CN116926084A - 一种用于延缓采后苹果果实软化品质改善的功能基因 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于延缓采后苹果果实软化品质改善的功能基因，属于果蔬保鲜技术和植物基因工程技术领域。本发明从苹果中分离到的一个B‑Box(BBX)转录因子MdBBX25，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过qRT‑PCR技术分析发现，MdBBX25基因在‘金冠芽变’苹果品种(软化速度较快)中表达量低于‘金冠’，亚细胞定位发现该转录因子定位在细胞核上，通过苹果瞬时注射实验、石蜡切片观察、生理数据测定及基因表达分析表明：过表达MdBBX25可以通过抑制乙烯生物合成和细胞壁降解延缓苹果果实软化，而沉默MdBBX25可通过促进乙烯生物合成和细胞壁降解加速苹果果实软化，说明MdBBX25在延缓采后苹果果实软化品质方面有明显作用。MdBBX25基因的发掘为苹果果实内在品质的改善提供依据。

Description

一种用于延缓采后苹果果实软化品质改善的功能基因
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种苹果MdBBX25基因在延缓采后苹果果实软化品质中的用途。
背景技术
苹果作为世界四大果树之一，是温带地区的主要栽培树种。我国地域辽阔，土地肥沃，气候条件适宜，拥有着最为丰富的苹果属植物，拥有着世界上最多的苹果产量和最大的栽培面积。果实软化的速度不仅会影响采后的货架期，还会对其他具有重要经济意义的方面产生重要影响，如采收频率、处理程序和果实的运输距离等。理想的软化程度可能因品种和栽培品种而异，因为过度软化通常会导致采后腐烂或消费者拒收。因此，深入了解导致苹果果实软化的潜在机制，可为防止不良质地变质和延长贮藏期提供有价值的见解。
果实的硬度与其软化密切相关，在决定整体适口性和运输性方面起着至关重要的作用。果实硬度主要受细胞壁结构完整性和角质层特性的影响。细胞壁降解导致细胞结构松散，是导致果实在成熟过程中逐渐失去硬度的关键因素。大量研究表明，细胞壁多糖的解体在果实软化过程中起着重要作用.水果的软化特性在很大程度上可归因于与细胞壁相关的酶活性的变化，包括聚半乳糖醛酸酶(PG)、β-葡萄糖苷酶(BGL)、纤维素酶、扩张素(EXP)、内切酶等、扩张素(EXP)、内转糖苷酶/水解酶(XTH)、内切葡聚糖酶(GLU)、木聚糖酶、β-半乳糖苷酶、UDP-阿拉伯糖4-酰亚胺酶、木聚糖和果胶甲基酯酶。
在果实成熟发育过程中，果实质地软化受多个转录因子和基因共同调控，明确转录因子对果实品质形成及调控的作用机理对果实品质改良育种提供新的方向。B-box(BBX)蛋白是一类具有锌指结构的转录因子，由N端区域的一个或两个B-box基序(CX2CX8CX7CX2CX4HX8H)组成，在某些情况下，它们还可能包括一个靠近羧基末端的CCT(CONSTANS、CO-like和TOC1)结构域。BBX蛋白在调控网络中发挥着关键作用，这些网络支配着各种生长和发育过程，包括幼苗的光形态发生、开花的光周期调控、避荫以及对生物和非生物胁迫的响应。最近的研究揭示了BBX蛋白在各种生物过程中的其他作用，包括热形态发生、花青素积累、类胡萝卜素生物合成、类黄酮生物合成和叶片衰老等。然而，迄今为止，还没有公开报道证明BBX蛋白参与了果实质地的变化。
发明内容
为了解决促进乙烯生物合成和细胞壁降解加速使采摘后苹果果实软化的问题，本发明提供一种用于延缓采后苹果果实软化品质改善的功能基因。
一种如核苷酸序列表SEQ ID NO.1所示的功能基因在延缓采后苹果果实软化品质改善的应用，即将核苷酸序列表SEQ ID No.1所示的功能基因克隆到过表达载体，所述功能基因的过表达抑制苹果中乙烯生物合成和细胞壁降解，延缓苹果果实的硬度下降、减缓成熟衰老进程，实现延缓采后苹果果实软化。
进一步限定的技术方案如下：
所述过表达载体为pSuper1300。
利用基因工程手段将核苷酸序列表SEQ ID No.1所示的功能基因导入耐贮性较差的苹果品种使其增强耐贮性的应用。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
(1)本发明有利于从分子机制上阐明苹果BBX基因在调控苹果软化的作用机理，为苹果分子辅助育种和基因工程育种提供理论基础和基因资源。通过苹果瞬时注射实验、石蜡切片观察、生理数据测定及基因表达分析表明：过表达MdBBX25可以通过抑制乙烯生物合成和细胞壁降解延缓苹果果实软化，而沉默MdBBX25可通过促进乙烯生物合成和细胞壁降解加速苹果果实软化，说明MdBBX25在延缓采后苹果果实软化品质方面有明显作用。
(2)MdBBX25可指导苹果果实采后贮藏过程中的品质维持，通过检测MdBBX25基因表达量变化，以确定苹果品种是否适合长期贮藏，降低贮藏损耗，提高生产效益。
(3)可利用基因工程手段，将MdBBX25基因导入耐贮性较差的苹果品种改良苹果品种，增强耐贮性。
附图说明
图1为对转录组测序中的BBX转录因子家族进行分析图；
图2为不同贮藏时间‘金冠’和‘金冠芽变’苹果果实BBX基因的表达量图；
图3为MdBBX25-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位图；
图4为过表达载体侵染苹果果实后的表型和石蜡切片研究图；
图5为过表达载体侵染苹果果实后的生理数据测定图；
图6为过表达载体侵染苹果果实后与乙烯生物合成、细胞壁降解相关及MdBBX25的基因表达模式图；
图7为沉默载体侵染苹果果实后的表型和石蜡切片研究图；
图8为沉默载体侵染苹果果实后的生理数据测定图；
图9为沉默载体侵染苹果果实后与乙烯生物合成、细胞壁降解相关及MdBBX25的基因表达模式图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
目前BBX的相关报道主要集中光形态建成、开花和生物胁迫等方面，在调控果实质地方面还未见有相关报道。挖掘苹果BBX基因并进行功能研究，具有重要的理论意义。
本发明进行了深入研究，从‘金冠’苹果果实中分离克隆出苹果MdBBX25(MD08G1049600)基因。全长cDNA为990bp，记载在JGI数据库(https://phytozome-next.jgi.doe.gov)中。
一种如核苷酸序列表SEQ ID NO.1所示的功能基因在延缓采摘后苹果果实软化品质改善的应用，将核苷酸序列表SEQ ID No.1所示的功能基因克隆到过表达载体pSuper1300，所述功能基因的过表达抑制苹果中乙烯生物合成和细胞壁降解，延缓苹果果实的硬度下降、减缓成熟衰老进程，实现延缓采摘后苹果果实软化。
所述核苷酸序列表SEQ ID NO.1所示功能基因中，ATG表示起始密码子，TAG表示终止密码子。(上述所克的全长和数据库中的序列一致)。
利用基因工程手段将核苷酸序列表SEQ ID No.1所示的功能基因导入耐贮性较差的苹果品种使增强耐贮性的应用。
为研究基因MdBBX25的功能，本发明构建了基因MdBBX25的过表达载体和沉默载体。其中：
基因过表达载体的构建如下：
设计MdBBX25的正向引物和反向引物，然后从‘金冠’的cDNA中克隆出该基因序列，并利用XbaⅠ和SmaⅠ双酶切位点构建到植物过表达载体pSuper1300上，形成融合质粒MdBBX25-pSuper1300，并通过冻融法将其转化至根癌农杆菌GV3101。引物序列如下：
MdBBX25(XbaⅠ)-F:GCTCTAGACATGGCATCGAAGCTCTGCGAC(SEQ IDNO.2)
MdBBX25(SmaⅠ)-R:TCCCCCGGGAAAACGACGGAACGACGCCGTA(SEQ IDNO.3)
基因沉默载体的构建如下：
选取该基因的cDNA非保守区200-400bp片段作为特异性片段，其序列如SEQIDNO.4所示，然后利用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切位点，将SEQ ID NO.2构建到病毒沉默载体pTRV2上，构建完成pTRV2-MdBBX25重组质粒，并通过冻融法转化至根癌农杆菌GV3101。引物序列如下：
pTRV2-MdBBX25(XbaⅠ)-F:GCTCTAGAGAAGAACCGAAAGTTCGAGAAGAC
(SEQ ID NO.5)
pTRV2-MdBBX25(KpnⅠ)-R:
CGGGGTACCCAGTACACCGGATCTCGACCGATA(SEQ ID NO.6)
通过苹果瞬时注射实验、石蜡切片观察、生理数据测定及基因表达分析表明：过表达MdBBX25可以通过抑制乙烯生物合成和细胞壁降解延缓苹果果实软化，而沉默MdBBX25可通过促进乙烯生物合成和细胞壁降解加速苹果果实软化，说明MdBBX25在延缓采后苹果果实软化品质方面有明显作用。
MdBBX25基因的发掘不仅能为苹果采后果实软化品质保持方面提供新的候选基因，而且为其它肉质果实采后保鲜功能研究提供理论基础。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
本发明实施例中所用的试验试剂均为本领域常规的试剂，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：苹果MdBBX25基因全长及特异性片段的克隆
(一)‘金冠’苹果果实RNA提取及反转录
1.植物总RNA提取
用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)对苹果叶片、苹果果实样品提取其总RNA含量，具体步骤如下：
1)匀浆处理。50—100mg植物叶片或果实果肉在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μL裂解液SL(使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇)，立即涡旋剧烈震荡混匀。
2)12,000rpm离心2min。
3)将上清液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。
4)缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
5)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
6)DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD缓冲液，轻柔混匀。
7)向吸附柱CR3中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。
8)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
9)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
10)重复步骤9。
11)12,000rpm离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm离心1min，得到RNA溶液。
保存在-80℃冰箱，在保存前用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性并在Agilent2100生物分析仪(美国加利福尼亚州圣克拉拉)上对RNA的浓度进行测定。
2.RNA反转录为cDNA
用HiScript IIQ RT SuperMix for qPCR试剂盒(Vazyme，南京)对样品进行反转录。具体步骤如下：
1)基因组DNA去除。
用移液枪轻轻吹打混匀。42℃反应2min。
2)配制逆转录反应体系。
用移液枪轻轻吹打混匀。
3)进行逆转录反应。
50℃ 15min
85℃ 5sec
获得反转录产物。产物可立即用于qPCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。
(二)MdBBX25基因全长的克隆
以实施例1步骤(一)中2的cDNA为模板，用Phanta Max Super-FidelityDNAPolymerase(P505)(Vazyme，南京)高保真酶进行扩增。MdBBX25上下游基因引物如下：
MdBBX25-F:GACAAGAGTGAGTGCTATTTACG(SEQ ID NO.7)
MdBBX25-R:TTCCCGGGGAAAAAAACGAA(SEQ ID NO.8)
扩增步骤如下：
1)
模板使用量：
2)PCR反应程序：95℃预变性3分钟；循环参数为95℃变性15秒、58℃退火15秒、72℃延伸70秒，进行35个循环；72℃充分延伸5分钟。
PCR反应结束后，PCR产物进行回收、连接到克隆载体pMD19-T上、转化到大肠杆菌DH5α中，涂布到加有50mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑选单菌落送到上海生工股份有限公司进行测序，测序结果在JGI数据库(https://phytozome-next.jgi.doe.gov)进行blast比对，克隆序列与MD08G1049600序列一致。
(三)MdBBX25基因特异性片段的克隆
以实施例1步骤(一)中2的cDNA为模板，用Phanta Max Super-FidelityDNAPolymerase(P505)(Vazyme，南京)高保真酶进行扩增。MdBBX25特异性片段上下游基因引物如下：
MdBBX25-VIGS-F:GAGAAGCGGAAGAACCGAAAGTTC(SEQ ID NO.9)；
MdBBX25-VIGS-R:CAGTACACCGGATCTCGACCGATA(SEQ ID NO.10)；
扩增步骤及PCR反应程序同实施例1步骤(二)。
PCR反应结束后，PCR产物进行回收、连接到克隆载体pMD19-T上、转化到大肠杆菌DH5α中，涂布到加有50mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑选单菌落送到上海生工股份有限公司进行测序，对测序正确的单菌落提取质粒，确定得到MdBBX25基因的特异性片段序列。
实施例2不同贮藏时间‘金冠’和‘金冠芽变’苹果果实BBX基因的表达量
1)为了探究影响采后苹果果实软化的主效基因，将‘金冠’和‘金冠芽变’苹果果实进行了转录组测序，通过对转录组测序结果进行分析，发现了一个占比较大的转录因子家族BBX，参见图1，有“*”标记的为差异表达较大的基因，挑选出6个差异表达较大的基因MdBBX1(MD15G1045000)，MdBBX2(MD13G1263800)，MdBBX16(MD09G1079200)，MdBBX25(MD08G1049600)，MdBBX42(MD16G1265000)，MdBBX54(MD04G1042700)。
2)取样不同贮藏期的‘金冠’和‘金冠芽变’苹果果肉，液氮中迅速固定。分别提取上述不同贮藏期果肉的总RNA，并反转录为cDNA，方法同实施例1中的步骤(一)。
3)在MdBBX1，MdBBX2，MdBBX16，MdBBX25，MdBBX42，MdBBX54基因的非保守区设计特异引物以及苹果的内参引物MdActin-F和MdActin-R。序列如下：
MdBBX1-qRT-F:GGCATCGTTCCGTCGTTTTA(SEQ ID NO.11)；
MdBBX1-qRT-R:TGATGCGAATCCCCAAACCAA(SEQ ID NO.12)；
MdBBX2-qRT-F:CGTGGTGGATCGCATCTATT(SEQ ID NO.13)；
MdBBX2-qRT-R:GAGAGAGACTTTACGGACTTGC(SEQ ID NO.14)；
MdBBX16-qRT-F:GATGACCCTATCTCTTCAAATAAC(SEQ ID NO.15)；
MdBBX16-qRT-R:CAATCACACTTCACACATCTC(SEQ ID NO.16)；
MdBBX25-qRT-F:GTACAGAGAGAAGCGGAAGAAC(SEQ ID NO.17)；
MdBBX25-qRT-R:CCGGATCTCGACCGATATTTAC(SEQ ID NO.18)；
MdBBX42-qRT-F:CCGCAAGTTCCAGAAGACTAT(SEQ ID NO.19)；
MdBBX42-qRT-R:CTTTCACCGGCCAATCAATAAA(SEQ ID NO.20)；
MdBBX54-qRT-F:CAGAAATCTCCTCCGCCAATTA(SEQ ID NO.21)；
MdBBX54-qRT-R:TCCCAGAAGCAAGTGAGAAAG(SEQ ID NO.22)；
MdActin-F:GAAGCTGCTGGCATTCATGA(SEQ ID NO.23)；
MdActin-R:CTGGTGGAGCTACAACCTTG(SEQ ID NO.24)；
4)用步骤(2)中所得的cDNA为模板，用苹果内参引物MdActin-F和MdActin-R调整这些cDNA模板，使各cDNA模板浓度一致。
5)用浓度一致的cDNA模板进行qRT-PCR，检测MdBBX1，见图2中的A、MdBBX2，见图2中的B、MdBBX16，见图2中的C、MdBBX25，见图2中的D、MdBBX42，见图2中的E、MdBBX54，见图2中的F。基因在不同贮藏期‘金冠’和‘金冠芽变’果实中的表达差异。发现随着贮藏期延长硬度下降，MdBBX25的表达量显著上升，在贮藏15天时表达量较高，见图2中的D，直至贮藏后期硬度较低时，MdBBX25的表达量迅速下降，且‘金冠’的表达量始终比‘金冠芽变’高，MdBBX25基因的表达模式符合该试验对BBX基因功能的预期，因此后期对MdBBX25进行进一步研究。
实施例3MdBBX25基因相关载体构建
将实施例1步骤(二)中的得到MdBBX25基因的cDNA全长序列，运用分别带有XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的引物序列进行扩增，参照实施例1步骤(二)中的基因克隆方法，连接到克隆载体pMD19-T上，得到融合质粒MdBBX25-pMD19-T(XbaⅠ、SmaⅠ)。
然后分别对空载体pSuper1300和MdBBX25-pMD19-T(XbaⅠ、SmaⅠ)用限制性核酸内切酶XbaⅠ和SmaⅠ进行酶切、琼脂糖凝胶电泳、胶回收、T4-DNA连接酶连接线性pSuper1300载体和目的基因MdBBX25片段，转化到大肠杆菌DH5α，对测序正确的单菌落，进行提取重组质粒MdBBX25-pSuper1300。
同理，将实施例1步骤(三)中的得到MdBBX25基因的cDNA特异性片段，运用分别带有XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物序列进行扩增，参照实施例1步骤(二)中的基因克隆方法，连接到克隆载体pMD19-T上，得到融合质粒MdBBX25-VIGS-pMD19-T(XbaⅠ、KpnⅠ)。然后分别对空载体pTRV2和MdBBX25–VIGS-pMD19-T(XbaⅠ、KpnⅠ)用限制性核酸内切酶XbaⅠ、KpnⅠ进行酶切、琼脂糖凝胶电泳、胶回收、T4-DNA连接酶连接线性pTRV2载体和目的基因MdBBX25特异性片段，转化到大肠杆菌DH5α，对测序正确的单菌落，进行提取重组质粒MdBBX25-pTRV2。
将以上二种重组质粒用冻融法分别转入GV3101农杆菌中。
实施例4MdBBX25基因瞬时转化苹果果实
(一)含MdBBX25基因的过表达载体注射
1)MMA侵染液制备：100mL侵染液中各组分终浓度为10mM MgCl2、10mM脂肪酸甲酯磺酸盐(MES)和200μM乙酰丁香酮(AS)中，使用KOH将侵染液的PH调至pH 5.6，现配现用；
2)准备注射液。将包含MdBBX25-pSuper1300、pSuper1300的GV3101农杆菌置于LB液体培养基(含100mg/L Kan和100mg/L Rif)中，28℃，200rpm震荡，培养至OD600为0.8～1，随后转移至50ml离心管中，5000rpm，10min，离心收集菌体，用MMA溶液重悬两次，使OD600＝0.8，然后将注射液在28℃黑暗培养箱静置3小时。
3)注射。用无菌一次性注射器吸取1mL注射液，用针头在采收第0d的‘金冠芽变’果实赤道位置选取均匀分布的4个点扎孔，将去除针头的注射器轻轻按压在针孔处，通过针孔缓慢将注射液注射进入果实(注射速度约为1mL·min-1)，随后将注射后的果实置于室温贮藏。
(二)含MdBBX25基因的沉默载体注射
1)MMA侵染液制备：100mL侵染液中各组分终浓度为10mM MgCl2、10mM脂肪酸甲酯磺酸盐(MES)和200μM乙酰丁香酮(AS)中，使用稀盐酸将侵染液的PH调至pH 5.6，现配现用；
2)准备注射液。将包含MdBBX25-pTRV2、pTRV2、pTRV1(pTRV2的辅助表达载体)的GV3101农杆菌置于LB液体培养基(含100mg/L Kan和100mg/L Rif)中，28℃，200rpm震荡，培养至OD600为1.0～2.0，随后转移至50ml离心管中，5000rpm，10min，离心收集菌体，用MMA溶液重悬两次，使OD600＝1.0～2.0，然后将注射液在28℃黑暗培养箱静置3小时。
3)混合。设置二个处理，分别为MdBBX25-pTRV(MdBBX25-pTRV2和pTRV1按照体积比1：1混合)；pTRV(pTRV2和pTRV1按照体积比1：1混合)；
4)注射。用无菌一次性注射器吸取1mL注射液，用针头在采收第0d的‘金冠’果实赤道位置选取均匀分布的4个点扎孔，将去除针头的注射器轻轻按压在针孔处，通过针孔缓慢将注射液注射进入果实(注射速度约为1mL·min-1)，随后将注射后的果实置于室温贮藏。
实施例5MdBBX25基因亚细胞定位
与上述果实瞬时过表达方法相同，将酶切好的MdBBX25片段其插入pSuper1300-GFP载体(SmaI/XbaI)中，以产生MdBBX25绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白构建体。将得到的构建体转移到农杆菌GV3101中，并侵染新鲜洋葱鳞片。使用EVOS FL AUTO2(Thermo FisherScientific，美国马萨诸塞州)观察被感染的洋葱鳞片。具体步骤如下：
1)使用新鲜的洋葱，先去其外层鳞片，然后在超净工作台上，用灭菌过的刀片将洋葱的内表皮切成小块，用灭菌过的镊子取下内表皮，将其平铺在1/2MS不加任何激素的固体培养基上，28℃培养箱里黑暗下培养24h左右。
2)在黑暗环境下，将先前经过转化处理的pSuper1300-GFP-MdBBX25农杆菌菌液添加到LB液体培养基(含100mg/L Kan和100mg/L Rif)中，并在28℃恒温摇床上以200rpm振荡方式进行培养，以获得最佳的菌株生长环境。测定OD600为0.8-1.0左右，同时将Mcherry(核定位的一种marker)、P19(促进侵染效果)采用同样的步骤培养到OD600值为0.8-1.0左右根据目的基因、Mcherry和P19的农杆菌终浓度，计算出每个菌液的用量，将其转移到50mL离心管中，以5000rpm的速度离心10min，然后弃去上清液，保留菌体，并用含有乙酰丁香酮(AS)的1/2MS液体培养基进行重悬。
3)将经过预处理的洋葱内表皮放入预先配置的侵染液中，持续15min，并定期搅拌，以提高浸渍效果。然后，使用无菌滤纸将浸渍液清除，并将其放置于含有AS的1/2MS固态培养基上，以28℃的温度持续16h(全程在超净工作台上操作)。
4)在AUTO2显微镜下，先将洋葱表皮浸入1/2MS液体培养基，然后在无菌水中进行清洗，最后把表皮摊开，放在一块洁净的载玻片上，并在上面撒上一层膜，以便排出气泡，最终观察到目标蛋白在亚细胞层面的定位。
结果显示MdBBX25-GFP定位于细胞核，参见图3，比例尺为125μm。
实施例6瞬时转化苹果果实的表型、石蜡切片及生理数据测定
(一)苹果果实表型拍照
将四个试验组的苹果果实分别置于小型摄影棚中，用摄像机对准注射孔进行拍照。
结果表明：pSuper1300苹果果实的果色加深速度大于MdBBX25-pSuper1300果实，MdBBX25-pSuper1300果实的成熟进程较慢，参见见图4中的A；pTRV苹果果实的果色加深速度小于MdBBX25-pTRV果实，MdBBX25-pTRV果实的成熟进程较快，参见图7中的A。
(二)苹果果实石蜡切片观察
1)每隔四天取1cm3各试验组苹果果肉组织于FAA固定液中，并在-0.8kg/cm压强下进行抽真空处理两次。
2)将各试验组已抽真空处理过的石蜡切片样品进行脱水处理，依次用30％，50％，70％，80％，95％，100％，100％的酒精进行脱水处理，每次处理时间为2h。
3)随后将经上述处理的样品放入100％酒精：二甲苯＝1:1，二甲苯，二甲苯中进行脱酒精处理，每次2～3h。
4)将经上述处理的样品放入二甲苯：石蜡＝1:1，在37℃培养箱中放置2天，随后将其放入65℃培养箱中至石蜡溶解，再将样品放入100％石蜡中静置1～2天。
5)随后用石蜡包埋机(HistoCore Arcadia H 220-240VAC 50HZ 10A max)将样品置于含有65℃石蜡的包埋板中，再用全自动组织包埋机冷台(HistoCore Arcadia C220-240VAC 50HZ 5A max)将包埋板中的石蜡凝聚。随后进行切片操作，先将包埋板中的石蜡包埋块取出，然后用莱卡切片机(Leica RM2245)切成8～10um厚的石蜡切片，将切片在40℃摊片槽(Leica HI1210)的蒸馏水中放置10min，随后用载玻片将切片捞出，放置在40℃的烘片机(Leica HI1220)上进行烘片。
6)随后进行染色和封片，将带有切片的载玻片依次在二甲苯，二甲苯，100％酒精：二甲苯＝1:1，100％，100％，95％，80％，70％，50％，30％酒精，蒸馏水，蒸馏水，进行梯度脱蜡、复水，每次处理5min。随后在0.02％甲苯胺蓝中染色5min，然后依次在蒸馏水，蒸馏水，30％，50％，70％，80％，95％，100％，100％酒精脱水处理，每次处理5min。随后在100％酒精：二甲苯＝1:1，二甲苯，二甲苯中脱酒精，每次处理5min。然后在载玻片上加入加拿大树胶(不宜太多)，之后迅速用盖玻片封片，通风橱晾干后，正置荧光显微镜下观察。
结果表明：pSuper1300苹果果实的果肉组织细胞的疏松程度大于MdBBX25-pSuper1300，MdBBX25-pSuper1300果实细胞壁的降解速度较慢，参见图4中的B；MdBBX25-pTRV苹果果实的果肉组织细胞的疏松程度大于pTRV，MdBBX25-pTRV果实细胞壁的降解速度较快，参见图7中的B。
(三)苹果果实硬度、乙烯释放速率和呼吸速率的测定
1)果实硬度的测定：使用CT3质构分析仪(Brookfield，USA)对4个试验组的苹果果实进行硬度测定(10mm直径探头)。选取果实赤道部4个注射点旁1cm处去皮1mm后进行测定，测量速度为1mm·s-1，深度为10mm。每个试验组选取5个果实作为重复，每隔4d进行1次测定。
2)果实乙烯释放速率的测定：从4个试验组的苹果果实中各取5个果实，每个果实单独放入1L烧杯中，并用保鲜膜封口，每个容器保持静止状态1小时，然后从中抽取三针1mL的气体样本，并将其注入GC-2010气相色谱仪中进行乙烯释放速率的测定。
3)果实呼吸速率的测定：从4个试验组的苹果果实中各取5个果实，每个果实单独放入1L烧杯中，并用保鲜膜封口，每个容器保持静止状态1小时，然后使用CAMBO580CO2分析仪测量果实的呼吸速率。计算公式：呼吸速率＝(C1－C0)/W·t，式中C1表示测量时CO2释放量(mg)，C0表示初始测量时的CO2释放量(mg)，W表示鲜果的重量(kg)，t表示测量的时间(h)。
在整个贮藏期间，与pSuper1300果实相比，MdBBX25-pSuper1300果实的成熟进程较慢，参见图4；与pTRV果实相比，MdBBX25-pTRV果实的成熟进程较快，参见图7。相应地，各试验组的果实在贮藏过程中硬度都有所下降，但与各自空载体果实相比，MdBBX25-pSuper1300果实的软化速度明显较慢，参见图5中的A；而MdBBX25-pTRV果实的软化速度明显较快，参见图8中的A。此外，与各自空载体果实相比，MdBBX25-pSuper1300果实的乙烯产生速率显著降低，参见图5中的B，呼吸速率显著降低，参见图5中的C；MdBBX25-pTRV果实的乙烯产生速率显著升高，参见图8中的B，呼吸速率显著升高，参见图8中的C。
实施例7瞬时转化苹果果实与软化相关基因的表达量
1)将4个试验组不同贮藏期的苹果果肉分别取样，液氮中迅速固定。分别提取上述不同组别不同贮藏期果肉的总RNA，并反转录为cDNA，方法同实施例1中的步骤(一)。
2)MdBBX25基因的特异引物序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18。在MdACO，MdACS-1，MdXTHB，MdPG，MdEXPA8，MdCEL基因的非保守区设计特异引物，序列如下：
MdACO-qRT-F:GGCTACACACAGAGCATACAA(SEQ ID NO.25)；
MdACO-qRT-R:GCTGCCACCATTTCCTTAAAC(SEQ ID NO.26)；
MdACS-1-qRT-F:CTGGAAGAAGCCTACCAAGAAG(SEQ ID NO.27)；
MdACS-1-qRT-R:CCATGTCGTCGTTGGAGTAAA(SEQ ID NO.28)；
MdXTHB-qRT-F:GACCGAGTCAGATACCCTTCTA(SEQ ID NO.29)；
MdXTHB-qRT-R:CTGAGTACGTGTCATCTTCTTCTC(SEQ ID NO.30)；
MdPG-qRT-F:CACAGTTGTTGTGGTCATTTGT(SEQ ID NO.31)；
MdPG-qRT-R:CCTTCTATGGTGTCCGTGTATG(SEQ ID NO.32)；
MdEXPA8-qRT-F:CCTCATCCTCTCTCTCCTTAGT(SEQ ID NO.33)；
MdEXPA8-qRT-R:TGGCTGTACAAGTTCCCATATC(SEQ ID NO.34)；
MdCEL-qRT-F:GGGATCCAAGGACCTTTCTATG(SEQ ID NO.35)；
MdCEL-qRT-R:CGGATGAGCTCTGGAGAATTT(SEQ ID NO.36)；
3)用步骤(1)中所得的cDNA为模板，用苹果内参引物MdActin-F(SEQ ID NO.23)和MdActin-R(SEQ ID NO.24)调整这些cDNA模板，使各cDNA模板浓度一致。
4)用浓度一致的cDNA模板进行qRT-PCR，检测MdACO、MdACS-1、MdXTHB、MdPG、MdEXPA8、MdCEL、MdBBX25基因在不同试验组不同贮藏期果实中的表达差异。
结果发现，MdBBX25-pSuper1300果实中MdBBX25的表达量显著高于对照果实(空载体pSuper1300)，参图6中的G；而MdBBX25-pSuper1300果实中乙烯相关基因(MdACO和MdACS-1)的表达量下调，参见图6中的A和图6中的B，细胞壁相关基因(MdPG、MdCEL、MdEXPA8和MdXTHB)的表达量也下调，参见图6中的C、图6中的D、图6中的E和图6中的F，这进一步支持了上述基因与MdBBX25的负相关表达。与对照果实(空载体pTRV)相比，MdBBX25在MdBBX25-pTRV果实中的表达显著降低，参图9中的G，而在MdBBX25-pTRV果实中，与乙烯相关的基因(MdACO和MdACS-1)上调，参见图9中的A和图9中的B，和细胞壁相关的基因(MdPG、MdCEL、MdEXPA8和MdXTHB)显著上调，参见图9中的C、图9中的D、图9中的E和图9中的F。这些结果充分表明，MdBBX25在果实贮藏过程中对细胞壁降解和乙烯产生起负调控作用，且MdBBX25是通过抑制乙烯生物合成和细胞壁降解而起到果实软化的负调控作用。
根据上述技术，从苹果中分离到了一个BBX基因MdBBX25，通过在苹果瞬时注射实验的功能验证和生理表型测定中可以看出：MdBBX25在抑制苹果果实软化中有明显作用。MdBBX25基因的发掘为苹果果实内在品质的改善提供依据，对提高苹果品质具有重要的经济效益和社会效益。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种如核苷酸序列表SEQ ID NO.1所示的功能基因在延缓采后苹果果实软化品质改善的应用，其特征在于：将核苷酸序列表SEQ ID No.1所示的功能基因克隆到过表达载体，所述功能基因的过表达抑制苹果中乙烯生物合成和细胞壁降解，延缓苹果果实的硬度下降、减缓成熟衰老进程，实现延缓采后苹果果实软化。
2.根据权利要求1所述一种如核苷酸序列表SEQ ID NO.1所示的功能基因在延缓采后苹果果实软化品质改善的应用，其特征在于：所述过表达载体为pSuper1300。
3.根据权利要求1所述一种如核苷酸序列表SEQ ID NO.1所示的功能基因在延缓采后苹果果实软化品质改善的应用，其特征在于：利用基因工程手段将核苷酸序列表SEQIDNo.1所示的功能基因导入耐贮性较差的苹果品种使其增强耐贮性的应用。
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