CN105085687A

CN105085687A - 一种甘薯耐低温相关蛋白IbICE1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN105085687A
Application number: CN201510498166.5A
Authority: CN
Inventors: 于涛; 叶鑫; 张海楼
Original assignee: Liaoning Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Liaoning Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-08-13
Filing date: 2015-08-13
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2035-08-13
Also published as: CN105085687B

Abstract

本发明公开了一种甘薯耐低温相关蛋白IbICE1及其编码基因与应用。本发明的IbICE1蛋白是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。通过实验证明：IbICE1蛋白及其编码基因在植物对抗非生物胁迫的过程中起着重要的作用，不仅在提高植物耐低温研究中具有重要的应用价值，而且将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

一种甘薯耐低温相关蛋白IbICE1及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘薯耐低温相关蛋白IbICE1及其编码基因与应用。

背景技术

农作物低温冷害是影响中国粮食生产的重要灾害之一，并以北方地区特别是我国东北地区发生得最为频繁和严重。东北中部冷害每8年发生一次，开展作物低温冷害研究对于中国粮食安全具有重要意义。一般认为低温胁迫使植物光合作用降低、呼吸作用增强、能量产生和物质合成受阻、消耗增强、植物处于饥饿状态，严重影响了植物正常生长发育甚至导致死亡。因此，低温是限制植物生长发育的重要非生物胁迫因素之一，决定着植物的时空分布，几乎每年都会对农业生产造成巨大损失，严重影响作物的产量和品质。抗低温性已成为衡量品种是否优良的一个重要农艺性状，探索植物耐寒机制，提高其抗低温能力在农业生产上有着重要的意义。

由于植物耐寒性受多基因控制，利用常规育种手段往往难以达到定向改良目的，随着分子生物学技术水平的不断提高，基因工程手段越来越多的应用到植物耐寒遗传改良中。诸多耐寒基因被陆续克隆，相关耐寒分子调控机制也逐渐明确。基因工程技术因其目的性强、周期短等特点，已成为新品种选育的一条全新而有效的途径。利用转基因技术进行植物耐寒分子改良具有高效性和目的性，可弥补常规育种的不足，加速耐寒品种的选育进程，对于降低寒害造成的经济损失从而提高农作物的产量具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，将其命名为IbICE1蛋白。

本发明提供的IbICE1蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

其中，序列表中序列2所示的氨基酸序列由536个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与上述IbICE1蛋白相关的生物材料。

本发明提供的与上述IbICE1蛋白相关的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种：

A1)编码上述IbICE1蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；

A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；

A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；

A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；

A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；

A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；

A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；

A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1所示的核苷酸序列由1161个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码IbICE1蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的IbICE1蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码IbICE1蛋白且具有上述蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码IbICE1蛋白的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达IbICE1蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动IbICE1基因转录的启动子，还可包括终止IbICE1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin、oleosin和大豆betaconglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述IbICE1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

在本发明的一个实施方式中，IbICE1蛋白的编码基因(即序列表中序列1的核苷酸)通过含有IbICE1蛋白的编码基因的重组载体pCAMBIA3301-IbICE1导入农杆菌EHA105中。所述重组载体pCAMBIA3301-IbICE1为将序列表中序列1所示的IbICE1基因插入pCAMBIA3301载体的BglII和PmlI酶切位点之间，且保持载体pCAMBIA3301的其它序列不变得到的载体，重组载体pCAMBIA3301-IbICE1表达IbICE1蛋白。

为解决上述技术问题，本发明还提供了上述IbICE1蛋白或与上述IbICE1蛋白相关的生物材料的用途。

本发明提供了上述IbICE1蛋白或与上述IbICE1蛋白相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用。

本发明还提供了上述IbICE1蛋白或与上述IbICE1蛋白相关的生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用。

上述应用中，所述调控植物抗逆性为提高植物抗逆性。

上述应用中，所述抗逆性为抗低温胁迫，低温所处的环境温度为4度。

上述应用中，所述植物可为单子叶植物和/或双子叶植物；所述双子叶植物为甘薯，所述甘薯具体为徐薯18。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法包括将上述IbICE1蛋白的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物抗逆性高于所述受体植物。

上述方法中，所述IbICE1蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。

上述方法中，所述抗逆性为抗低温胁迫，所述抗低温胁迫具体可体现为在低温胁迫下，与受体植物相比：(1)转基因植物比受体植物的脯氨酸含量高；(2)转基因植物比受体植物的SOD活性高；(3)转基因植物比受体植物的MDA含量低；(4)转基因植物比受体植物的生长状态好。

上述方法中，所述受体植物可为单子叶植物和/或双子叶植物；所述双子叶植物为甘薯，所述甘薯具体为徐薯18。

在本发明的实施例中，IbICE1蛋白的编码基因(即序列表中序列1的核苷酸分子)通过含有IbICE1蛋白的编码基因的重组载体pCAMBIA3301-IbICE1导入农杆菌EHA105中。所述重组载体pCAMBIA3301-IbICE1为将序列表中序列1所示的IbICE1基因插入pCAMBIA3301载体的BglII和PmlI酶切位点之间，且保持载体pCAMBIA3301的其它序列不变得到的载体，重组载体pCAMBIA3301-IbICE1表达IbICE1蛋白。

上述方法中，所述IbICE1基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述IbICE1基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述含有IbICE1蛋白的编码基因的重组载体pCAMBIA3301-IbICE1可通过使用Ti质粒、植物病毒栽体、直接DNA转化、微注射和电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。

扩增编码上述IbICE1蛋白的核酸分子全长或其片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种IbICE1蛋白及其编码基因，将该基因导入甘薯中，得到过表达IbICE1基因的转IbICE1基因甘薯植株。通过实验证明：将转IbICE1基因甘薯植株进行低温胁迫处理，发现与野生型甘薯相比，转IbICE1基因甘薯植株的SOD活性增加、脯氨酸含量增加和MDA含量降低。说明本发明所提供的IbICE1蛋白及其编码基因在植物对抗非生物胁迫的过程中起着重要的作用，不仅在提高植物耐低温研究中具有重要的应用价值，而且将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为转基因植株的PCR检测(部分样品)。

图2为转IbICE1基因甘薯植株在4℃下处理12h后的生长情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的徐薯18在文献“徐薯18脱毒快繁技术推广应用研究”中公开过，公众可从辽宁省农业科学院获得。

下述实施中的辽薯36在辽宁省非主要农作物品种备案，备案编号为辽备杂粮[2012]82号，公众可从辽宁省农业科学院获得。

实施例1、IbICE1蛋白及其编码基因的获得

1、叶片总RNA提取和纯化

取辽薯36大田苗展开叶叶片约2g，在液氮中研磨成粉状，加入10mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒(ApplygenTechnologiesInc，Beijing)提取甘薯叶片总RNA。

利用QIAGENOligotexMinimRNAKit(QIAGEN，GmbH，Germany)从总RNA中纯化mRNA。取1μLmRNA于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD₂₆₀)和纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于甘薯IbICE1蛋白cDNA全长的克隆。

2、IbICE1蛋白cDNA的全长克隆

(1)3′-RACE

以辽薯36的叶片的cDNA为模板，采用引物1和引物2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物即3′RACE片段。引物序列如下：引物1：5′-GGAGGAGCCAAAGGGTTCG-3′；引物2：5′-CAGCTGTTTCAACGGTTTTGCATTA-3′。

将PCR扩增产物回收后连接pMD19-T载体(购自北京六合通经贸有限公司，产品目录号为D102A)进行TA克隆，以BcaBESTTMSequencingPrimers/M13Primers通用引物进行测序。

(2)5′-RACE

以辽薯36的叶片的cDNA为模板，采用引物3和引物4进行PCR扩增，得到PCR扩增产物即5’RACE片段。引物序列如下：引物3：5′-GCATCAGAGTCGGCTGAATTAATCC-3′；引物4：5′-AGCGGTGTCCAACAGAGCA-3′。

(3)IbICE1蛋白的cDNA的获得

利用DNAMAN7.0软件拼接候选的甘薯IbICE1蛋白cDNA序列。以辽薯36cDNA为模板，采用引物5和引物6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：引物5：5’-ATGAACACACCAAGCCTAGCA-3’(序列3)；引物6：5’-CTATACCAACCCATGGAAGGC-3’(序列4)。

PCR反应条件：95℃1min；95℃20s，53℃20s，72℃2min，进行40个循环；72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并测序：结果表明PCR扩增获得大小为1611bp长度的扩增片段，将其命名为IbICE1，IbICE1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列表中序列1由1611个核苷酸分子组成；IbICE1基因编码的蛋白命名为IbICE1蛋白，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；序列表中序列2由536个氨基酸残基组成。

实施例2、转IbICE1甘薯植株的获得及其耐低温分析

一、转IbICE1甘薯植株的获得

1、重组载体pCAMBIA3301-IbICE1的构建

(1)根据甘薯IbICE1蛋白cDNA的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列，正反向引物分别引入BglII和PmlI酶切位点，引物序列如下：

引物7：5’-AGATCTATGAACACACCAAGCCTAGCA-3’(下划线部分为BglII酶切位点)；

引物8：5’-CACGTGCTATACCAACCCATGGAAGGC-3’(下划线部分为PmlI酶切位点)。

(2)以人工合成的序列表中序列1所示的DNA分子为模板(或以辽薯36cDNA为模板)，采用引物7和引物8进行PCR扩增，得到大小为1611bp的PCR产物。

(3)将步骤(2)获得的PCR产物连接到pEASY-Bluntsimple载体(TransgenBiotech,Beijing，China)上，命名为pEASY-IbICE1载体，进行T7/sp6的测序，该PCR产物具有序列表中序列1自5’末端第1-1611位核苷酸；保证甘薯IbICE1蛋白cDNA的阅读框及酶切位点的正确。

用BglII和PmlI酶切载体pCAMBIA3301(CAMBIA公司)，回收载体大片段；同时，用BglII和PmlI酶切载体pEASY-IbICE1，回收约2kb中间片段；将回收的载体大片段与约2kb中间片段连接，得到重组载体pCAMBIA3301-IbICE2。

将重组载体pCAMBIA3301-IbICE1转化大肠杆菌DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD201-01)，37℃培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。

测序结果表明：重组载体pCAMBIA3301-IbICE1为将序列表中序列1自5′端第1-1611位所示核苷酸分子插入到pCAMBIA3301载体的BglII和PmlI酶切位点(替换掉gusA报告基因)间，且保持载体pCAMBIA3301的其它序列不变得到的载体。该重组载体pCAMBIA3301-IbICE1也可以将人工合成的序列表中序列1所示的DNA分子插入到pCAMBIA3301载体的BglII和PmlI酶切位点间，且保持载体pCAMBIA3301的其它序列不变得到。

2、重组载体pCAMBIA3301-IbICE1转化农杆菌

(1)从-80℃低温冰箱中取出200μLEHA105感受态细胞(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)，置冰上融化，加入1μg上述步骤1得到的重组载体pCAMBIA3301-IbICE1，混匀；

(2)液氮冷冻1min，37℃温育5min；

(3)加入800μLLB液体培养基，28℃培养6h；

(4)取100μL菌液至LB固体培养基上(含100μg/mL利福平(Rif)、25μg/mL卡那霉素(Kan))，涂布均匀，将培养皿封口。倒置培养皿28℃培养2d；

(5)PCR鉴定呈阳性的单菌落命名为EHA105/pCAMBIA3301-IbICE1；将EHA105/pCAMBIA3301-IbICE1接种到含有100μg/mLRif、25μg/mLKan的LB液体培养基中，28℃培养30h至对数生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释30倍备用，即得到EHA105/pCAMBIA3301-IbICE1农杆菌菌液。

3、转IbICE1甘薯植株的获得

(1)转化

用农杆菌介导的方法将IbICE1cDNA的编码序列导入到甘薯主栽品种徐薯18中，具体方法如下：

将徐薯18胚性细胞团悬浮于EHA105/pCAMBIA3301-IbICE1农杆菌菌液中，摇动片刻使其充分散开，以使胚性细胞团充分接触菌液，静置5min，然后用吸管将菌液吸出，将侵染过的胚性细胞团移至含有30mg/LAS和2.0mg/L2,4-D的MS固体培养基上进行共培养，固体培养基上铺1层普通滤纸，27±1℃，暗培养3d。将共培养3d后的胚性细胞团用刀片轻轻刮下，用含有500mg/LCarb和2.0mg/L2,4-D的MS液体培养基洗涤3次，再转入含有100mg/LCarb和2.0mg/L2,4-D的MS液体培养基中，延迟培养1w。然后将液体培养基尽量吸干，摆在铺有1～2层滤纸并含有0.3mg/LPPT、100mg/LCarb和2.0mg/L2,4-D的固体MS培养基上进行选择培养，培养条件为27±1℃，暗培养。2w后将生长状态良好的愈伤组织转移至铺有1层滤纸并含有0.5mg/LPPT、100mg/LCarb和2.0mg/L2,4-D的固体MS培养基上进行选择培养。培养2w后将生长状态良好的愈伤组织转移至铺有1层滤纸的并含有0.8mg/LPPT、100mg/LCarb和2.0mg/L2,4-D的固体MS培养基上进行选择培养，其后每2w继代1次。将在含有0.8mg/LPPT、100mg/LCarb和2.0mg/L2,4-D的固体MS培养基上选择培养8w后形成的抗性愈伤组织转移至含有100mg/LCarb和1mg/LABA的MS固体培养基上，培养条件为27±1℃、每日13h、3000lux的光照，诱导形成体细胞胚。诱导2～4w，将成熟的体细胞胚转移到MS固体培养基上，培养条件为27±1℃、每日13h、3000lux的光照，培养4～8w后，再生出完整的拟转IbICE1甘薯植株。将再生的小植株切下，继代培养在MS固体培养基上，培养条件为27±1℃、每日13h、3000lux的光照，每6w继代1次。

(2)分子鉴定

用CTAB法提取拟转基因植株和野生型甘薯植株的基因组DNA作为模板，采用primer1：5′-GAACTCGCCGTAAAGACTGG-3′和primer2：5′-GACGTTCATCACCCACACAG-3′进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30S，55℃复性30s，72℃延伸2min共35个循环。

PCR扩增产物的电泳检测结果如图1所示：其中泳道M为Maker；泳道W为阴性对照水；泳道P为阳性对照(重组质粒pCAMBIA3301-IbICE1)；泳道WT为野生型甘薯植株；泳道L1-泳道L12为拟转IbICE1甘薯植株，PCR扩增得到大小为1740bp的拟转基因植株为阳性转IbICE1甘薯植株，从图中可以看出，泳道L1-L12所示的拟转基因植株均为阳性，表明IbICE1基因已经整合到甘薯的基因组中，并证明这些再生植株为阳性转基因植株。随机选取14株转IbICE1甘薯植株进行耐低温分析。

二、转IbICE1甘薯植株的耐低温分析

1、表型鉴定

选取转IbICE1甘薯植株L14、L15和L48和野生型徐薯18植株试管苗在4℃胁迫下培养12h后，对其生长状态进行观察。

结果如图2所示：野生型植株叶片萎蔫严重；而转IbICE1甘薯植株L14、L15和L48的生长状态明显优于野生型，说明IbICE1的过表达提高了转IbICE1甘薯植株的耐低温性。

2、脯氨酸含量测定

植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐等胁迫时，游离的氨基酸便会大量积累，并且积累指数和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。参照文献“HeSZ,HanYF,WangYP,ZhaiH,LiuQC.Invitroselectionandidentificationofsweetpotato(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)plantstoleranttoNaCl.PlantCellTissueOrganCult,2009,96:69-74”中的方法，对转IbICE1甘薯植株的脯氨酸含量进行测定。具体步骤如下：

将转IbICE1甘薯植株L14、L67、L24、L80、L61、L15、L33、L101、L48、L52、L11、L2、L40、L19与野生型植株继代于MS固体培养上进行培养，27±1℃，每天13h、3000lux光照。培养3w后，4℃胁迫12h，取其叶片测定脯氨酸含量，重复3次。

(1)主要试剂及配方

6M磷酸：量取102.5mL85％的磷酸于250mL容量瓶中，定容至刻度；

2.5％酸性茚三酮：称取5.0g茚三酮，加入120mL冰醋酸和80mL6M磷酸，70℃下水浴至溶解，冷却后贮存于棕色瓶中尽快使用。

4℃冰箱中保存可用3d。

(2)测定方法

实验分为两部分：脯氨酸标准曲线的绘制和植株样品的提取及测定。具体步骤如下：

1)脯氨酸标准曲线的制作：

A、称取10mg脯氨酸，用少量无水乙醇溶解，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容配成100μg/mL的母液；

B、取上述母液0、0.625、1.25、2.5、3.75、5.0、6.25和7.5mL分别放入8个25mL的容量瓶中，再分别加入蒸馏水定容至刻度，充分混匀，配制成0、1.25、2.5、5、7.5、10、12.5和15μg/mL系列浓度的脯氨酸溶液；

C、分别取上述溶液2mL，加入2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮(注意不要接触皮肤)，充分混匀，沸水浴显色15min，冷却后于520nm处测吸光度；

D、以吸光度值为横坐标，脯氨酸含量为纵坐标，绘制脯氨酸标准曲线。

2)植物样品的提取及测定：

A、称取植株叶片1.0g，剪碎，加入5mL80％乙醇，研磨至匀浆；

B、将匀浆液体移入试管中，加水补足25mL，充分混匀，80℃水浴20min；

C、分别加入0.5g人造沸石和0.2g活性炭，于漩涡振荡器上振荡1min混匀，然后用一层滤纸过滤；

D、取2.5mL滤液，按制作标准曲线的方法测定各个样品的吸光度值；

E、从制作的脯氨酸标准曲线上检出1mL被测样品脯氨酸的含量，最后通过下式计算得到游离脯氨酸的平均含量：脯氨酸含量(μg/g)＝(C×V1/V2)/W。其中，C代表曲线查C值(μg)；V1代表提取液总体积(mL)；V2代表测定液体积(mL)；W代表样品质量(g)。

14个转IbICE1甘薯植株和野生型植株脯氨酸含量测定结果如表1所示：14个转IbICE1甘薯植株的脯氨酸含量显著高于野生型植株。说明IbICE1的过表达提高了转IbICE1甘薯植株的耐逆性。

3、SOD活性测定

SOD活性是鉴定植物耐盐性的重要生理生化指标。参照“HeSZ,HanYF,WangYP,ZhaiH,LiuQC.Invitroselectionandidentificationofsweetpotato(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)plantstoleranttoNaCl.PlantCellTissueOrganCult,2009,96:69-74”中的方法，对转IbICE1甘薯植株的SOD活性进行测定。具体步骤如下：

将转IbICE1甘薯植株L14、L67、L24、L80、L61、L15、L33、L101、L48、L52、L11、L2、L40、L19与野生型植株继代于MS固体培养上进行培养，27±1℃，每天13h、3000lux光照。培养3w后，4℃胁迫12h，取其叶片测定SOD含量，重复3次。

(1)主要试剂及配方

A、0.1M磷酸钠(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)缓冲液(pH7.8)由A液和B液组成：A液(0.1MNa₂HPO₄溶液)：称取Na₂HPO₄·2H₂O7.163g，用少量蒸馏水溶解后，移入200mL容量瓶中定容，充分混匀。4℃冰箱中保存备用；B液(0.1MNaH₂PO₄溶液)：称取NaH₂PO₄·2H₂O0.780g，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中定容，充分混匀。4℃冰箱中保存备用；取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1M的磷酸钠缓冲液(pH7.8)。4℃冰箱中保存备用。

B、0.026M甲硫氨酸(Met)磷酸钠缓冲液

称取甲硫氨酸(C₅H₁₁NO₂S)0.388g，用少量0.1M的磷酸钠缓冲液(pH7.8)溶解后，移入100mL容量瓶中，再用相同浓度的磷酸钠缓冲液定容，充分混匀。4℃冰箱中保存可用1～2d。

C、7.5×10^-4MNBT溶液

称取NBT(C₄OH₃OC_l2N₁₀O₆)0.153g，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容，充分混匀。4℃冰箱中保存可用2～3d。

D、含1.0μMEDTA的2×10^-5M核黄素溶液

A液：称取EDTA0.003g，用少量蒸馏水溶解；

B液：称取核黄素0.075g，用少量蒸馏水溶解；

C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，此溶液即为含0.1mMEDTA的2mM核黄素溶液，避光保存(可用黑纸将装有溶液的棕色瓶包好)。4℃冰箱中保存可用8～10d。当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0μMEDTA的2×10^-5M核黄素溶液。

E、含2％聚乙烯比咯烷酮(PVP)的0.05M磷酸钠缓冲液(pH7.8)

取0.1M的磷酸钠缓冲液(pH7.8)50mL，加入2gPVP，充分溶解后移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

(2)测定方法

A、称取1.0g样品叶片置于预冷的研钵中，加入预冷的4mL含有2％PVP的0.05M磷酸钠缓冲液(pH7.8)，冰浴研磨匀浆，转入10mL离心管，定容至5mL；

B、4℃，10,000rpm，离心10min，取上清液即为酶液提取样品；

C、取透明度好的10mL离心管，每个植株3次重复，按照下表加入试剂：0.05M磷酸缓冲液(2％PVP)0.875mL、0.026MMet缓冲液1.5mL、750μMNBT0.3mL、1μMEDTA及20μM核黄素0.3mL、酶提取液(对照管以磷酸缓冲液代替)0.025mL。

D、设3个对照CK1、CK2和CK3，将CK1包上铝箔避光，与其它样品管(包括CK2和CK3)同时置于4500lux日光灯下，反应温度28℃，25min后，立即用黑布遮蔽以终止反应。

E、SOD活性测定与计算：以遮光的对照管CK1作为空白调零，在560nm波长下测定各管的吸光度，CK2和CK3的平均值作为对照，按下列公式计算SOD活性(SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活单位)：SOD活性(U/g)＝(OD_C-OD_S)×V₁/OD_C×0.5×FW×V₂。式中SOD活性以每g鲜重酶单位表示；OD_C代表照光对照的光吸收值；OD_S代表样品管的光吸收值；V₁代表样品液总体积(mL)；FW代表样品鲜重(g)；V₂代表测定时样品用量(mL)。

14个转IbICE1甘薯植株和野生型植株的SOD活性测定结果如表1所示：14个转IbICE1甘薯植株的SOD活性显著高于高于野生型植株。

4、MDA含量测定

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置上释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，改变这些大分子的构型，或者使之产生交联反应，从而丧失功能，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。

参照文献“GaoS,YuanL,ZhaiH,LiuCL,HeSZ,etal.TransgenicsweetpotatoplantsexpressinganLOS5genearetoleranttosaltstress.PlantCellTissueOrganCult,2011,107:205-213”中的方法，对转IbICE1甘薯植株的MDA含量进行测定。具体步骤如下：

将转IbICE1甘薯植株L14、L67、L24、L80、L61、L15、L33、L101、L48、L52、L11、L2、L40、L19与野生型植株继代于MS固体培养上进行培养，27±1℃，每天13h、3000lux光照。培养3w后，4℃胁迫12h，取其叶片测定MDA含量，重复3次。

(1)主要试剂及配方

A、5％三氯乙酸(TCA)：称取5g三氯乙酸，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中定容，充分混匀；

B、0.5％硫代巴比妥酸(TBA)：称取0.5g硫代巴比妥酸，用少量5％TCA溶解后，移入100mL容量瓶中定容，充分混匀；

C、石英砂。

(2)提取及测定方法

A、称取1.0g材料，加入10mL5％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆；

B、3,000rpm离心10min，取上清即为丙二醛提取液；

C、取1.5mL上述提取液(对照管取1.5mL5％TCA)，加入2.5mL0.5％TBA，混匀后于沸水浴中反应15min，迅速冰浴冷却；

D、1,800g离心10min；

E、以蒸馏水调零，在532nm和600nm波长下测定上清液的吸光度；

F、根据如下公式计算MDA含量：MDA含量(nM/g)＝(OD₅₃₂-OD₆₀₀)×V₁×V₂/(0.155×FW×V₃)。其中，OD₅₃₂代表样品管在532nm处的光吸收值；OD₆₀₀代表样品管在600nm处的光吸收值；V₁代表反应液总体积(mL)；V₂代表提取液总体积(mL)；FW代表样品鲜重(g)；V₃代表测定用液总体积(mL)。

14个转IbICE1甘薯植株和野生型植株的MDA含量测定结果如表1所示：14个转IbICE1甘薯植株的MDA含量低于野生型植株。

上述转IbICE1甘薯植株的脯氨酸含量、SOD活性和MDA含量的测定结果说明：同野生型甘薯植株相比，过表达IbICE1基因的转IbICE1甘薯植株的耐低温性显著提高，说明蛋白IbICE1及其编码基因可用来调控植物耐逆性，尤其是提高植物耐低温性。

表1、过表达IbICE1基因甘薯植株的脯氨酸含量、MDA含量和SOD活性测定

注：^*:差异达到显著水平(P<0.05)；^**:差异达到极显著水平(P<0.01)

Claims

1.蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；

A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；

A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；

A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；

A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；

A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；

A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；

A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用；

或权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗低温胁迫。

6.一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗低温胁迫。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.扩增编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子全长或其片段的引物对。