状均低于对照品种，但3株转化株的茎刺总数和主茎刺密度数值均低于对照，判定转化的RuCAD基因在一定程度上直接或间接影响了Kiowa主茎皮刺数目的形成。由于植株苗较小，尚未产生分支，因而调查了转化小苗从上至下倒1叶至倒5叶不同叶位叶柄的刺密度。从表3中数据看出，Kiowa对照和转化株不同叶位皮刺变化均无明显规律，但5-1转化株不同叶位皮刺与对照相比明显减少的趋势。
表3 RuCAD转化株与对照倒1叶至倒5叶叶柄刺密度（个/cm）比较
倒1叶 倒2叶 倒3叶 倒4叶 倒5叶
KWT 4.32 2.57 3.75 2.78 5.77
5-1 3.30 2.06 2.47 3.36 2.91
5-2 3.44 3.01 3.11 3.21 5.86
5-5 3.10 2.76 6.74 1.32 -
移栽3个月后，待植株生长至约30cm时，取Kiowa品种转化株5-1与其对照植株的叶片及茎尖，检测CAD酶活性。由图4-A可以看出，和对照株（Kwt）相比，转化株5-1叶片中的CAD酶活性略有下降，而茎尖中的CAD酶活性有一定的上升，推测RuCAD基因在茎尖中过表达，当芥子醛为底物检测时（图4-B），对照和转化株叶片中的CAD酶活性均较低以致检测不到，而茎尖中均检测到CAD酶活性，且以转化株5-1中CAD酶活性明显高于对照株。由此说明，RuCAD基因在转化株5-1茎尖中实现过量表达，明显减少了主茎和叶柄中皮刺的数目和密度，在黑莓皮刺改良应用中具有重要应用价值。
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种黑莓CAD类基因及其对皮刺的改良应用
<130> 2010
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1356
<212> DNA
<213> Rubus L.
<400> 1
cacgacgctc ttccgatctt agttctctca tactaacaat ctcagtacct cgttactcta 60
ctaaaatggt ggcatctgca gagcaagaac accccaataa ggccattgga tgggctgcca 120
gagacacatc tggtgttctc tcccctttca atttctcaag aagggaaact ggtgagaaag 180
atgtggcctt taaagtgttg tactgtggta tatgtcattc tgacctccac atggtcaaga 240
atgaatgggg ttcttctacc taccctctgg ttcctgggca cgagattgtt ggtgtagtga 300
ctgaggtagg gagcaaagtt cagaacatca aggttggaga caaggtaggt gttggatgca 360
tggtgggatc ttgccgatct tgtgatagtt gtgcagacca ccttgagaac tactgcccca 420
aaatgatact cacctattct gccaagtatt atgatggaac caccacatat ggaggttact 480
ctgacatcat ggtggccgac gagaatttca ttgtccgtat tccagagaac ctacctcttg 540
atggtgctgc tccactccta tgtgccggaa ttacaacgta cagccccttg aggcattttg 600
gacttgacaa acccggtatg catgtgggcg ttgttggcct aggtggttta ggccacgtgg 660
ccgtgaagtt tgccaaggct ctgggggtta aggttacagt gataagtacc tcccctaaga 720
agaaggcgga agctgtcgaa cgtctccatg ctgattcatt tttggtcagc actgaccaaa 780
atgagatgca ggccgccatg ggcacaatgg atgggatcat tgacacagtt tctgcagtcc 840
accctcttgt gcctttgatt ggtttgttga agactcaggg aaaacttgtg atggttggtg 900
caccagagaa gcctcttgag cttccagttt ttcctttgat catgggaagg aagataatag 960
gtggtagttg tatcggaggg atgaaggaga cgcaggagat gattaatttt gcagccaagc 1020
acaacataac agctgatatt gagattatcc caattgatta tgtgaacacc gccatggacc 1080
gccttgttaa agcagacgta agataccggt ttgtcattga cattggaaac acattgaagg 1140
ccagctccta aacttttcat tgcaagctga ttcggtggtg ggatgagatt gtctcaatac 1200
tgttgcctac cagtagtgtg ttgttaaatt atgcatatgt gcatgatgca aaaggctggc 1260
cctggatttt gaataaaaga aacaatctgt tttttcaatg aaatatttat gtctgagaat 1320
gaattcttgg tttgcacata gaccgagtcc caagaa 1356
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种黑莓CAD类基因及其对皮刺的改良应用
<130> 2010
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<170> PatentIn version 3.3
<210> 2
<211> 361
<212> PRT
<213> Rubus L.
<400> 2
Met Val Ala Ser Ala Glu Gln Glu His Pro Asn Lys Ala Ile Gly Trp
1 5 10 15
Ala Ala Arg Asp Thr Ser Gly Val Leu Ser Pro Phe Asn Phe Ser Arg
20 25 30
Arg Glu Thr Gly Glu Lys Asp Val Ala Phe Lys Val Leu Tyr Cys Gly
35 40 45
Ile Cys His Ser Asp Leu His Met Val Lys Asn Glu Trp Gly Ser Ser
50 55 60
Thr Tyr Pro Leu Val Pro Gly His Glu Ile Val Gly Val Val Thr Glu
65 70 75 80
Val Gly Ser Lys Val Gln Asn Ile Lys Val Gly Asp Lys Val Gly Val
85 90 95
Gly Cys Met Val Gly Ser Cys Arg Ser Cys Asp Ser Cys Ala Asp His
100 105 110
Leu Glu Asn Tyr Cys Pro Lys Met Ile Leu Thr Tyr Ser Ala Lys Tyr
115 120 125
Tyr Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Gly Gly Tyr Ser Asp Ile Met Val Ala
130 135 140
Asp Glu Asn Phe Ile Val Arg Ile Pro Glu Asn Leu Pro Leu Asp Gly
145 150 155 160
Ala Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Thr Tyr Ser Pro Leu Arg
165 170 175
His Phe Gly Leu Asp Lys Pro Gly Met His Val Gly Val Val Gly Leu
180 185 190
Gly Gly Leu Gly His Val Ala Val Lys Phe Ala Lys Ala Leu Gly Val
195 200 205
Lys Val Thr Val Ile Ser Thr Ser Pro Lys Lys Lys Ala Glu Ala Val
210 215 220
Glu Arg Leu His Ala Asp Ser Phe Leu Val Ser Thr Asp Gln Asn Glu
225 230 235 240
Met Gln Ala Ala Met Gly Thr Met Asp Gly Ile Ile Asp Thr Val Ser
245 250 255
Ala Val His Pro Leu Val Pro Leu Ile Gly Leu Leu Lys Thr Gln Gly
260 265 270
Lys Leu Val Met Val Gly Ala Pro Glu Lys Pro Leu Glu Leu Pro Val
275 280 285
Phe Pro Leu Ile Met Gly Arg Lys Ile Ile Gly Gly Ser Cys Ile Gly
290 295 300
Gly Met Lys Glu Thr Gln Glu Met Ile Asn Phe Ala Ala Lys His Asn
305 310 315 320
Ile Thr Ala Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Asp Tyr Val Asn Thr Ala
325 330 335
Met Asp Arg Leu Val Lys Ala Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Ile Asp
340 345 350
Ile Gly Asn Thr Leu Lys Ala Ser Ser
355 360

Claims (2)

1.黑莓CAD类酶RuCAD在培育少刺黑莓种质中应用；所述黑莓CAD类酶RuCAD的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
2.黑莓CAD类酶编码基因RuCAD在培育少刺黑莓种质中应用；所述基因的DNA序列为SEQID NO.1。
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