CN102382778A - 一种3-羟基丙酸高产菌株及其应用 - Google Patents

一种3-羟基丙酸高产菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种3-羟基丙酸高产菌株，是Candida sp.的复合诱变菌株，所得菌株遗传性状稳定，产量性状稳定，适合工业推广，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5344。本发明还公开了一种转化丙酸为3-羟基丙酸的方法。通过在菌体生长达到稳定期时，限制性补加葡萄糖使其浓度在15-25g/L，控制菌体浓度OD600为18-20，流加丙酸-氢氧化钾-强氧化钠-氨水(8∶1∶1∶1)，使丙酸浓度维持在10-20g/L，发酵培养96h，即可得到含有3-羟基丙酸的发酵液，在优化后培养基上3-羟基丙酸的产量提高到30g/L。

Description

一种3-羟基丙酸高产菌株及其应用
技术领域：
本发明涉及一种3-羟基丙酸高产菌株及其应用，尤其是一种是经物理化学复合诱变得到的酵母菌Candida sp.及其应用于转化丙酸为3-羟基丙酸。
背景技术：
3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionic acid；又称β-Hydroxypropionic acid；缩写为3-HP；分子式C3H6O3；CAS号503-66-2；pK4.51；分子量90；密度1.08)是一个三碳无手性有机酸，与乳酸互为同分异构体。3-HP具有羟基和羧基两个官能团，是很多光学活性物质的前体。它脱水可以生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，还原生成1，3-丙二醇，聚合生成高分子材料，是一种重要的化工平台产品。2004年美国能源部将其列为当今世界12种最具潜力的化工产品之一。
目前，3-HP的生产方法是化学合成法，主要有水合丙烯酸法和β-丙烯腈转化法。但在碳末端引入功能团有很大的难度，且其产品不易分离提纯，生产成本较高，生产过程存在不安全因素，而微生物发酵方法生产3-HP可以有效的避免这些不利因素。微生物转化法生产3-HP的研究始于上世纪60年代但一直处于实验室阶段。主要包括构建基因工程菌法和野生菌发酵法。基因工程法生产3-HP主要有两条途径：以葡萄糖为底物和以甘油为底物的生物转化路线。目前，已知的可发酵产3-HP的野生菌株主要有：Hansenula miso；Fusariummerismoides；Candida rugosa；Byssochlamys sp.；Rhodococcus erythropolis LG12；Klebsiellaterrigena。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是提供一种3-羟基丙酸高产菌株，为假丝酵母变种(Candidasp.)，通过紫外-亚硝基胍-钴60复合诱变获得，于2011年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏委员会管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5344，其催化丙酸转化为3-羟基丙酸的能力增强，同时，耐受丙酸的性能增强。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用所述菌株转化丙酸为3-羟基丙酸的方法，菌株经过种子培养活化后，以4-10％接种量接种发酵培养基，在28-32℃下发酵培养96h得到含有3-羟基丙酸的发酵液。
为提高3-羟基丙酸的产率，控制发酵培养基pH为6.5，不限于在发酵培养基中加入浓度为10-30％(V/V)，pH为6.5的磷酸盐缓冲液；优选20％(V/V)的磷酸盐缓冲液(6.5)。
为了进一步提高3-羟基丙酸的产率，对发酵过程进行优化，发酵24小时后，流加含有葡萄糖/甘油的缓冲液或葡萄糖/甘油水溶液控制发酵过程中葡萄糖浓度在15-25g/L；其中优选的添加为发酵48-84h内补加含有葡萄糖/甘油的缓冲液或葡萄糖/甘油水溶液以维持发酵过程中葡萄糖浓度在20g/L。
此外，发酵24小时后，流加丙酸-氢氧化钠-氢氧化钾-氢氧化铵(8∶1∶1∶1)或丙酸溶液控制发酵过程中丙酸浓度为10-20g/L；其中优选的添加为在发酵48h后，流加丙酸-氢氧化钠-氢氧化钾-氢氧化铵(8∶1∶1∶1)或丙酸溶液以维持发酵过程中丙酸浓度为15g/L。
3-羟基丙酸的测定方法：高效液相色谱法，色谱柱：Ecosile C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：3％甲醇，用H3PO4调pH至2.0；检测条件：紫外检测器，柱温35℃，流速0.8mL/min，进样量20μL。
本发明提供的3-羟基丙酸产量较高的突变菌株，其产量高且遗传性状稳定。此外，本发明还提供了一种该菌株以丙酸为底物生物转化3-羟基丙酸的方法，利用此方法3-羟基丙酸的产量达到23g/L，具有广阔的前景。
具体实施方式：
实施例1新菌株CGMCC No.5344的获得
(a)将野生菌Candida sp.CCTCC NO：M 93018用含有丙酸的培养基驯化，挑选得到的出发菌株a；
(b)将出发菌株a经紫外-亚硝基胍-钴60复合诱变，得到混合种子液b；
(c)将b涂布完全培养，得到单菌落点种筛选培养基；
(d)培养筛选单菌落，发酵检测验证，得到诱变高产株CGMCC No.5344。
步骤(a)中丙酸驯化的浓度为0.5％-3％。
步骤(b)中用15W的紫外灯辐照70s，加入亚硝基胍溶液使其终浓度为25mg/mL，钴60剂量为1000Gy诱变效果最佳。
步骤(c)中完全培养基配方为(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸膏10，琼脂粉20；筛选培养基配方为(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸膏10，琼脂粉20，丙酸2％。
步骤(d)中发酵检测方法为：高效液相色谱法，色谱柱：Ecosile C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：3％甲醇，用H3PO4调pH至2.0；检测条件：紫外检测器，柱温35℃，流速0.8mL/min，进样量20μL。
实施例2突变株CGMCC No.5344发酵产3-HP
(1)种子液培养：将活化的菌落接种种子培养基，220r/min，30℃培养20h。种子培养基(g/L)：葡萄糖/甘油20，酵母膏10，(NH4)2SO415，KH2PO49，K2HPO43，MgSO4·7H2O 1.5，FeSO4·7H2O 0.03，pH 6.8±0.2。
(2)发酵培养
发酵培养基(g/L)：酵母膏10，(NH4)2SO415，KH2PO49，K2HPO43，MgSO4·7H2O 1.5，FeSO4·7H2O 0.03，CaCl20.04，丙酸15，TES 5mL，用KOH/H2SO4调节pH至6.0±0.2，115℃，灭菌15min，与50g/L葡萄糖/甘油混合。
以4％接种量接种，220r/min，30℃培养，发酵96h，将发酵液离心，稀释，微孔滤膜过滤后，HPLC测定野生菌与突变株CGMCC No.5344的3-羟基丙酸产量分别为3.0g/L和23g/L。
实施例3静息细胞对3-羟基丙酸产量的影响
无外源碳源存在的情况下，3-HP会被菌体反耗供能用于维持菌体的正常代谢，相比较而言野生菌Candida sp.的3-羟基丙酸降解速率要高于CGMCC No.5344(如表1所示)。
静息细胞的制备与培养：发酵培养基中培养72h后，离心收集菌体，用0.2M磷酸盐缓冲液洗涤菌体两次。转接到含有1％的3-羟基丙酸的磷酸盐缓冲液中，回转式摇床220r/min，30℃培养48h。每12h取样检测菌体浓度及3-HP的含量。
表1出发菌Candida sp.与CGMCC No.5344的静息细胞对3-HP的降解
Figure BDA0000110693500000031
实施例4突变株CGMCC No.5344的稳定性
因为诱变出发菌株为双倍体，考虑诱变可能存在不稳定遗传因素，CGMCC No.5344进行10次传代实验。
(1)菌种活化，平板划线将长势良好的菌落转接活化平板传代培养10次。
(2)种子液培养同实施例2
(3)发酵培养同实施例2
(4)发酵96h，将发酵液离心稀释，微孔滤膜过滤后，HPLC测定3-羟基丙酸产量。
结果表明CGMCC No.5344具有良好的遗传稳定性，3-HP产量差异可忽略。
表2传代培养突变株的3-HP产量(差异是否显著，P＜0.5)
Table 2.3-HP production of serial subcultivation of mutagenesis mutants
Figure BDA0000110693500000041
实施例5转化丙酸为3-羟基丙酸
(1)种子液培养同实施例2
(2)发酵培养：
发酵培养基(g/L)：酵母膏10，(NH4)2SO415，KH2PO49，K2HPO46，MgSO4·7H2O 1.0，FeSO4·7H2O 0.015，CaCl20.04，丙酸10，TES 5mL，用KOH/H2SO4调节pH至6.2±02。培养基中分别加入10％(V/V)的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)。
115℃，灭菌15min，与40g/L葡萄糖/甘油混合。以4％接种量接种发酵培养基，220r/min，30℃培养。
(3)发酵96h，将发酵液离心，稀释，微孔滤膜过滤后，HPLC测定3-羟基丙酸产量为19.5g/L。
实施例6转化丙酸为3-羟基丙酸
(1)种子液培养同实施例2
(2)发酵培养：
发酵培养基(g/L)：酵母膏10，(NH4)2SO415，KH2PO49，K2HPO46，MgSO4·7H2O 1.0，FeSO4·7H2O 0.015，CaCl20.04，丙酸10，TES 5mL，用KOH/H2SO4调节pH至6.2±02。培养基中加入20％(V/V)的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)。
115℃，灭菌15min，与40g/L葡萄糖/甘油混合。以4％接种量接种发酵培养基，220r/min，30℃培养。
(3)发酵培养72h，补加含有葡萄糖/甘油的磷酸盐缓冲液以维持发酵过程中葡萄糖浓度在15-25g/L，控制菌体浓度OD600为18-20。
(4)发酵96h，将发酵液离心，稀释，微孔滤膜过滤后，HPLC测定3-羟基丙酸产量为20g/L。
实施例7转化丙酸为3-羟基丙酸
(1)种子液培养同实施例2
(2)发酵培养：
发酵培养基(g/L)：酵母膏10，(NH4)2SO415，KH2PO49，K2HPO46，MgSO4·7H2O 1.0，FeSO4·7H2O 0.015，CaCl20.04，丙酸10，TES 5mL，用KOH/H2SO4调节pH至6.2±0.2。培养基中加入10％(V/V)的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)。
115℃，灭菌15min，与40g/L葡萄糖/甘油混合。以4％接种量接种发酵培养基，220r/min，30℃培养。
(3)发酵培养48-84h内，补加含有葡萄糖/甘油的磷酸盐缓冲液以维持发酵过程中葡萄糖浓度在20g/L，以控制菌体浓度OD600为18-20。
(4)发酵培养48h后，流加丙酸-氢氧化钠-氢氧化钾-氢氧化铵/丙酸溶液以维持发酵过程中丙酸浓度为15g/L。
(5)发酵96h，将发酵液离心，稀释，微孔滤膜过滤后，HPLC测定3-羟基丙酸产量为30g/L。
实施例8转化丙酸为3-羟基丙酸
(1)种子液培养同实施例2
(2)发酵培养：
发酵培养基(g/L)：酵母膏10，(NH4)2SO415，KH2PO49，K2HPO46，MgSO4·7H2O 1.0，FeSO4·7H2O 0.015，CaCl20.04，丙酸10，TES 5mL，用KOH/H2SO4调节pH至6.2±0.2。培养基中加入10％(V/V)的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)。
115℃，灭菌15min，与40g/L葡萄糖/甘油混合。以4％接种量接种发酵培养基，220r/min，30℃培养。
(3)发酵培养48-84h内，补加含有葡萄糖/甘油的磷酸盐缓冲液以维持发酵过程中葡萄糖浓度在10g/L，以控制菌体浓度OD600为18-20。
(4)发酵培养24h后，流加丙酸-氢氧化钠-氢氧化钾-氢氧化铵/丙酸溶液以维持发酵过程中丙酸浓度为10g/L。
(5)发酵96h，将发酵液离心，稀释，微孔滤膜过滤后，HPLC测定3-羟基丙酸产量为20g/L。
实施例9转化丙酸为3-羟基丙酸
(1)种子液培养同实施例2
(2)发酵培养：
发酵培养基(g/L)：酵母膏10，(NH4)2SO415，KH2PO49，K2HPO46，MgSO4·7H2O 1.0，FeSO4·7H2O 0.015，CaCl20.04，丙酸10，TES 5mL，用KOH/H2SO4调节pH至6.2±0.2。培养基中加入10％(V/V)的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)。
115℃，灭菌15min，与40g/L葡萄糖/甘油混合。以4％接种量接种发酵培养基，220r/min，30℃培养。
(3)发酵培养48-84h内，补加含有葡萄糖/甘油的磷酸盐缓冲液以维持发酵过程中葡萄糖浓度在20g/L，以控制菌体浓度OD600为18-20。
(4)发酵培养72h后，流加丙酸-氢氧化钠-氢氧化钾-氢氧化铵/丙酸溶液以维持发酵过程中丙酸浓度为20g/L。
(5)发酵96h，将发酵液离心，稀释，微孔滤膜过滤后，HPLC测定3-羟基丙酸产量为23g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种3-羟基丙酸高产菌株，为假丝酵母变种(Candida sp.)，于2011年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏委员会管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5344。
2.权利要求1所述的菌株，其特征在于催化丙酸转化为3-羟基丙酸的能力增强，同时，耐受丙酸的性能由0.2％增强到3％。
3.权利要求1所述的菌株，其特征在于通过紫外-亚硝基胍-钴60复合诱变获得。
4.一种应用权利要求1所述菌株转化丙酸为3-羟基丙酸的方法，其特征在于种子培养后，以4-10％接种量接种发酵培养基，在28-32℃下发酵培养96小时得到含有3-羟基丙酸的发酵液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于发酵培养基中加入浓度为10-30％，pH为6.5的磷酸盐缓冲液控制发酵过程中的pH，所述百分比为体积百分比。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于发酵24小时后，流加含有葡萄糖/甘油的缓冲液或葡萄糖/甘油水溶液控制发酵过程中葡萄糖浓度在15-25g/L。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于发酵24小时后，流加丙酸-氢氧化钠-氢氧化钾-氢氧化铵(8∶1∶1∶1)或丙酸溶液控制发酵过程中丙酸浓度为10-20g/L。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于优选发酵48-84小时内流加含有葡萄糖/甘油的缓冲液或葡萄糖/甘油水溶液控制发酵过程中葡萄糖浓度在20g/L。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于优选发酵48h后，流加丙酸-氢氧化钠-氢氧化钾-氢氧化铵(8∶1∶1∶1)或丙酸溶液控制发酵过程中丙酸浓度为15g/L。
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