CN101519635A - 产3-羟基丙酸的转化微生物及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种含有重组载体的转化微生物，其中该重组载体含有基因编码SEQ IDNO.1所示核苷酸序列表达的蛋白质。一种制备转化微生物的方法，包括将基因编码SEQ ID NO.1所示核苷酸序列导入到宿主。所述含有重组载体的转化微生物在生产3－羟基丙酸中的应用。质粒在宿主菌株中稳定性高，而且生产菌株较合适，产物终浓度有竞争力，另外还可在发酵过程中添加微量四环素，达到抑制部分杂细菌的目的，大大减少了在工业化过程中较易发生的染杂菌现象，发酵时间也有所缩短，为微生物发酵法工业化生产3－羟基丙酸奠定了良好的基础。
Description
一、技术领域
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种产3-羟基丙酸的转化微生物及其构建方法和应用。
二、背景技术
现有技术：3-羟基丙酸(3-hydroxypropanoate，3-HP)是一种重要的功能有机酸。它易溶于水、乙醇、乙醚，可以通过化学工业中一系列成熟的催化技术转化为具有重要商业价值的化学品，如通过脱水生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，与醇酯化反应生成酯，以及经还原反应生成3-羟基丙酸等；3-HP还具有潜在的生物应用：例如在营养工业中，可使用3-HP作为食品和饲料添加剂或防腐剂，在一些植物体内的内生真菌中存在微量的3-HP，发现其具有杀灭寄生线虫的能力；另外，还可作为单体原料用以合成聚3-羟基丙酸[P-(3HP)]，聚3-羟基丙酸是一种新型生物可降解高分子，它不但具有良好的生物降解性和生物相容性，而且高分子量的[P-(3HP)]具有很高的机械强度和拉伸强度(>400MPa)以及较大的断裂伸长率等优异性能。而我国在该领域的研究才刚刚起步，3-羟基丙酸的应用潜力有待开发。
目前微生物生产3-羟基丙酸主要有三种途径
1、微生物转化非糖基原料生产3-羟基丙酸，
2、微生物利用3-羟基丙酸循环途径微量积累3-羟基丙酸
3、以Cargill公司和威斯康星大学等研究机构为代表的构建基因工程菌生产3-羟基丙酸，主要有两种方案：
(1)以葡萄糖为底物，在大肠杆菌中构建经乙酰-CoA的5种代谢途径
(2)以甘油为底物，在大肠杆菌中导入甘油脱水酶基因，
3-羟基丙酸是少数耐热微生物(Chloroflexus aurantiacus)胞内羟基丙酸循环途径固定CO2过程的代谢中间物，其作为中间代谢物，通常情况难以高效率大量积累，这是由于中间产物的积累都必将破坏微生物中CO2固定循环途径的持续进行。迄今，在自然界中尚未发现能直接利用糖质原料或甘油高效转化生产3-HPA的微生物，但3-羟基丙酸循环途径所涉及到的关键酶对于今后构建模式基因工程菌生产3-羟基丙酸将有重大指导意义。
三、发明内容
技术问题：本发明针对上述技术空白，提供一种产3-羟基丙酸的转化微生物及其构建方法和应用。
技术方案：一种含有重组载体的转化微生物，其中该重组载体含有基因编码SEQ ID NO.1所示核苷酸序列表达的蛋白质。
一种制备转化微生物的方法，包括将基因编码SEQ ID NO.1所示核苷酸序列导入到宿主。
制备转化体方法中所述宿主为肺炎克雷伯氏菌。
制备转化微生物的方法为：利用PCR技术从醋酸杆菌基因组中扩增出如SEQ ID NO.2所示含2328个碱基对的醛脱氢酶基因aldH，从质粒载体pHY300PLK中扩增出如SEQ ID NO.3所示含1560个碱基对的四环素抗性基因TetR，将其串联到表达载体pUC18中，得到重组质粒pUC18-aldH--TetR，重组质粒转化筛选获得的肺炎克雷伯氏菌，得到重组肺炎克雷伯氏菌。
制备转化微生物的方法，制备步骤为：
(1)基因aldH的克隆：根据Genebank公布的醋酸杆菌中aldH基因的序列设计合成PCR所需的引物：
P1：51-GAATTCATGGGTAAGCTGGAACGCATTGC-31
P2：51-TCTAGATCAGGCGTTCCCTTTTTCTTTTA-31
引物两端分别引入EcoR I，Xba I酶切位点，以醋酸杆菌基因组DNA为模板完成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃1min40sec 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，进行序列测定，EcoR I，Xba I酶切重组pMD18-simple-T载体，回收其中1.56kb片段，连接至pUC18载体，获得重组质粒pUC18-aldH；
(2)基因TetR的克隆：根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列设计合成PCR所需的引物：
P3：51-CTGCAG ATGAAATACTGAATTTAAAA-31
P4：51-AAGCTT CTTAACGATTTAGAAATCCC-31
引物两端分别引入PstI，Hind III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min20sec 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，经SmaI，HindIII酶切回收其中1.56kb片段，连接至pUC18-aldH载体，得到重组质粒pUC18-aldH-TetR；
(3)转化微生物的获得：将重组质粒pUC18-aldH-TetR通过电击转化的方式转化肺炎克雷伯氏菌，涂布含40μg/m L的四环素平板，挑取阳性转化子，得到重组肺炎克雷伯氏菌。
含有重组载体的转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用。
转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用，生产工艺为：种子液的培养：将接种后的培养液在31-37℃，摇床转速120-180r/min的条件下培养12-24h；所述培养液组成为：酵母膏4-5g/L，麦芽3.0-4.0g/L，蛋白胨4-5g/L，NaCl 10g/L，四环素浓度20-40μg/L；发酵培养：培养条件为接种种子液的量为5-10％(v/v)，发酵温度31-37℃，接种6-8小时好氧发酵，加入IPTG，IPTG的最终浓度1.0mmol/L，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境，发酵时间30h左右；其中培养基组成为：酵母膏4-5g/L，K2HPO4·3H2O 8-10g/L，KH2PO4 1.5-2.5g/L，NH4Cl 0.8-1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O 25-35mg/L，CoCl2·6H2O 4-6mg/L，VitaminB12 5mg/L，glycerol 30g/L。
有益效果：本发明在于提供一种转化微生物，用于发酵产3-羟基丙酸，该菌在有氧或微氧条件下利用甘油高效发酵产3-羟基丙酸。摇瓶发酵完毕，最终3-羟基丙酸浓度达2.6～3.3g/L，摩尔转化率在40-68％之间，经5L罐发酵实验，最终3-羟基丙酸浓度高达8.2g/L，实现了在特定宿主细胞中生产3-羟基丙酸的过程，为微生物发酵法工业化生产3-羟基丙酸奠定了良好的理论基础。与原始克雷伯氏菌相比，产生了一种新代谢产物3-羟基丙酸。与目前文献所报道利用基因手段构建重组微生物生产3-羟基丙酸方法相比，不仅质粒在宿主菌株中稳定性高，而且生产菌株较合适，产物终浓度有竞争力(目前文献所报道的利用基因工程手段改造大肠杆菌生产3-羟基丙酸的产量在5g/L以下)，另外还可在发酵过程中添加微量四环素，达到抑制部分杂细菌的目的，大大减少了在工业化过程中较易发生的染杂菌现象，发酵时间也有所缩短，为微生物发酵法工业化生产3-羟基丙酸奠定了良好的基础。
四、附图说明
图1为载体图谱示意图；
图2为外源基因在宿主细胞Klebsiella pneumoniae中成功表达的SDS-PAGE图谱；图中Lane 1：蛋白质Marker；Lane 2：经诱导的重组菌；Lane 3：未经诱导的重组菌；Lane 4：加入诱导剂的原始菌；Lane：未加入诱导剂的原始菌；图3为色谱图，其中(a)标准混合液；(b)发酵液；图中1.甘油Glycerol，2.3-羟基丙酸，3.乳酸Lactic acid，4.甲酸Formic acid，5.乙酸Acetic acid。
五、具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Joe Sambrook、David Russell等人，《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》3rd ed(Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：Klebsiella pneumoniae ATCC25955-3-pUC18-aldH-TetR的构建
(1)基因aldA的克隆：根据Genebank公布的大肠杆菌E.coli K12中aldA基因的序列(SEQ ID No.2)设计合成PCR所需的引物：
P1(SEQ ID No.4)：51-GAATTCATGGGTAAGCTGGAACGCATTGC-31
P2(SEQ ID No.5)：51-TCTAGATCAGGCGTTCCCTTTTTCTTTTA-31
引物两端分别引入EcoR I，Xba I酶切位点，以醋酸杆菌基因组DNA为模板完成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min40sec 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，进行序列测定，EcoR I，Xba I酶切重组pMD18-simple-T载体，回收其中1.56kb片段，连接至pUC18载体，获得重组质粒pUC18-aldH；
(2)基因TetR的克隆：根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列(SEQID No.3)设计合成PCR所需的引物：
P3(SEQ ID No.6)：51-CTGCAG ATGAAATACTGAATTTAAAA-31
P4(SEQ ID No.7)：51-AAGCTT CTTAACGATTTAGAAATCCC-31
引物两端分别引入PstI，Hind III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min20sec 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，经SmaI，Hind III酶切回收其中1.56kb片段，连接至pUC18-aldH载体，得到重组质粒pUC18-aldH-TetR。
实施例2：重组质粒pUC18-aldH-TetR转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae25955(从ATCC获得，菌种号：Klebsiella pneumoniae ATCC25955)
利用电击穿孔仪将重组质粒pUC18-aldH-TetR转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae 25955，电转化条件参数为：电压2.5kV，阻值200Ω，脉冲时间4.5msec。电击转化完毕，将经过电击处理过的Klebsiella pneumoniae ATCC25955涂布于含有40μg/mL四环素的LB培养基上，得到阳性克隆Klebsiella pneumoniaeATCC25955-3-pUC18-aldH-TetR。
实施例3：工程菌Klebsiella pneumoniae 25955-3-pUC18-aldH-TetR的质粒稳定性考察
考察方法：从新鲜转化平板上挑取单菌落接种至3mL不含四环素的LB培养基中，37℃培养种子12h作种子，转种培养24h，即为传种20代，转种培养5次，即为100代，将上述菌液涂布于不含抗生素的LB板上，从中挑选100个单菌落分别点在添加和不添加四环素的平板上，37℃培养12-16h，比较在添加和不添加四环素的平板上的菌落数即得其稳定性。
考察结果：传种100代之后其质粒稳定性为99％。
实施例4：工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955-3-pUC18-aldH-TetR利用甘油在摇瓶中发酵产3-羟基丙酸
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC25955-3-pUC18-aldH-TetR；
(2)种子培养基：酵母膏4-5g/L，麦芽3.0-4.0g/L，蛋白胨4-5g/L，NaCl 10g/L，四环素浓度20-40μg/L；
种子培养：250mL三角瓶，装液量35mL，培养温度31-37℃，摇床转速120-180r/min，培养12-24h。
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏4-5g/L，K2HPO4·3H2O 8-10g/L，KH2PO4 1.5-2.5g/L，NH4Cl 0.8-1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O25-35mg/L，CoCl2·6H2O 4-6mg/L，VitaminB12 5mg/L，glycerol 30g/L。
培养条件：接种量为占培养基体积的10％，发酵温度31-37℃，接种6小时好氧发酵，加入IPTG，IPTG的最终浓度1.0mmol/l，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境(停止通入氧气即可)，发酵时间30h左右。
发酵结果：30g底物甘油经转化得到2.6g/L 3-羟基丙酸。
对比例1：原始菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955利用甘油在摇瓶中发酵产3-羟基丙酸
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC25955
(2)种子培养基：酵母膏4-5g/L，麦芽3.0-4.0g/L，蛋白胨4-5g/L，NaCl 10g/L，四环素浓度20-40μg/L；
种子培养：250mL三角瓶，装液量35mL，培养温度31-37℃，摇床转速120-180r/min，培养12-24h。
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏4-5g/L，K2HPO4·3H2O 8-10g/L，KH2PO4 1.5-2.5g/L，NH4Cl 0.8-1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O25-35mg/L，CoCl2·6H2O 4-6mg/L，VitaminB12 5mg/L，glycerol 30g/L。
发酵培养条件：250mL摇瓶，装液量100mL，接种量10％(占培养基体积)，发酵温度31-37℃，接种6小时好氧发酵，加入IPTG，IPTG的最终浓度1.0mmol/l，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境(停止通入氧气即可)，发酵时间30h左右。
发酵结果：30g底物甘油消耗完毕，未检测到3-羟基丙酸生成。
实施例5：工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955-3-pUC18-aldH-TetR利用甘油在3L发酵罐中产3-羟基丙酸
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC25955-3-pUC18-aldH-TetR；
(2)种子培养基：酵母膏4-5g/L，麦芽3.0-4.0g/L，蛋白胨4-5g/L，NaCl 10g/L，四环素浓度20-40μg/L；
种子培养：250mL三角瓶，装液量35mL，培养温度31-37℃，摇床转速120-180r/min，培养12-24h。
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏4-5g/L，K2HPO4·3H2O 8-10g/L，KH2PO4 1.5-2.5g/L，NH4Cl 0.8-1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O25-35mg/L，CoCl2·6H2O 4-6mg/L，VitaminB12 5mg/L，glycerol 30g/L。
培养条件：3L发酵罐(New Brunswick Scientific，NJ)接种量10％(v/v)，发酵温度31-37℃，接种6小时好氧发酵，加入IPTG，IPTG的最终浓度1.0mmol/l，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境(停止通入氧气即可)，发酵时间30h左右。
发酵结果：80g底物甘油经转化得到8.2g/L 3-羟基丙酸。
对比例2：原始菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955利用甘油在3L发酵罐中产3-羟基丙酸
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC25955；
(2)种子培养基：酵母膏4-5g/L，麦芽3.0-4.0g/L，蛋白胨4-5g/L，NaCl10g/L，四环素浓度20-40μg/L；
种子培养：250mL三角瓶，装液量35mL，培养温度31-37℃，摇床转速120-180r/min，培养12-24h。
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏4-5g/L，K2HPO4·3H2O 8-10g/L，KH2PO4 1.5-2.5g/L，NH4Cl 0.8-1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O 25-35mg/L，CoCl2·6H2O 4-6mg/L，VitaminB12 5mg/L，glycerol 30g/L。
培养条件：3L发酵罐(New Brunswick Scientific，NJ)接种量10％(v/v)，发酵温度31-37℃，接种6小时好氧发酵，加入IPTG，IPTG的最终浓度1.0mmol/l，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境(停止通入氧气即可)，发酵时间30h左右。
发酵结果：80g底物甘油消耗完毕，未检测到3-羟基丙酸生成。
序列表
<110>南京工业大学
<120>产3-羟基丙酸的转化微生物及其构建方法和应用
<160>7
<210>1
<211>2714
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(2714)
<400>1
<210>2
<211>2328
<212>DNA
<213>aldH
<400>2
<210>3
<211>386
<212>DNA
<213>Zeocin
<400>3
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>合成引物
<400>4
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>合成引物
<400>5
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>合成引物
<400>6
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>合成引物
<400>7
Claims (7)
1.一种含有重组载体的转化微生物，其中该重组载体含有基因编码SEQ IDNO.1所示核苷酸序列表达的蛋白质。
2.一种制备转化微生物的方法，包括将基因编码SEQ ID NO.1所示核苷酸序列导入到宿主。
3.根据权利要求2所述的制备转化体的方法，其特征在于所述宿主为肺炎克雷伯氏菌。
4.根据权利要求3所述的制备转化微生物的方法，其特征在于制备步骤为：利用PCR技术从醋酸杆菌基因组中扩增出如SEQ ID NO.2所示含2328个碱基对的醛脱氢酶基因aldH，从质粒载体pHY300PLK中扩增出如SEQ ID NO.3所示含1560个碱基对的四环素抗性基因TetR，将其串联到表达载体pUC18中，得到重组质粒pUC18-aldH--TetR，重组质粒转化筛选获得的肺炎克雷伯氏菌，得到重组肺炎克雷伯氏菌。
5.根据权利要求4所述的制备转化微生物的方法，其特征在于制备步骤为：
(1)基因aldH的克隆：根据Genebank公布的醋酸杆菌中aldH基因的序列设计合成PCR所需的引物：
P1：51-GAATTCATGGGTAAGCTGGAACGCATTGC-31
P2：51-TCTAGATCAGGCGTTCCCTTTTTCTTTTA-31
引物两端分别引入EcoR I，Xba I酶切位点，以醋酸杆菌基因组DNA为模板完成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 1min40sec 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，进行序列测定，EcoR I，Xba I酶切重组pMD 18-simple-T载体，回收其中1.56kb片段，连接至pUC18载体，获得重组质粒pUC18-aldH；
(2)基因TetR的克隆：根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列设计合成PCR所需的引物：
P3：51-CTGCAG ATGAAATACTGAATTTAAAA-31
P4：51-AAGCTT CTTAACGATTTAGAAATCCC-31
引物两端分别引入PstI，Hind III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 1min20 sec30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，经SmaI，Hind III酶切回收其中1.56kb片段，连接至pUC18-aldH载体，得到重组质粒pUC18-aldH-TetR；
(3)转化微生物的获得：将重组质粒pUC18-aldH-TetR通过电击转化的方式转化肺炎克雷伯氏菌，涂布含40μg/mL的四环素平板，挑取阳性转化子，得到重组肺炎克雷伯氏菌。
6.权利要求1所述含有重组载体的转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用。
7.根据权利要求6所述的转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用，其特征在于生产工艺为：
(1)种子液的培养：将接种后的培养液在31-37℃，摇床转速120-180r/min的条件下培养12-24h；所述培养液组成为：酵母膏4-5g/L，麦芽3.0-4.0g/L，蛋白胨4-5g/L，NaCl 10g/L，四环素浓度20-40μg/L；
(2)发酵培养：培养条件为接种种子液的量为占培养基体积5-10％，发酵温度31-37℃，接种6-8小时好氧发酵，加入IPTG，IPTG的最终浓度1.0mmol/L，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境，发酵时间30h左右；其中培养基组成为：酵母膏4-5g/L，K2HPO4·3H2O 8-10g/L，KH2PO4 1.5-2.5g/L，NH4Cl 0.8-1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O 25-35mg/L，CoCl2·6H2O 4-6mg/L，VitaminB12 5mg/L，glycerol 30g/L。
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