CN114990041A - 一种产3-羟基丙酸的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种产3-羟基丙酸的基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种产3‑羟基丙酸的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域；本发明中，利用基因工程和合成生物学技术，通过在大肠杆菌中协同表达了乙醇脱氢酶AdhP和琥珀酸半醛脱氢酶GabD4，并在此基础上通过辅酶工程调控NADH氧化酶来提高辅酶NAD+循环供应，得到了重组的基因工程；所述基因工程菌能够以1,3‑丙二醇为底物，在乙醇脱氢酶的作用下生成3‑羟基丙醛，然后经醛脱氢酶转化为3‑羟基丙酸；所述基因工程菌在没有维生素B12的有氧条件下完成了细胞内辅酶自给自足，实现3‑羟基丙酸的有效生产。

Description

一种产3-羟基丙酸的基因工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种产3-羟基丙酸的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
3-羟基丙酸是一种重要的生物基平台化合物，作为生物可降解性聚合物的前体物质和食品添加剂广泛使用。3-羟基丙酸的生产有化学合成法和生物法两种。化学法多以不可再生资源作为原料，其生产过程能耗大，产物副产物多难以分离纯化，生产过程产生不可估量的环境污染。生物法合成3-羟基丙酸多以葡萄糖和甘油作为底物，其中以甘油作为底物生产3-羟基丙酸因其步骤简单，原料廉价，备受瞩目。但是，生物法合成3-羟基丙酸时，会产生毒性中间代谢物3-羟基丙醛，毒性中间代谢物3-羟基丙醛积累、昂贵的辅酶B12供应不足等问题限制了生物法合成3-羟基丙酸的大规模生产。
发明内容
针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种产3-羟基丙酸的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明中，利用基因工程和合成生物学技术，通过在大肠杆菌中协同表达了乙醇脱氢酶AdhP和琥珀酸半醛脱氢酶GabD4，并在此基础上通过辅酶工程调控NADH氧化酶来提高辅酶NAD+循环供应，得到了重组的基因工程；所述基因工程菌能够以1,3-丙二醇为底物，在乙醇脱氢酶的作用下生成3-羟基丙醛，然后经醛脱氢酶转化为3-羟基丙酸；所述基因工程菌在没有维生素B12的有氧条件下完成了细胞内辅酶自给自足，实现3-羟基丙酸的有效生产。
本发明中首先提供了一种产3-羟基丙酸的基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌的构建：
PCR扩增来源于盐单胞菌的乙醇脱氢酶AdhP的基因片段，然后使用无缝克隆技术连接至pCDFDuet-1质粒中，获得表达AdhP的重组质粒；
PCR扩增来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的琥珀酸半醛脱氢酶GabD4的基因片段，然后使用无缝克隆技术连接到表达AdhP的重组质粒中，得到协同表达AdhP和GabD4的重组质粒；
将协同表达AdhP和GabD4的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(STAR)中，然后筛选阳性克隆以及测序成功获得协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌；
(2)产3-羟基丙酸的基因工程菌的构建：
PCR扩增来源于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的NADH氧化酶NOX的基因片段，然后使用无缝克隆技术连接到pETDuet-1质粒中，获得表达NOX的重组质粒；
将表达NOX的重组质粒转入步骤(1)中得到的协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌中，然后筛选阳性克隆以及测序成功获得产3-羟基丙酸的基因工程菌。
其中，步骤(1)中，编码AdhP的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQID No:2所示；
编码GabD4的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；
步骤(2)中，编码NOX的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
步骤(1)和(2)中，PCR反应参数均为：预变性98℃2min；变性98℃15s；退火55℃10s；延伸72℃2min；终延伸72℃5min，33个循环。
本发明中还提供了上述方法构建的产3-羟基丙酸的基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株，先协同表达了乙醇脱氢酶AdhP和琥珀酸半醛脱氢酶GabD4，然后再表达了NADH氧化酶NOX基因。
本发明中还提供了上述产3-羟基丙酸的基因工程菌在转化1,3-丙二醇生产3-羟基丙酸中的应用。
本发明中还提供了一种生产3-羟基丙酸的方法，所述方法为利用上述产3-羟基丙酸的基因工程菌的静息细胞转化1,3-丙二醇生产3-羟基丙酸。
具体的，所述应用为：将产3-羟基丙酸的基因工程菌的静息细胞接种至1,3-丙二醇中，在pH值为5～9、温度25～35℃、转速120～220rpm的条件下发酵生产3-羟基丙酸。
其中，产3-羟基丙酸的基因工程菌的静息细胞的接种量为15～25g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明中，通过乙醇脱氢酶AdhP和琥珀酸半醛脱氢酶GabD4，获得可转化1,3-丙二醇生成3-羟基丙酸的基因工程菌，然后通过辅因子工程技术表达NADH氧化酶NOX促进辅因子循环再生，进而促进3-羟基丙酸的深入合成，实现利用1,3-丙二醇生产3-羟基丙酸的高效转化。
本发明中，将辅因子工程运用于生物合成，表达NADH氧化酶NOX来提高辅酶NAD+和NADH循环供应，具有重要的理论和实践意义，促进3-羟基丙酸的高效生产。本发明中，摒弃了传统3-羟基丙酸的生产方法，首次以1,3-丙二醇为底物，通过协同表达构建3-羟基丙酸合成途径，并运用辅酶工程策略实现胞内辅酶自给自足，具有重要的理论和实践意义，所构建的产3-羟基丙酸的基因工程菌可高效转化1,3-丙二醇生产3-羟基丙酸，初步具有工业生产的潜力。
附图说明
图1为基因adhP的电泳图。
图2为基因gabD4的电泳图。
图3为基因nox的电泳图。
图4为基因工程菌FJ001和FJ002的3-羟基丙酸产量图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。下列实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。实施例中，肠杆菌E.coli BL21(STAR)、E.coli DH5α购自优宝生物科技有限公司，pCDFCDuet-1质粒、pETDuet-1质粒购自淼灵生物科技公司。
实施例1：乙醇脱氢酶(AdhP)重组质粒的构建
(1)根据盐单胞菌乙醇脱氢酶基因adhP及pCDFDuet1质粒序列特征，利用Oligo7.0软件设计引物。其中，所述编码乙醇脱氢酶基因adhP的核苷酸序列如SEQ ID No:1，所示乙醇脱氢酶基因adhP的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，设计引物序列如下：
AdhP F：ataattttgtttaactttaataaggagatatacATGCGCGCGGCGGTGGTG(SEQ ID No:7)；
AdhP R：tatgcggccgcaagcttgTTAGCTCGCCATATCCAGCACAATGCGGCC(SEQ ID No:8)。
(2)使用得到的AdhP F/AdhP R引物对PCR扩增adhP基因，PCR反应参数：预变性，98℃3min；变性，98℃10s；退火，55℃10s；延伸，72℃1.5min；终延伸，72℃5min；33个循环后得到adhP基因片段。图1为基因adhP的电泳图，从图中可以看出，成功获得adhP基因。
(3)将pCDFDuet1质粒使用NcoI和SalI在37℃下双酶切反应30min，反应结束后获得线性化pCDFDuet1质粒骨架。
(4)将上述得到的adhP基因片段和线性化pCDFDuet1质粒骨架使用2×MultiFSeamless Assembly Mix在50℃下吉布森组装30min，获得表达AdhP的重组质粒。将得到的表达AdhP的重组质粒通过标准热激法转化进入E.coli DH5α感受态中，所述标准热激法的步骤为：
将E.coli DH5α感受态冰浴5min后加入表达AdhP的重组质粒，冰浴30min，然后在42℃下热激45s，热激结束后继续冰浴2min，然后加入1mL无抗生素LB培养基(酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L和氯化钠10g/L)，在37℃下培养1h后涂布至含有50μg/mL壮观霉素的LB平板上。
挑取培养后的适量单菌落培养并提取重组质粒，送至苏州金唯智测序验证，将验证正确的重组质粒命名为pCDF-AdhP，其中adhP基因表达由T7启动子驱动，pCDF-AdhP的序列如SEQ ID No:9所示。
实施例2：协同表达乙醇脱氢酶(AdhP)和琥珀酸半醛脱氢酶(GabD4)重组质粒的构建
(1)根据钩虫贪铜菌琥珀酸半醛脱氢酶GabD4的基因gabD4和重组质粒pCDF-AdhP的序列特征，利用Oligo7.0软件设计引物。其中，所述gabD4的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
设计引物序列如下：
GabD4 F：agttaagtataagaaggagatatacatatGTACCAAGATCTGGCACT(SEQ ID No:10)；
GabD4 R：cggtggcagcagcctaggTTACGCTTGGGTGATGAACT(SEQ ID No:11)；
pCDF-AdhP F：atgtatatctccttcttatacttaact(SEQ ID No:12)；
pCDF-AdhP R：cctaggctgctgccaccg(SEQ ID No:13)。
(2)分别使用GabD4 F/GabD4 R引物对来PCR扩增gabD4基因。其中，PCR反应参数：预变性，98℃3min；变性，98℃10s；退火，55℃10s；延伸，72℃1.5min；终延伸，72℃5min；33个循环后得到gabD4基因。图2为基因gabD4的电泳图，从图中可以看出，已成功获得gabD4基因。
(3)使用pCDF-AdhP F/pCDF-AdhP R引物对扩增pCDFDuet1载体骨架，PCR反应参数：预变性，98℃1min；变性，98℃10s；退火，55℃10s；延伸，72℃30s；终止延伸，72℃5min；32个循环后得到pCDF-AdhP载体骨架。
(4)将上述得到的gabD4基因和线性化pCDF-AdhP质粒骨架在50℃下吉布森组装30min，得到协同表达AdhP和GabD4的重组质粒，然后通过标准热激法将上述得到的重组质粒转化进入E.coli DH5α感受态中，转化步骤具体如下所示：
将E.coli DH5α感受态冰浴5min后加入协同表达AdhP和GabD4的重组质粒，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入1mL无抗生素LB培养基，37℃培养1h后涂布含有50μg/mL壮观霉素的LB平板。
最后，挑取适量单菌落培养并提取协同表达AdhP和GabD4的重组质粒，送苏州金唯智测序验证，将验证正确的协同表达AdhP和GabD4的重组质粒命名为pCDF-AdhP-GabD4，其中GabD4酶的基因片段gabD4的表达由各自的T7启动子驱动，pCDF-AdhP-GabD4的序列如SEQID No:14所示。
实施例3：协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌的构建
将实施例2中得到的重组质粒pCDF-AdhP-GabD4通过标准热激法转化进入E.coliBL21(STAR)感受态中，转化步骤具体如下所示：
将E.coli BL21(STAR)感受态冰浴5min后加入重组质粒pCDF-AdhP-GabD4，冰浴30min，然后42℃热激45s，热激结束后冰浴2min，接着加入1mL无抗生素LB培养基，37℃培养1h后涂布至含有50μg/mL壮观霉素的LB平板上，获得协同表达乙醇脱氢酶(AdhP)和琥珀酸半醛脱氢酶(GabD4)的基因工程菌，命名为FJ001。
本实施例中还考察了上述得到的基因工程菌FJ001以1,3-丙二醇为底物生成3-羟基丙酸的能力，具体考察步骤如下所示：
将基因工程菌FJ001在37℃、220rpm摇床培养至OD600为0.4-0.6之间，然后加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在25℃、120rpm的条件下过夜诱导目标蛋白AdhP和GabD4表达，然后离心收集菌体，离心条件为在4℃下8000rpm离心5min。将收集到的菌体经0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)洗涤2次，得到基因工程大肠杆菌FJ001静息细胞。
向FJ001静息细胞中加入1,3-丙二醇20g/L，在30℃、150rpm的条件下摇瓶转化6h，间隔1h取样。采用高效液相色谱法测定其中3-羟基丙酸和1,3-丙二醇浓度，其测定条件为：Aminex HPX-87H(300×7.8mm)色谱柱，示差折光检测器，流速0.6mL/min，柱温65℃，测定结果如图4所示。
图4为基因工程菌FJ001的3-羟基丙酸产量图，从图中可以看出，协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌FJ001转化1,3-丙二醇在6h内可生成0.637g/L的3-羟基丙酸，以1,3-丙二醇为底物生成3-羟基丙酸的可行性得到了有效验证。
实施例4：NADH氧化酶(NOX)重组质粒的构建
(1)根据植物乳杆菌NADH氧化酶NOX基因nox及pETDuet1质粒序列特征，利用Oligo7.0软件设计引物。其中，所述NOX的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，编码NOX的核苷酸序列如SEQ ID No:5，所示涉及的引物序列如下所示：
NOX F：ccacagccaggatccgATGAAAGTTATTGTAATTGGTTGT(SEQ ID No:15)；
NOX R：agcattatgcggccgcTTATTCAGTGACAGCTTCG(SEQ ID No:16)；
pET F：cggatcctggctgtgg(SEQ ID No:17)；
pET R：gcggccgcataatgct(SEQ ID No:18)。
(2)使用NOX F/NOX R引物对扩增nox基因，，PCR反应参数：预变性，98℃3min；变性，98℃10s；退火，55℃10s；延伸，72℃1.5min；终延伸，72℃5min；33个循环后得到nox基因。
图3为基因nox的电泳图，从图中可以看出，已成功获得nox基因。
(3)使用pET F/pET R引物对扩增pCDFDuet1载体骨架，PCR反应参数：预变性，98℃1min；变性，98℃10s；退火，55℃10s；延伸，72℃30s；终止延伸，72℃5min；32个循环后得到pETDuet1载体骨架。
(4)将上述得到的nox基因和线性化pETDuet1质粒骨架使用2×MultiF SeamlessAssembly Mix在50℃下吉布森组装30min，获得表达NOX的重组质粒；然后通过标准热激法将表达NOX的重组质粒转化进入E.coli DH5α感受态中，转化步骤具体如下所示：
将E.coli DH5α感受态冰浴5min后加入表达NOX的重组质粒，冰浴30min，然后42℃热激45s，热激结束后冰浴2min，接着加入1mL无抗生素LB培养基，37℃培养1h后涂布至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。
然后挑取适量单菌落培养并提取表达NOX的重组质粒，送至苏州金唯智测序验证，将验证正确的表达NOX的重组质粒命名为pET-NOX，其中nox基因表达由T7启动子驱动，pET-NOX的序列如SEQ ID No:19所示。
实施例5：产3-羟基丙酸的基因工程菌的构建
本实施例中将辅因子工程运用于生物合成，通过表达NADH氧化酶NOX来提高辅酶NAD+和NADH循环供应构建了产3-羟基丙酸的基因工程菌，所示基因工程菌的构建方法如下所示：
通过标准热激法将实施例4中得到的表达NOX的重组质粒pET-NOX转化进入实施例3中得到的协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌FJ001的感受态中，具体步骤如下所示：
将FJ001感受态冰浴5min后加入重组质粒pET-NOX，冰浴30min，然后42℃热激45s，热激结束后冰浴2min，接着加入1mL无抗生素LB培养基，37℃培养1h后涂布至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，获得产3-羟基丙酸的基因工程菌，命名为FJ002。
本实施例中还考察了上述得到的基因工程菌FJ002以1,3-丙二醇为底物生成3-羟基丙酸的能力，具体考察步骤如下所示：
将基因工程菌FJ002在37℃、220rpm摇床培养至OD600为0.4-0.6之间，然后加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在25℃、120rpm的条件下过夜诱导目标蛋白AdhP、GabD4和NOX表达，然后离心收集菌体，离心条件为在4℃下8000rpm离心5min。将收集到的菌体经0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)洗涤2次，得到基因工程大肠杆菌FJ002静息细胞。
向FJ002静息细胞中加入1,3-丙二醇15～25g/L，在25～35℃、120～220rpm的条件下摇瓶转化6h，间隔1h取样。采用高效液相色谱法测定其中3-羟基丙酸和1,3-丙二醇浓度，其测定条件为：Aminex HPX-87H(300×7.8mm)色谱柱，示差折光检测器，流速0.6mL/min，柱温65℃，测定结果如图4所示。
从图4中可以看出，表达NOX的基因工程菌FJ002生物转化1,3-丙二醇生成3-羟基丙酸的能力得到有效改善，可在6h产生1.154g/L的3-羟基丙酸，产量相较于基因工程菌FJ001提高了约81％。以上结果表明，表达NOX可以有效氧化NADH再生NAD+，提高催化效率。
综上所述，本发明中所构建的基因工程菌可以通过静息细胞法，以1,3-丙二醇为底物，有效生产3-羟基丙酸。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种产3-羟基丙酸的基因工程菌及其构建方法和应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1017
<212> DNA
<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)
<400> 1
atgcgcgcgg cggtggtgcg cgaatttggt cagccgctga ccattgaaga agtgagcgtg 60
ccgcgcccga aacgcggcga agtgctgatg aaagtggcgg cgagcggcgt gtgccatacc 120
gatctgcatg cggcgcatgg cgattggccg gtgaaaccga gcccgccgtt tattccgggc 180
catgaaggcg tgggccatat tgtggcggtg ggcgaaggcg tgagccatgt gaaagaaggc 240
gatcgcattg gcgtgccgtg gctgtatagc gcgtgcggct attgcgaaca ttgcctgggc 300
ggctgggaaa ccctgtgcga aagtcagcag aacaccggct atagcgtgaa cggcggcttt 360
gcggattata ccctggcgga tgcgggctat gtgggccgcc tgccggatgc ggtggatttt 420
attgaaattg cgccggtgct gtgcgcgggc gtgaccgtgt ataaaggcct gaaaatgacc 480
gatacccgcc cgggtcagtg ggtggtgatt agcggcgtgg gcggcctggg ccatatggcg 540
gtgcagtatg cgaaagcgat gggcctgaac gtggcggcgg tggatattga tgatggcaaa 600
ctggcgctgg cggaacgcct gggcgcgacc gtgaccgtga acgcgatgaa aaccgatccg 660
gcggcgtatc tgaaaaaaac cattggcggc gcgcatggcg cgctggtgac cgcggtgagc 720
ccgaaagcgt ttgatcaagc gcagaacatg ttacgccgcg gtggcacgct ggtgctgaac 780
ggcctgccgc cgggcgattt tccgctgccg atttttagca ccgtgttaaa cggcattacc 840
attcgcggca gcattgtggg cacccgcagc gatctgcaag aagcgctgga ttttgcggcg 900
gaaggcaaag tgaaagcgac cgtggcgacc gataccctgg ataacattaa cgatgtgttt 960
cagcgcatga ttgatggcaa aattgaaggc cgcattgtgc tggatatggc gagctaa 1017
<210> 2
<211> 338
<212> PRT
<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)
<400> 2
Met Arg Ala Ala Val Val Arg Glu Phe Gly Gln Pro Leu Thr Ile Glu
1 5 10 15
Glu Val Ser Val Pro Arg Pro Lys Arg Gly Glu Val Leu Met Lys Val
20 25 30
Ala Ala Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala Ala His Gly Asp
35 40 45
Trp Pro Val Lys Pro Ser Pro Pro Phe Ile Pro Gly His Glu Gly Val
50 55 60
Gly His Ile Val Ala Val Gly Glu Gly Val Ser His Val Lys Glu Gly
65 70 75 80
Asp Arg Ile Gly Val Pro Trp Leu Tyr Ser Ala Cys Gly Tyr Cys Glu
85 90 95
His Cys Leu Gly Gly Trp Glu Thr Leu Cys Glu Ser Gln Gln Asn Thr
100 105 110
Gly Tyr Ser Val Asn Gly Gly Phe Ala Asp Tyr Thr Leu Ala Asp Ala
115 120 125
Gly Tyr Val Gly Arg Leu Pro Asp Ala Val Asp Phe Ile Glu Ile Ala
130 135 140
Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Lys Gly Leu Lys Met Thr
145 150 155 160
Asp Thr Arg Pro Gly Gln Trp Val Val Ile Ser Gly Val Gly Gly Leu
165 170 175
Gly His Met Ala Val Gln Tyr Ala Lys Ala Met Gly Leu Asn Val Ala
180 185 190
Ala Val Asp Ile Asp Asp Gly Lys Leu Ala Leu Ala Glu Arg Leu Gly
195 200 205
Ala Thr Val Thr Val Asn Ala Met Lys Thr Asp Pro Ala Ala Tyr Leu
210 215 220
Lys Lys Thr Ile Gly Gly Ala His Gly Ala Leu Val Thr Ala Val Ser
225 230 235 240
Pro Lys Ala Phe Asp Gln Ala Gln Asn Met Leu Arg Arg Gly Gly Thr
245 250 255
Leu Val Leu Asn Gly Leu Pro Pro Gly Asp Phe Pro Leu Pro Ile Phe
260 265 270
Ser Thr Val Leu Asn Gly Ile Thr Ile Arg Gly Ser Ile Val Gly Thr
275 280 285
Arg Ser Asp Leu Gln Glu Ala Leu Asp Phe Ala Ala Glu Gly Lys Val
290 295 300
Lys Ala Thr Val Ala Thr Asp Thr Leu Asp Asn Ile Asn Asp Val Phe
305 310 315 320
Gln Arg Met Ile Asp Gly Lys Ile Glu Gly Arg Ile Val Leu Asp Met
325 330 335
Ala Ser
<210> 3
<211> 1426
<212> DNA
<213> 钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)
<400> 3
gtaccaagat ctggcactgt atatcgacgg cgaattcatt aaaggcggtg atcgtcgtga 60
gcaggatgtg attaacccgg ctacccagga agtgctgggc aaactgccgc acgcgtctcg 120
cgcggacctg gaccgtgccc tggctgctgc gcagcgtgct tttgaaactt ggaagaaaac 180
ctctcctctg gaacgtgcgc gtattctgcg tcgcgttggt gaactgactc gtgaacgcgc 240
aaaggaaatt ggtcgtaaca tcacgctgga ccagggcaaa ccgctggcgg aagctgtggg 300
cgaagttatg gtttgcgctg agcacgcgga ctggcacgct gaagagtgcc gtcgtattta 360
tggccgtgtt atccctccac gccagcctaa cgtacgccag atcgttgttc gtgagccgat 420
tggtgtttgc gctgctttca ctccgtggaa ctttccgttt aaccaagcga tccgtaaaat 480
tgtcagcgca ctgggcgctg gttgtacgct gattctgaaa ggcccggaag actctccatc 540
cgcggttgtg gcactggctc agctgttcca tgatgcaggc ctgccgccgg gcgttctgaa 600
catcgtgtgg ggcgtaccgt ctgaggtgtc tacctacctg atcgaatctc caatcgttcg 660
caagatctcc ttcaccggta gcgtaccggt gggcaaacag ctggccgcgc tggcgggtgc 720
acatatgaaa cgtgtaacca tggagctggg tggtcatagc ccggtgctgg tctttgatga 780
tgccgatatc gatccggctg cggaaatgct ggcgcgtttc aaactgcgta acgcgggtca 840
ggtatgtgtg agcccgaccc gtttttatgt gcaggaaaaa gcttacgacc gtttcctggc 900
ccgcttcacc gaagtgattg gcagcatcaa agttggtaac ggcctggaag acggtacgca 960
gatgggcccg ctggcacatg aacgtcgtgt cctgtctatg gagcagttcc tggatgatgc 1020
gagccagcgc ggtggtaaag tggtagctgg tggttcccgt ctgggcgaca aaggttactt 1080
cttcgcaccg actgttgtaa ctgatctgcc agacgacagc cgtctgatga ctgatgaacc 1140
gttcggtccg gtggctcctg tgacccgttt taaagacacc gcggaagttc tgcgtcgtgc 1200
gaattctctg ccatttggtc tggcgtctta tgttttcacc aactctctga aaactgccac 1260
cgaggtatcc aatggcctgg aagctggcat ggtgaacatt aaccactttg gcatggctct 1320
ggccgaaact cctttcggtg gcatcaagga tagcggtatc ggctccgaag gtggtcagga 1380
aaccttcgac ggttatctgg ttaccaagtt catcacccaa gcgtaa 1426
<210> 4
<211> 475
<212> PRT
<213> 钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)
<400> 4
Met Tyr Gln Asp Leu Ala Leu Tyr Ile Asp Gly Glu Phe Ile Lys Gly
1 5 10 15
Gly Asp Arg Arg Glu Gln Asp Val Ile Asn Pro Ala Thr Gln Glu Val
20 25 30
Leu Gly Lys Leu Pro His Ala Ser Arg Ala Asp Leu Asp Arg Ala Leu
35 40 45
Ala Ala Ala Gln Arg Ala Phe Glu Thr Trp Lys Lys Thr Ser Pro Leu
50 55 60
Glu Arg Ala Arg Ile Leu Arg Arg Val Gly Glu Leu Thr Arg Glu Arg
65 70 75 80
Ala Lys Glu Ile Gly Arg Asn Ile Thr Leu Asp Gln Gly Lys Pro Leu
85 90 95
Ala Glu Ala Val Gly Glu Val Met Val Cys Ala Glu His Ala Asp Trp
100 105 110
His Ala Glu Glu Cys Arg Arg Ile Tyr Gly Arg Val Ile Pro Pro Arg
115 120 125
Gln Pro Asn Val Arg Gln Ile Val Val Arg Glu Pro Ile Gly Val Cys
130 135 140
Ala Ala Phe Thr Pro Trp Asn Phe Pro Phe Asn Gln Ala Ile Arg Lys
145 150 155 160
Ile Val Ser Ala Leu Gly Ala Gly Cys Thr Leu Ile Leu Lys Gly Pro
165 170 175
Glu Asp Ser Pro Ser Ala Val Val Ala Leu Ala Gln Leu Phe His Asp
180 185 190
Ala Gly Leu Pro Pro Gly Val Leu Asn Ile Val Trp Gly Val Pro Ser
195 200 205
Glu Val Ser Thr Tyr Leu Ile Glu Ser Pro Ile Val Arg Lys Ile Ser
210 215 220
Phe Thr Gly Ser Val Pro Val Gly Lys Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly
225 230 235 240
Ala His Met Lys Arg Val Thr Met Glu Leu Gly Gly His Ser Pro Val
245 250 255
Leu Val Phe Asp Asp Ala Asp Ile Asp Pro Ala Ala Glu Met Leu Ala
260 265 270
Arg Phe Lys Leu Arg Asn Ala Gly Gln Val Cys Val Ser Pro Thr Arg
275 280 285
Phe Tyr Val Gln Glu Lys Ala Tyr Asp Arg Phe Leu Ala Arg Phe Thr
290 295 300
Glu Val Ile Gly Ser Ile Lys Val Gly Asn Gly Leu Glu Asp Gly Thr
305 310 315 320
Gln Met Gly Pro Leu Ala His Glu Arg Arg Val Leu Ser Met Glu Gln
325 330 335
Phe Leu Asp Asp Ala Ser Gln Arg Gly Gly Lys Val Val Ala Gly Gly
340 345 350
Ser Arg Leu Gly Asp Lys Gly Tyr Phe Phe Ala Pro Thr Val Val Thr
355 360 365
Asp Leu Pro Asp Asp Ser Arg Leu Met Thr Asp Glu Pro Phe Gly Pro
370 375 380
Val Ala Pro Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Ala Glu Val Leu Arg Arg
385 390 395 400
Ala Asn Ser Leu Pro Phe Gly Leu Ala Ser Tyr Val Phe Thr Asn Ser
405 410 415
Leu Lys Thr Ala Thr Glu Val Ser Asn Gly Leu Glu Ala Gly Met Val
420 425 430
Asn Ile Asn His Phe Gly Met Ala Leu Ala Glu Thr Pro Phe Gly Gly
435 440 445
Ile Lys Asp Ser Gly Ile Gly Ser Glu Gly Gly Gln Glu Thr Phe Asp
450 455 460
Gly Tyr Leu Val Thr Lys Phe Ile Thr Gln Ala
465 470 475
<210> 5
<211> 1353
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 5
atgaaagtta ttgtaattgg ttgtacccat gccggcactg ctgccgttaa tcagatttta 60
gcatcaaatc cagatactga agtgacgatt tatgaaagaa atgacaatgt ctcgttccta 120
tcctgtggga tcgcacttta ccttggcggc caagttgctg atcctcaagg cctattttat 180
tccagtcctg aacagttagc taagttaggc gcaactgttc atatgcaaca tgatgtgacg 240
gatgtgaata ctgacaaaca tgaaattacg gttactgatt taaagactgg tgaatctaag 300
actgatcact atgacaagtt agttgtcact actggttcat ggcctgttat tccaccaatt 360
gacggcatcg atagtcccaa tgtctactta tgcaagaact ggacgcacgc tcagaattta 420
tgggaagcag ccaaaccagc taagcgggtc attgtgatcg gtggcggtta tatcggtact 480
gaattagttg aagcttacca gaagcaaggt aaggaagtca cactaattga tggtttacca 540
cggattttaa ataaatactt agacaaagaa ttcactgacc gggttgaaca agactttgtt 600
gatcacggta tcaagatggc tttgaatcaa atggtgcaag gcttcagtga tgatggtaaa 660
gaagttacgg tcaagactga caagggcagc tacacagccg acatggcgat tctttgtgtt 720
ggcttccggc caaataccgg cttactcaag ggcaaggtcg atatgaacgc taatggctcg 780
atcaagacca atgactacat gcaaacttct gatccagaca tttacggggc tggtgactcg 840
gttgctgttc actataaccc aactaagaaa gatgcttata tcccattagc aacgaatgcg 900
gttcgccaag gaaccttagt tggtttgaac atcttcaagc caacgcggaa gtacatgggg 960
acacaatcaa cttctgggtt aatgttgttc ggccaaacca tcgtttcatc tgggatgacc 1020
ctagaacatg cacaggccga aaatgttccg gcagccgctg tcacttttga agacaactac 1080
cggccagaat ttatgccaac cactaagcct gttttaatgc aattggttta caatcctgaa 1140
actcgcgaaa tcctaggtgc acaattcatg agtgaacatg atgtttcgca atcagccaat 1200
gtgatttcag tgatgattca aaatcacaat accattgacg acttagggtt cgtagatatg 1260
ttcttccaac caatttacga ccggccattt aactatttga acttacttgg tcaagcagcg 1320
attgcccatg cggccgaagc tgtcactgaa taa 1353
<210> 6
<211> 450
<212> PRT
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 6
Met Lys Val Ile Val Ile Gly Cys Thr His Ala Gly Thr Ala Ala Val
1 5 10 15
Asn Gln Ile Leu Ala Ser Asn Pro Asp Thr Glu Val Thr Ile Tyr Glu
20 25 30
Arg Asn Asp Asn Val Ser Phe Leu Ser Cys Gly Ile Ala Leu Tyr Leu
35 40 45
Gly Gly Gln Val Ala Asp Pro Gln Gly Leu Phe Tyr Ser Ser Pro Glu
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Gln Leu Ala Lys Leu Gly Ala Thr Val His Met Gln His Asp Val Thr
65 70 75 80
Asp Val Asn Thr Asp Lys His Glu Ile Thr Val Thr Asp Leu Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ser Lys Thr Asp His Tyr Asp Lys Leu Val Val Thr Thr Gly
100 105 110
Ser Trp Pro Val Ile Pro Pro Ile Asp Gly Ile Asp Ser Pro Asn Val
115 120 125
Tyr Leu Cys Lys Asn Trp Thr His Ala Gln Asn Leu Trp Glu Ala Ala
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Lys Pro Ala Lys Arg Val Ile Val Ile Gly Gly Gly Tyr Ile Gly Thr
145 150 155 160
Glu Leu Val Glu Ala Tyr Gln Lys Gln Gly Lys Glu Val Thr Leu Ile
165 170 175
Asp Gly Leu Pro Arg Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Asp Lys Glu Phe Thr
180 185 190
Asp Arg Val Glu Gln Asp Phe Val Asp His Gly Ile Lys Met Ala Leu
195 200 205
Asn Gln Met Val Gln Gly Phe Ser Asp Asp Gly Lys Glu Val Thr Val
210 215 220
Lys Thr Asp Lys Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Met Ala Ile Leu Cys Val
225 230 235 240
Gly Phe Arg Pro Asn Thr Gly Leu Leu Lys Gly Lys Val Asp Met Asn
245 250 255
Ala Asn Gly Ser Ile Lys Thr Asn Asp Tyr Met Gln Thr Ser Asp Pro
260 265 270
Asp Ile Tyr Gly Ala Gly Asp Ser Val Ala Val His Tyr Asn Pro Thr
275 280 285
Lys Lys Asp Ala Tyr Ile Pro Leu Ala Thr Asn Ala Val Arg Gln Gly
290 295 300
Thr Leu Val Gly Leu Asn Ile Phe Lys Pro Thr Arg Lys Tyr Met Gly
305 310 315 320
Thr Gln Ser Thr Ser Gly Leu Met Leu Phe Gly Gln Thr Ile Val Ser
325 330 335
Ser Gly Met Thr Leu Glu His Ala Gln Ala Glu Asn Val Pro Ala Ala
340 345 350
Ala Val Thr Phe Glu Asp Asn Tyr Arg Pro Glu Phe Met Pro Thr Thr
355 360 365
Lys Pro Val Leu Met Gln Leu Val Tyr Asn Pro Glu Thr Arg Glu Ile
370 375 380
Leu Gly Ala Gln Phe Met Ser Glu His Asp Val Ser Gln Ser Ala Asn
385 390 395 400
Val Ile Ser Val Met Ile Gln Asn His Asn Thr Ile Asp Asp Leu Gly
405 410 415
Phe Val Asp Met Phe Phe Gln Pro Ile Tyr Asp Arg Pro Phe Asn Tyr
420 425 430
Leu Asn Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ile Ala His Ala Ala Glu Ala Val
435 440 445
Thr Glu
450
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ataattttgt ttaactttaa taaggagata tacatgcgcg cggcggtggt g 51
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tatgcggccg caagcttgtt agctcgccat atccagcaca atgcggcc 48
<210> 9
<211> 4726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatataca tgcgcgcggc ggtggtgcgc gaatttggtc agccgctgac cattgaagaa 120
gtgagcgtgc cgcgcccgaa acgcggcgaa gtgctgatga aagtggcggc gagcggcgtg 180
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tgcctgggcg gctgggaaac cctgtgcgaa agtcagcaga acaccggcta tagcgtgaac 420
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aaaatgaccg atacccgccc gggtcagtgg gtggtgatta gcggcgtggg cggcctgggc 600
catatggcgg tgcagtatgc gaaagcgatg ggcctgaacg tggcggcggt ggatattgat 660
gatggcaaac tggcgctggc ggaacgcctg ggcgcgaccg tgaccgtgaa cgcgatgaaa 720
accgatccgg cggcgtatct gaaaaaaacc attggcggcg cgcatggcgc gctggtgacc 780
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tttgcggcgg aaggcaaagt gaaagcgacc gtggcgaccg ataccctgga taacattaac 1020
gatgtgtttc agcgcatgat tgatggcaaa attgaaggcc gcattgtgct ggatatggcg 1080
agctaacaag cttgcggccg cataatgctt aagtcgaaca gaaagtaatc gtattgtaca 1140
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aacttacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 3540
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gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat tgcccttcac cgcctggccc 3660
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atggtggtta acggcgggat ataacatgag ctgtcttcgg tatcgtcgta tcccactacc 3780
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag 60
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catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg ctatcggctg 5700
aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg ccgagacaga 5760
acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca gatgctccac 5820
gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg tctggtcaga 5880
gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa tggcatcctg 5940
gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa gattgtgcac 6000
cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca cgctggcacc 6060
cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt gcagggccag 6120
actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt gtgccacgcg 6180
gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg ttttcgcaga 6240
aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac cggcatactc 6300
tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg 6360
gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg atggtgtccg ggatctcgac 6420
gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag tagtaggttg aggccgttga 6480
gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc gcccaacagt cccccggcca 6540
cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat gagcccgaag tggcgagccc 6600
gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc aaccgcacct gtggcgccgg 6660
tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat cgatctcgat cccgcgaaat 6720
taatacgact cactata 6737

Claims (10)

1.一种产3-羟基丙酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌协同表达乙醇脱氢酶AdhP、琥珀酸半醛脱氢酶GabD4的基因，还表达NADH氧化酶NOX的基因。
2.权利要求1所述的产3-羟基丙酸的基因工程菌，其特征在于，包括：
(1)协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌的构建：
将乙醇脱氢酶AdhP的基因片段adhP连接至pCDFDuet-1质粒中，获得表达AdhP的重组质粒；
将琥珀酸半醛脱氢酶GabD4的基因片段gabD4连接到表达AdhP的重组质粒中，得到协同表达AdhP和GabD4的重组质粒；
将协同表达AdhP和GabD4的重组质粒转化到大肠杆菌中，获得协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌；
(2)产3-羟基丙酸的基因工程菌的构建：
将NADH氧化酶NOX的基因片段nox连接到pETDuet-1质粒中，获得表达NOX的重组质粒；
将表达NOX的重组质粒转入步骤(1)中得到的协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌中，获得产3-羟基丙酸的基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的产3-羟基丙酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乙醇脱氢酶AdhP的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，编码乙醇脱氢酶AdhP的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
4.根据权利要求2所述的产3-羟基丙酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述琥珀酸半醛脱氢酶GabD4的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，编码GabD4的核苷酸序列如SEQID No:3所示。
5.根据权利要求2所述的产3-羟基丙酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coli BL21(STAR)。
6.根据权利要求2所述的产3-羟基丙酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述NOX的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，编码NOX的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。
7.权利要求1所述的产3-羟基丙酸的基因工程菌或权利要求2-6所述方法构建的产3-羟基丙酸的基因工程菌在转化1,3-丙二醇生产3-羟基丙酸中的应用。
8.一种生产3-羟基丙酸的方法，其特征在于，所述方法为：利用权利要求1所述的产3-羟基丙酸的基因工程菌或权利要求2-6所述方法构建的产3-羟基丙酸的基因工程菌的静息细胞转化1,3-丙二醇生产3-羟基丙酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，具体为：将产3-羟基丙酸的基因工程菌的静息细胞接种至1,3-丙二醇中，在pH值为5～9、温度25～35℃、转速120～220rpm的条件下发酵生产3-羟基丙酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，产3-羟基丙酸的基因工程菌的静息细胞的接种量为15～25g/L。
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