CN104004071A - 植物耐盐相关蛋白IbERD3及其编码基因与应用 - Google Patents

植物耐盐相关蛋白IbERD3及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物耐盐相关蛋白IbERD3及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，来自甘薯(Ipomoea batatas)，命名为IbERD3蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的由序列1衍生的蛋白质。将IbERD3基因导入甘薯，得到转IbERD3基因甘薯，其与野生型甘薯相比，耐盐性显著增高。本发明所提供的IbERD3蛋白及其编码基因在提高植物耐盐性中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

植物耐盐相关蛋白IbERD3及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种植物耐盐相关蛋白IbERD3及其编码基因与应用。
背景技术
世界上存在大面积的盐渍化的土地。据统计，全世界共有3.8×108hm2盐碱地，在灌溉地区还有占耕地面积33％的次生盐渍化土地，土壤的盐渍化严重影响现代农业的发展。就我国而言，在全国18亿亩耕地中有近十分之一的次生盐渍化土地，另外还有2×107hm2盐碱荒地。一般来说，盐浓度在0.2％～0.5％会影响作物的生长，但是盐碱地的盐分大都在0.6％～10％。大面积的盐渍化土地的存在严重影响了粮食生产，成为限制农业生产的主要因素。随着世界人口的剧增及可耕地面积的逐年下降，粮食生产安全受到了严重威胁，对于人均耕地面积相对较小的中国更是日益严重的问题。通过对植物耐盐机理的深入研究，培育耐盐作物新品种是利用盐碱地资源最经济、有效的措施之一。
植物的耐盐机理相当复杂，它涉及到生长发育、形态结构、生理特征以及代谢调节等诸多方面。植物在盐胁迫条件下，会采用一定的策略去阻止或减轻盐的危害，在长期的进化过程中，植物发展出了一系列的耐盐机制。随着分子生物学的迅速发展，植物耐盐生理生化机制日益明确，使得克隆与植物耐盐相关基因成为可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐盐相关蛋白IbERD3及其编码基因与应用。
本发明提供的蛋白质，来自甘薯(Ipomoea batatas)，命名为IbERD3蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述IbERD3蛋白的基因(命名为IbERD3基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因具体可为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：
(1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物耐盐性相关蛋白的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物耐盐性相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。上述严格条件也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。
含有所述IbERD3基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。
所述重组表达载体具体可为将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pCAMBIA3301载体的Bgl II和Pml I酶切位点之间(序列表的序列2所示的双链DNA分子替换掉了pCAMBIA3301载体上的gusA报告基因)得到的重组质粒pCBIbERD3。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述IbERD3基因导入目的植物中，得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物。所述IbERD3基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述IbERD3基因具体可通过所述重组质粒pCBIbERD3导入所述目的植物中。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为甘薯，如商薯19。所述耐盐性高可提现为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)中的至少一种：(Ⅰ)在盐胁迫的环境下，生长状况优；(Ⅱ)在盐胁迫的环境下，脯氨酸含量高；(Ⅲ)在盐胁迫的环境下，丙二醛含量低；(Ⅳ)在盐胁迫的环境下，SOD活性高。所述生长状况优提现为株高高和/或根长长。
本发明还保护所述IbERD3蛋白、所述IbERD3基因或所述重组载体在培育耐盐植物中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为甘薯，如商薯19。
本发明提供了IbERD3蛋白及其编码基因，将IbERD3基因导入甘薯，得到转IbERD3基因甘薯，其与野生型甘薯相比，转IbERD3基因甘薯的耐盐性显著增高，具体体现在为：在盐胁迫环境下，株高高、根长长、脯氨酸含量高、丙二醇含量低、SOD活性高。本发明所提供的IbERD3蛋白及其编码基因在提高植物耐盐性中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1为实施例2中的PCR鉴定图。
图2为实施例2中的表型鉴定图。
图3为实施例2中的脯氨酸标准曲线以及标准曲线方程。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pCAMBIA3301载体：北京天恩泽生物技术有限公司，产品目录号为60908。农杆菌菌株EHA105：北京拜尔迪生物技术有限公司。商薯19(甘薯的一个具体品种)：河南省商丘市农林科学研究所。
实施例1、IbERD3蛋白及其编码基因的获得
甘薯耐盐突变体LM79(简称LM79)：提及该生物材料的文献：何绍贞.甘薯耐盐突变体的离体筛选及耐盐候选基因的克隆.中国农业大学博士学位论文，2008。
1、叶片总RNA提取和纯化
取LM79无菌苗展开叶叶片约2g，在液氮中研磨成粉状，加入10mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒(Applygen Technologies Inc，Beijing)提取总RNA。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit(QIAGEN，GmbH，Germany)从总RNA中纯化mRNA。取1μL mRNA进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，以检测其完整性，另取2μL mRNA稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD260)和纯度(OD260/OD280)。检测结果表明，提取自LM79无菌苗叶片的总RNA，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解。mRNA符合实验要求，可用于cDNA的克隆。
2、cDNA的克隆
以本实验室获得的IbERD3EST片段设计引物进行IbERD3蛋白cDNA的全长克隆。
(1)3′-RACE
以LM79的叶片cDNA为模板，用IbERD3EST正向引物1和正向引物2及反向引物3、反向引物4(反向引物3、反向引物4序列参照Invitrogen GeneRacer.RACE ReadycDNA Kit Manual,Version A)进行PCR反应。其中正向引物2在引物1的下游。
引物序列如下：
引物1：5′-CCGGCGGATGTTGAAATACAGAGAA-3′
引物2：5′-CGAAGGAGGAGTTGTTGAAGTGCAGA-3′
引物3：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′
引物4：5′-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3′
PCR得到的3′RACE片段，回收后连接pMD19-T载体(购自北京六合通经贸有限公司，产品目录号为D102A)进行TA克隆，以BcaBESTTM Sequencing Primers/M13Primers通用引物进行测序。
(2)5′-RACE
以LM79cDNA为模板，用IbERD3EST正向引物5和正向引物6及反向引物7、反向引物8(反向引物7、反向引物8序列参照Invitrogen5’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends,Version2.0)进行PCR反应。其中正向引物6在引物5的下游。
引物序列如下：
引物5：5′-GAGCCATGTCAAAAGCTCTCGAGGGATAAG-3′
引物6：5′-CTTCGAAGCCAAAATACCAATGGTTG-3′
引物7：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3′
引物8：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′
PCR得到的5’RACE片段，回收后连接pMD19-T载体(购自北京六合通经贸有限公司，产品目录号为D102A)进行TA克隆，以BcaBESTTM Sequencing Primers/M13Primers通用引物进行测序。
(3)PCR扩增IbERD3蛋白cDNA的编码区
利用DNAMAN7.0软件拼接候选的甘薯IbERD3蛋白cDNA序列。进一步设计正向引物9和反向引物10进行PCR扩增IbERD3蛋白cDNA的编码区。
引物序列如下：
引物9：5’-ATGGCGATTTCGG-3’；
引物10：5’-TTATGAACTGGCATTT-3’。
以LM79cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR条件为95℃1min，随后95℃20s，53℃20s和72℃2min，进行40个循环，最后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1929bp长度的扩增片段。
经过测序，该PCR产物具有序列表中序列2所示的核苷酸，编码序列表的序列1所示的蛋白质。
将序列表的序列1所示的蛋白质命名为IbERD3蛋白，由642个氨基酸残基组成。将编码IbERD3蛋白的基因命名为IbERD3基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。
实施例2、IbERD3蛋白在提高植物耐盐性中的应用
一、重组质粒pCBIbERD3的构建
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-AGATCTATGGCGATTTCGG-3’(下划线标注Bgl II酶切识别序列)；
R1：5’-CACGTGTTATGAACTGGCATTT-3’(下划线标注Pml I酶切识别序列)。
3、用限制性内切酶Bgl II和Pml I双酶切步骤2得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Bgl II和Pml I双酶切pCAMBIA3301载体，回收约9284bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pCBIbERD3。根据测序结果对重组质粒pCBIbERD3进行结构描述如下：重组质粒pCBIbERD3为将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pCAMBIA3301载体的Bgl II和Pml I酶切位点之间(序列表的序列2所示的双链DNA分子替换掉了pCAMBIA3301载体上的gusA报告基因)得到的重组质粒。
二、转IbERD3基因甘薯的获得
1、将重组质粒pCBIbERD3导入农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pCBIbERD3。
2、将重组农杆菌EHA105/pCBIbERD3接种到含有100μg/mL利福平和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，28℃、100rpm培养30h(此时农杆菌生长达到取对数生长期)，然后取菌液，用液体MS培养基稀释至30倍体积，即为侵染液。
3、商薯19胚性细胞团的制备
剥取长约0.5mm的商薯19的茎尖组织，置于胚性愈伤组织诱导固体培养基(含2.0mg/L2,4-D、质量百分含量为3.0％的蔗糖和质量百分含量为0.8％的琼脂的MS液体培养基，pH5.8)，27℃、黑暗条件下培养8周，然后将胚性愈伤组织转入胚性愈伤组织诱导液体培养基(不含琼脂，其它同胚性愈伤组织诱导固体培养基)，27℃、100rpm振荡培养(每天13h、500lx光照)，每10天继代1次。
4、取步骤3得到的直径0.7-1.3mm的商薯19的胚性细胞团，悬浮于步骤2得到的侵染液，5min后取出胚性细胞团，用含有2.0mg/L2,4-D的MS液体培养基洗涤2次，然后接种在含30mg/L乙酰丁香酮和2.0mg/L2,4-D的MS固体培养基上，28℃黑暗培养3d。
5、完成步骤4后，将胚性细胞团用含有500mg/L羧苄青霉素和2.0mg/L2,4-D的MS液体培养基洗涤2次，然后转接至含2.0mg/L2,4-D、100mg/L羧苄青霉素和20mg/L潮霉素的MS固体培养基，27±1℃黑暗培养10-12周(每2周继代1次)。
6、完成步骤5后，将胚性细胞团转移至含1.0mg/L脱落酸和100mg/L羧苄青霉素的MS固体培养基，27±1℃培养2-4周(每天13h、3000lx光照)，然后将抗性愈伤组织转移至MS固体培养基，27±1℃培养4-8周(每天13h、3000lx光照)，得到的再生植株即为T0代植株。
7、取步骤6得到的各个T0代植株，分别提取基因组DNA，并采用F2和R2组成的引物对进行PCR鉴定(F2对应载体骨架，R2对应IbERD3基因；只有转IbERD3基因植株可以得到约2058bp的PCR扩增产物，判断为PCR鉴定阳性；商薯19不产生PCR扩增产物)。
F2：5′-GAACTCGCCGTAAAGACTGG-3′；
R2：5′-GACGTTCATCACCCACACAG-3′。
结果见图1。图1中，M为Maker，W为阴性水对照，P为阳性对照(重组质粒pCBIbERD3)，WT为商薯19，L1-L3、L5-L11和L13-L18为PCR鉴定阳性的T0代植株，L4和L12为PCR鉴定阴性的T0代植株。结果表明，L4和L12以外的T0代植株均为转IbERD3基因植株，IbERD3基因已经整合到甘薯的基因组中。
随机取T0代转IbERD3基因植株L1、L3、L5、L8、L11、L14和L18，分别进行茎段扩繁(茎段扩繁为甘薯的常用无性扩繁方法，得到的植株均为T0代植株)。
三、转空载体甘薯的获得
将pCAMBIA3301载体代替重组质粒pCBIbERD3，其它同步骤二，得到转空载体植株。
四、转IbERD3基因甘薯的鉴定
将T0代转IbERD3基因植株(L1、L3、L5、L8、L11、L14和L18)、T0代转空载体植株和商薯19(用WT表示)的同期幼苗分别转移到含有86mM NaCl的MS固体培养基上培养4周(每天13h、3000lx光照)，然后拍照、测量株高和根长、检测脯氨酸含量和丙二醛含量。进行三次重复实验，每次重复实验中每个株系设置3个重复植株，结果取平均值。
1、表型结果
照片见图2。在盐胁迫的情况下，各个转IbERD3基因植株显著比商薯19生长旺盛，株高显著增高，表明其耐盐性明显增强。转空载体植株与商薯19的生长状况基本一致。
T0代转IbERD3基因植株L1的株高为4.17厘米，根长为54.60厘米；
T0代转IbERD3基因植株L3的株高为3.82厘米，根长为41.13厘米；
T0代转IbERD3基因植株L5的株高为3.47厘米，根长为48.23厘米；
T0代转IbERD3基因植株L8的株高为5.08厘米，根长为49.00厘米；
T0代转IbERD3基因植株L11的株高为3.12厘米，根长为47.88厘米；
T0代转IbERD3基因植株L14的株高为5.60厘米，根长为31.89厘米；
T0代转IbERD3基因植株L18的株高为4.17厘米，根长为33.32厘米；
商薯19的株高为2.49厘米，根长为10.75厘米。
T0代转空载体植株的株高为2.51厘米，根长为10.68厘米。
2、脯氨酸含量和丙二醛含量
植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐等胁迫时，游离的氨基酸便会大量积累，并且积累指数和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置上释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，改变这些大分子的构型，或者使之产生交联反应，从而丧失功能，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。因此，丙二醛含量减低可以作为植物抗逆性的一项生化指标。SOD活性是鉴定植物耐盐性的重要生理生化指标。
(1)脯氨酸含量
脯氨酸含量的测定方法参见文献：邹琦，植物生理学实验指导.北京：中国农业出版社，2000。
脯氨酸含量的测定方法具体如下：
①脯氨酸标准曲线制作
取7支试管按照表2加入各试剂，混匀后盖上盖子，在沸水中加热40min。取出冷却后向各管中加入5mL甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管为对照在波长520nm测OD值。以OD值为横坐标，脯氨酸含量为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线以及标准曲线方程见图3(图3中纵坐标脯氨酸浓度的单位为μg/ml)。
表27支试管加入的试剂组分
管号 0 1 2 3 4 5 6
标准脯氨酸 0.00 0.20 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00
水 2.00 1.80 1.60 1.20 0.80 0.40 0.00
冰醋酸 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
显示液 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
脯氨酸含量 0.00 2.00 4.00 8.00 12.00 16.00 20.00
②植株脯氨酸含量的测定
称取植株叶片1.0g，剪碎，加入5ml80％乙醇于研钵中研磨成匀浆。将匀浆液体全部转移至25ml刻度的试管中，加水补足25ml，混匀，80℃水浴提取20min。加入0.5g人造沸石和0.2g活性炭，于振荡器上振荡1min混匀，过滤。取2.5ml滤液，按制作标准曲线的方法测定各个样品的OD值。从标准曲线上读取1ml被测样品中的脯氨酸含量，最后按照下式换算得到叶片中游离脯氨酸的平均含量。
脯氨酸含量(μg/g)＝(C×V/a)/W；
C——曲线查C值(μg)；
V——提取液总体积(ml)；
a——测定液体积(ml)；
W——样品质量(g)。
结果见表4。在盐胁迫的情况下，各个转IbERD3基因植株的脯氨酸含量显著高于商薯19，表明其耐盐性明显增强。转空载体植株与商薯19的脯氨酸含量基本一致。
(2)丙二醛含量
丙二醛含量的测定方法具体如下：
①称取1.0g叶片，加入10ml5％三氯乙酸和少量石英砂，研磨至匀浆；3000rpm离心10min，上清即为丙二醛提取液；
②取1.5ml上述提取液(对照管取1.5ml5％三氯乙酸)，加入2.5ml0.5％TBA，混匀后于沸水浴中反应15min，迅速冷却；1800g离心10min；
③取上清液测定532nm和600nm波长处的吸光度，以蒸馏水调零。
最后按照下式换算得到游离脯氨酸的平均含量：
丙二醛含量(nmol/g)＝(OD532-OD600)×A×V/(0.155×FW×a)；
OD532——样品管在532nm处的光吸收值；
OD600——样品管在600nm处的光吸收值；
A——反应液总体积(ml)；
V——提取液总体积(ml)；
FW——样品鲜重(g)；
a——测定用液总体积(ml)。
结果见表4。在盐胁迫的情况下，各个转IbERD3基因植株的丙二醛含量显著低于商薯19，表明其耐盐性明显增强。转空载体植株与商薯19的丙二醛含量基本一致。
(3)SOD活性
SOD活性的测定方法参见文献：何绍贞(He SZ,Han YF,Wang YP,Zhai H,Liu QC.In vitro selection and identification of sweetpotato(Ipomoea batatas(L.)Lam.)plants tolerant to NaCl.Plant Cell Tissue Organ Cult,2009,96:69-74)。
SOD活性的测定方法具体如下：
①称取1.0g叶片置于预冷的研钵中，加入预冷的4mL含2％PVP的磷酸钠缓冲液(pH7.8、0.05M)，冰浴研磨匀浆，转入10mL离心管，定容至5mL；
②4℃、10000rpm离心10min，取上清液即为酶液提取样品；
③取透明度好的10mL离心管，按表3加入试剂。
表3离心管中加入的试剂组分
试剂 用量(mL)
0.05M磷酸缓冲液(2％PVP) 0.875
0.026M Met缓冲液 1.5
750μM NBT 0.3
1μM EDTA及20μM核黄素 0.3
酶提取液(对照管以磷酸缓冲液代替) 0.025
总体积 3.0
④设3个对照管(CK1、CK2和CK3)，将CK1包上铝箔避光，与其它样品管(包括CK2和CK3)同时置于4500lux日光灯下，28℃反应25min，立即用黑布遮蔽以终止反应；
⑤SOD活性测定与计算：以CK1作为空白调零，在560nm波长下测定各管的吸光度，CK2和CK3的平均值作为对照，按下列公式计算SOD活性(SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活单位)：
SOD活性(U/g)＝(ODC-ODS)×V1/ODC×0.5×FW×V2；
式中SOD活性以每g鲜重酶单位表示；
ODC——照光对照的光吸收值；
ODS——样品管的光吸收值；
V1——样品液总体积(mL)；
FW——样品鲜重(g)；
V2——测定时样品用量(mL)。
结果见表4。在盐胁迫的情况下，各个转IbERD3基因植株的SOD活性显著高于商薯19，表明其耐盐性明显增强。转空载体植株与商薯19的SOD活性基本一致。
表4植株的脯氨酸含量、丙二醛含量和SOD活性
株系 脯氨酸含量(μg/g FW) MDA含量(nM/g FW) SOD活性(U/g FW)
L1 57.55±1.93**a 17.65±0.55** 583.95±11.64**
L3 55.8±0.68** 17.76±0.90** 595.97±14.07**
L5 54.52±1.38** 19.31±1.02** 540.30±8.96**
L8 52.72±2.02** 18.26±0.66** 570.70±8.72**
L11 51.96±2.54** 21.55±0.78** 510.17±3.78**
L14 50.43±2.79** 20.24±0.81** 529.34±9.70**
L18 49.33±1.07** 19.49±0.61** 557.40±9.28**
WT 32.54±1.94 31.07±0.91 445.53±7.24
转空载体植株 32.65±1.86 31.12±0.89 443.87±6.98
**:差异达到极显著水平(P<0.01)。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：
(1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物耐盐性相关蛋白的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物耐盐性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为甘薯。
8.权利要求1所述蛋白质、权利要求2所述基因、权利要求3所述基因或权利要求4所述重组载体在培育耐盐植物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为甘薯。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105085687A (zh) * 2015-08-13 2015-11-25 辽宁省农业科学院 一种甘薯耐低温相关蛋白IbICE1及其编码基因与应用
CN110331143A (zh) * 2019-07-10 2019-10-15 江苏师范大学 用于甘薯叶形调控的miRNA及编码核酸分子与应用
CN110484547A (zh) * 2019-09-04 2019-11-22 河南农业大学 桃多胺氧化酶PpPAO1基因、其编码蛋白和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103204915A (zh) * 2013-04-11 2013-07-17 中国农业大学 甘薯耐盐相关蛋白IbEST及其编码基因与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103204915A (zh) * 2013-04-11 2013-07-17 中国农业大学 甘薯耐盐相关蛋白IbEST及其编码基因与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SUDHIR SINGH等: "A SAM-dependent methyltransferase cotranscribed with arsenate reductase alters resistance to peptidyl transferase center-binding antibiotics in Azospirillum brasilense Sp7", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》, vol. 98, 27 February 2014 (2014-02-27), pages 4625 - 4636 *
何绍贞 等: "甘薯耐盐基因克隆与功能分析", 《2012年中国作物学会学术年会论文摘要集》, 17 October 2012 (2012-10-17) *
王玉萍 等: "甘薯耐旱突变体的离体筛选与鉴定", 《中国农业科学》, 20 September 2003 (2003-09-20) *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105085687A (zh) * 2015-08-13 2015-11-25 辽宁省农业科学院 一种甘薯耐低温相关蛋白IbICE1及其编码基因与应用
CN105085687B (zh) * 2015-08-13 2019-02-01 辽宁省农业科学院 一种甘薯耐低温相关蛋白IbICE1及其编码基因与应用
CN110331143A (zh) * 2019-07-10 2019-10-15 江苏师范大学 用于甘薯叶形调控的miRNA及编码核酸分子与应用
CN110331143B (zh) * 2019-07-10 2023-03-28 江苏师范大学 用于甘薯叶形调控的miRNA及编码核酸分子与应用
CN110484547A (zh) * 2019-09-04 2019-11-22 河南农业大学 桃多胺氧化酶PpPAO1基因、其编码蛋白和应用
CN110484547B (zh) * 2019-09-04 2021-04-30 河南农业大学 桃多胺氧化酶PpPAO1基因、其编码蛋白和应用

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