CN101260379B - 一种产1,3-丙二醇基因工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化工领域，公开了一种产1，3-丙二醇基因工程菌及其制备方法和应用。该菌株分类命名为Klebsiella pneumoniae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR，由来自大肠杆菌的1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD与来自质粒pHY300PLK的四环素抗性基因TetR相连接，插入载体pUC18，转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955获得。该菌能显著提高甘油转化1，3-丙二醇的能力，提高了对底物甘油的利用能力和转化率，提高了产物1，3-丙二醇的终浓度，同时缩短了发酵时间，便于微生物发酵法工业化生产1，3-丙二醇。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及一种产1，3-丙二醇基因工程菌及其制备方法和应用。
背景技术
1，3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工和医药中间体原料，是合成新型聚酯高分子材料聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)的单体。与聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)和尼龙等比较，PTT具有良好的印染特性、富有弹性、抗紫外线、静电性好、可生物降解并再生利用等多种优良特性，因此PTT在纺织服装业、地毯装饰业、工程塑料等众多领域有着十分广阔的应用前景。据估计，目前仅我国每年就需求PDO上百万吨，而且在未来十年我国对PDO的需求量还将继续增大。PTT是目前国际上公认的六大石化新产品之一。PTT生产的关键在于单体原料PDO的来源，其生产成本直接影响着PTT的工业化生产和应用规模。
1，3-丙二醇的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法目前仅有国外DuPont和Shell公司以及国内的少数几家单位在进行小规模工业化生产。技术路线分别是德国Degussa公司的丙烯醛合成法专利技术和Shell公司开发的环氧乙烷合成法，并用于聚合生产PTT。为了垄断市场，这两家跨国公司不对外销售用于PTT生产的PDO，而只向客户销售PTT切片及其下游产品。同时，化学合成法存在设备投资大、工艺要求严格、操作条件苛刻、有毒副产物多、产品提取难度大、三废处理成本高以及生产原料依赖于不可再生的石油资源等问题，导致PTT材料及其原料产品PDO的价格一直居高不下，制约其进一步的发展，因而我们采用微生物发酵法生产PDO，以可再生资源——碳水化合物为原料，具有操作简便、反应条件相对温和、副产物少、污染少且容易处理以及成本低廉等优点，引起了国内外相关企业和研究单位的高度重视，将具有广泛的应用情景和开发潜力。
微生物发酵法的生产方法包括：一是利用从自然界获得的菌株以甘油为底物直接发酵生产1，3-丙二醇；二是构建基因工程菌以葡萄糖或甘油为底物发酵生产1，3-丙二醇；基因工程菌构建策略主要有5种：
(1)强化原始菌株中还原途径限速酶的表达及阻止副产物的代谢途径；
(2)将1，3-丙二醇生产菌的关键酶基因dhaB、dhaT基因克隆到甘油生产菌中，以希望能获得将葡萄糖转化为1，3-丙二醇的基因工程菌；
(3)将甘油生产菌的DAR1、GPP2基因克隆到1，3-丙二醇生产菌中，以希望能获得将葡萄糖转化为1，3-丙二醇的基因工程菌；
(4)将产1，3-丙二醇的dha调控子基因克隆到大肠杆菌中，获得能转化甘油为1，3-丙二醇的基因工程菌；
(5)将1，3-丙二醇生产菌的关键酶基因dhaB、dhaT基因和甘油生产菌的DAR1、GPP2基因克隆到大肠杆菌中，从而获得能将葡萄糖转化为1，3-丙二醇的基因工程菌。
目前，国外DuPont公司已经在大肠杆菌中成功构建了以葡萄糖为底物发酵1.3-丙二醇的途径，产量高达135g/L。国内众多研究机构也纷纷针对产1，3-丙二醇途径中的关键酶进行了深入的研究，在模式大肠杆菌成功表达关键酶基因，但产量水平较低，而针对原始生产菌株肺炎克雷伯氏菌的基因工程手段改造鲜见报道，随着国际范围内生物柴油工业的广泛兴起，将产生大量的剩余副产品甘油，为利用发酵法制备1，3-丙二醇提供的一定了丰富的原料。
发明内容
本发明的目的是提供一种产1，3-丙二醇基因工程菌。
本发明另一个目的是提供上述产1，3-丙二醇基因工程菌的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述产1，3-丙二醇基因工程菌的应用。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
一种产1，3-丙二醇基因工程菌，其分类命名为Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。
所述的产1，3-丙二醇基因工程菌，该工程菌是通过下列方法制备得到的：利用PCR技术从大肠杆菌中扩增出1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD(SEQ ID No.5)，从质粒载体pHY300PLK中扩增出四环素抗性基因TetR(SEQ ID No.6)，通过多克隆位点将其串联到表达载体pUC18的合适位置，TetR基因置于yqhD的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-TetR，重组质粒转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC 25955，得到重组的肺炎克雷伯氏菌，即产1，3-丙二醇基因工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。
进一步，所述的产1，3-丙二醇基因工程菌通过下列方法制备得到：
(1)基因yqhD的克隆：根据Genebank公布的大肠杆菌E.coli K12中yqhD基因的序列设计合成PCR所需的引物：
P1：5’-GAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3’(SEQ ID No.1)
P2：5’-GGATCCCACTCAGAATGCCTGGCGG-3’(SEQ ID No.2)
引物两端分别引入EcoR I，BamHI，以大肠杆菌E.coli JM108或E.coli JM109基因组DNA为模板完成PCR反应；PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，EcoR I，BamHI酶切重组pMD18-T载体，回收其中1.16kb片段，根据所述酶切位点连接至pUC18载体的合适位置，获得重组质粒pUC18-yqhD；
(2)基因TetR的克隆：根据质粒载体pHY300PLK中四环素抗性基因序列设计合成PCR所需的引物：
P3：5’-GGATCCATGAAATACTGAATTTAAAA-3’(SEQ ID No.3)
P4：5’-AAGCTTCTTAACGATTTAGAAATCCC-3’(SEQ ID No.4)
引物两端分别引入BamHI，Hind III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应；PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，经BamHI，Hind III酶切回收其中1.56kb片段，根据所述酶切位点连接至pUC18-yqhD载体的合适位置，TetR基因置于yqhD的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-TetR；
(3)重组基因工程菌的获得：将重组质粒pUC18-yqhD-TetR转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC 25955，涂布含40μg/mL的四环素平板，挑取阳性转化子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组肺炎克雷伯氏菌，命名为Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。
所述的产1，3-丙二醇基因工程菌的制备方法，该方法包括下列步骤：利用PCR技术从大肠杆菌中扩增出1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD，从质粒载体pHY300PLK中扩增出四环素抗性基因TetR，利用多克隆位点将其串联到表达载体pUC18的合适位置，TetR基因置于yqhD的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-TetR，重组质粒转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955，得到重组肺炎克雷伯氏菌，即产1，3-丙二醇基因工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。
进一步，所述的产1，3-丙二醇基因工程菌的制备方法包括下列步骤：
(1)基因yqhD的克隆：根据Genebank公布的大肠杆菌E.coli K12中yqhD基因的序列设计合成PCR所需的引物：
P1：5’-GAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3’
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引物两端分别引入EcoR I，BamHI，以大肠杆菌E.coli JM108或E.coli JM109基因组DNA为模板完成PCR反应；PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，EcoR I，BamHI酶切重组pMD18-T载体，回收其中1.16kb片段，根据所述酶切位点连连接至pUC18载体的合适位置，获得重组质粒pUC18-yqhD；
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P3：5’-GGATCCATGAAATACTGAATTTAAAA-3’
P4：5’-AAGCTTCTTAACGATTTAGAAATCCC-3’
引物两端分别引入BamHI，Hind III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应；PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，经BamHI，HindIII酶切回收其中1.56kb片段，根据所述酶切位点连连接至pUC18-yqhD载体的合适位置，TetR基因置于yqhD的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-TetR；
(3)重组基因工程菌的获得：将重组质粒pUC18-yqhD-TetR转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC 25955，涂布含40μg/mL的四环素平板，挑取阳性转化子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组肺炎克雷伯氏菌，命名为Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。
所述的产1，3-丙二醇基因工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR在生产1，3-丙二醇中的应用。
所述的应用，该基因工程菌以甘油为底物发酵生产1，3-丙二醇，具体生产工艺为：
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR；
(2)种子培养基：酵母膏4-5g/l，麦芽3.0-4.0g/l，蛋白胨4-5g/l，NaCl 8-12g/l，四环素浓度20-40μg/l；
种子培养：250ml三角瓶，装液量35ml，培养温度31-37℃，摇床转速120-180r/min，培养12-24h；
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏4-5g/l，K2HPO4·3H2O 8-12g/l，KH2PO4 1.5-2.5g/l，NH4Cl 0.8-1g/l，NaCl 0.3-0.6g/l，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/l，FeCl3·6H2O 25-35mg/l，CoCl2·6H2O 4-6mg/l，VitaminB12 4-6mg/l，glycerol 50-70g/l；
培养条件：接种量10v/v％，发酵温度31-37℃，接种6小时好氧发酵，加入IPTG诱导，IPTG的终浓度1.0mmol/L，此后，控制氧气的通入量(0.4-0.8L/min)，维持微氧环境发酵即可。
分批补料流加甘油维持甘油浓度在20-30g/L。发酵时间30-60h。
本发明有益效果：
本发明在于提供一种新型基因工程菌，用于发酵产1，3-丙二醇，该菌在微氧条件下利用甘油高效发酵产1，3-丙二醇，突破了传统的厌氧发酵途径和微氧条件下低效率生产1，3-丙二醇的局限。分批补料发酵完毕：可利用130g/L的甘油，得到1，3-丙二醇73g/L，摩尔转化率近68％，接近理论最高水平(理论转化率72％)；在相同条件下，原始菌株只能利用120g/L的甘油，得到53g/L的1，3-丙二醇，与原始克雷伯氏菌相比，重组菌株的生产1，3-丙二醇的能力得到显著提高，提高了对底物甘油的利用能力和转化率。与目前文献所报道利用基因手段构建重组微生物生产1，3-丙二醇方法相比，不仅质粒在宿主菌株中稳定性高，而且产物终浓度也较高(目前文献所报道的利用基因工程手段改造肺炎克雷伯氏菌生产1，3-丙二醇的产量在45g/L左右，质粒稳定性在40-50％左右，ZhengPing，Process Biochemistry 41(2006)2160-2169)，另外还可在发酵过程中添加微量四环素，达到抑制部分杂细菌的目的，大大减少了在工业化过程中较易发生的染杂菌现象，提高产物质量，发酵时间也有所缩短，为微生物发酵法工业化生产1，3-丙二醇奠定了良好的基础。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1：Klebsiella pneumoniae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR的构建
(1)基因yqhD的克隆：根据Genebank公布的大肠杆菌E.coli K12中yqhD基因的序列设计合成PCR所需的引物：
P1：5’-GAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3’(SEQ ID No.1)
P2：5’-GGATCCCACTCAGAATGCCTGGCGG-3’(SEQ ID No.2)
引物两端分别引入EcoR I，BamHI，以大肠杆菌E.coli JM 108或E.coli JM 109基因组DNA为模板完成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，EcoR I，BamHI酶切重组pMD18-T载体，回收其中1.16kb片段，连接至pUC18载体，获得重组质粒pUC18-yqhD
(2)基因TetR的克隆：根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列设计合成PCR所需的引物：
P3：5’-GGATCCATGAAATACTGAATTTAAAA-3’(SEQ ID No.3)
P4：5’-AAGCTTCTTAACGATTTAGAAATCCC-3’(SEQ ID No.4)
引物两端分别引入BamHI，Hind III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，经BamHI，Hind III酶切回收其中1.56kb片段，连接至pUC18-yqhD载体的合适位置，TetR基因置于yqhD的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-TetR。
实施例2：重组质粒pUC18-yqhD-TetR转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniaeATCC25955
利用电穿孔仪将重组质粒pUC18-yqhD-TetR转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae ATCC 25955，电转化条件参数为：电压2.5kv，阻值200Ω，脉冲时间4.5msec。电击转化完毕，将经过电击处理过的Klebsiella pneumoniae ATCC25955涂布于含有40μg/m L四环素的LB培养基上，得到阳性克隆Klebsiella pneumoniaeATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。
实施例3：工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR的质粒稳定性考察
考察方法：从新鲜转化平板上挑取单菌落接种至3mL不含四环素的LB培养基中，37℃下培养12h作种子，转种培养24h，即为传种20代，转种培养5次，即为100代，将上述菌液涂布于不含抗生素的LB板上，从中挑选100个单菌落分别点在添加和不添加四环素的平板上，37℃下培养12～16h，比较在添加和不添加四环素的平板上的菌落数即得其稳定性。
考察结果：传种100代之后其质粒稳定性为100％。
实施例4：工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR利用甘油在摇瓶中发酵产1，3-丙二醇
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR；
(2)种子培养基：酵母膏5g/l，麦芽3.0g/l，蛋白胨5g/l，NaCl.0g/l；
种子培养：250ml三角瓶，装液量35ml，培养温度31℃，摇床转速180r/min，培养12h；
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏5g/l，K2HPO4·3H2O 10g/l，KH2PO4 2g/l，NH4Cl 1g/l，NaCl0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，FeCl3·6H2O 30mg/l，CoCl2·6H2O 5mg/l，VitaminB12 5mg/l，glycerol 60g/l；
发酵培养条件：250ml摇瓶，装液量100ml，接种量5～10％(v/v)，发酵温度37℃，摇床转速110rpm，发酵时间20h左右。
发酵结果：60g/l的底物甘油经转化得到33.8g/l的1，3-丙二醇。
对比例1：原始菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955利用甘油在摇瓶中发酵产1，3-丙二醇
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC25955
(2)种子培养基：酵母膏5g/l，麦芽3.0g/l，蛋白胨5g/l，NaCl 10g/l，
种子培养：250ml三角瓶，装液量35ml，培养温度31℃，摇床转速180r/min，培养12h。
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏5g/l，K2HPO4·3H2O 10g/l，KH2PO4 2g/l，NH4Cl 1g/l，NaCl 0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，FeCl3·6H2O 30mg/l，CoCl2·6H2O 5mg/l，VitaminB12 5mg/l，glycerol 60g/l
发酵培养条件：250ml摇瓶，装液量100ml，接种量5～10％(v/v)，发酵温度37℃，摇床转速110rpm，发酵时间20h左右。
发酵结果：60g/l的底物甘油经转化得到29.8g/l的1，3-丙二醇。
实施例5：工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR利用甘油在3L发酵罐中分批补料发酵生产产1，3-丙二醇
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR；
(2)种子培养基：酵母膏5g/l，麦芽3.0g/l，蛋白胨5g/l，NaCl 10g/l；
种子培养：250ml三角瓶，装液量35ml，培养温度31℃，摇床转速180r/min，培养12h。
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏5g/l，K2HPO4·3H2O 10g/l，KH2PO4 2g/l，NH4Cl 1g/l，NaCl0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，FeCl3·6H2O 30mg/l，CoCl2·6H2O 5mg/l，VitaminB12 5mg/l，glycerol 30g/l；
培养条件：3L发酵罐(New Brunswick Scientific，NJ)，接种量10％(v/v)，发酵温度37℃，接种6小时好氧发酵，6小时之后控制通气量(0.4-0.8L/min)维持微氧环境发酵。发酵时间45±1h，分批补料流加甘油维持甘油浓度在25±1g/L。
发酵结果：底物甘油消耗130g/L，产物1，3-丙二醇浓度73g/L。
对比例2：原始菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955利用甘油在3L发酵罐中添加分批补料发酵生产产1，3-丙二醇
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC25955
(2)种子培养基：酵母膏5g/l，麦芽3.0g/l，蛋白胨5g/l，NaCl 10g/l；
种子培养：250ml三角瓶，装液量35ml，培养温度31℃，摇床转速180r/min，培养12h。
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏5g/l，K2HPO4·3H2O 10g/l，KH2PO4 2g/l，NH4Cl 1g/l，NaCl0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，FeCl3·6H2O 30mg/l，CoCl2·6H2O 5mg/l，VitaminB12 5mg/l，glycerol 30g/l；
培养条件：3L发酵罐(New Brunswick Scientific，NJ)，接种量10％(v/v)，发酵温度37℃，接种6小时好氧发酵，6小时之后维持微氧环境(0.4-0.8L/min)发酵。发酵时间50±1h，分批补料流加甘油维持甘油浓度在25±1g/L。
发酵结果：底物甘油消耗120g/L，产物1，3-丙二醇浓度53g/L。
序列表
Claims (6)
1.一种产3-丙二醇基因工程菌，其分类命名为Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR，该工程菌是通过下列方法制备得到的：利用PCR技术从大肠杆菌中扩增出1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD，从质粒载体pHY300PLK中扩增出四环素抗性基因TetR，通过多克隆位点将其串联到表达载体pUC18的合适位置，TetR基因置于yqhD的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-TetR，重组质粒转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC 25955，得到重组的肺炎克雷伯氏菌，即产1，3-丙二醇基因工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR。
2.根据权利要求1所述的产1，3-丙二醇基因工程菌，其特征在于该工程菌通过下列方法制备得到：
(1)基因yqhD的克隆：根据Genebank公布的大肠杆菌E.coli K12中yqhD基因的序列设计合成PCR所需的引物：
P1：5’-GAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3’
P2：5’-GGATCCCACTCAGAATGCCTGGCGG-3’
引物两端分别引入EcoR I，BamHI，以大肠杆菌E.coli JM108或E.coli JM109基因组DNA为模板完成PCR反应；PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，EcoR I，BamHI酶切重组pMD18-T载体，回收其中1.16kb片段，根据所述酶切位点连接至pUC18载体的合适位置，获得重组质粒pUC18-yqhD；
(2)基因TetR的克隆：根据质粒载体pHY300PLK中四环素抗性基因序列设计合成PCR所需的引物：
P3：5’-GGATCCATGAAATACTGAATTTAAAA-3’
P4：5’-AAGCTTCTTAACGATTTAGAAATCCC-3’
引物两端分别引入BamHI，Hind III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应；PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，经BamHI，HindIII酶切回收其中1.56kb片段，根据所述酶切位点连接至pUC18-yqhD载体的合适位置，TetR基因置于yqhD的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-TetR；
(3)重组基因工程菌的获得：将重组质粒pUC18-yqhD-TetR转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC 25955，涂布含40μg/mL的四环素平板，挑取阳性转化子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组肺炎克雷伯氏菌，命名为Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。
3.如权利要求1所述的产1，3-丙二醇基因工程菌的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：利用PCR技术从大肠杆菌中扩增出1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD，从质粒载体pHY300PLK中扩增出四环素抗性基因TetR，利用多克隆位点将其串联到表达载体pUC18的合适位置，TetR基因置于yqhD的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-TetR，重组质粒转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955，得到重组肺炎克雷伯氏菌，即产1，3-丙二醇基因工程菌Klebsiella pneumoniaeATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。
4.根据权利要求3所述的产1，3-丙二醇基因工程菌的制备方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)基因yqhD的克隆：根据Genebank公布的大肠杆菌E.coli K12中yqhD基因的序列设计合成PCR所需的引物：
P1：5’-GAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3’
P2：5’-GGATCCCACTCAGAATGCCTGGCGG-3’
引物两端分别引入EcoR I，BamHI，以大肠杆菌E.coli JM108或E.coli JM109基因组DNA为模板完成PCR反应；PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，EcoR I，BamHI酶切重组pMD18-T载体，回收其中1.16kb片段，根据所述酶切位点连连接至pUC18载体的合适位置，获得重组质粒pUC18-yqhD；
(2)基因TetR的克隆：根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列设计合成PCR所需的引物：
P3：5’-GGATCCATGAAATACTGAATTTAAAA-3’
P4：5’-AAGCTTCTTAACGATTTAGAAATCCC-3’
引物两端分别引入BamHI，Hind III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应；PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，经BamHI，HindIII酶切回收其中1.56kb片段，根据所述酶切位点连连接至pUC18-yqhD载体的合适位置，TetR基因置于yqhD的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-TetR；
(3)重组基因工程菌的获得：将重组质粒pUC18-yqhD-TetR转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC 25955，涂布含40μg/mL的四环素平板，挑取阳性转化子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组肺炎克雷伯氏菌，命名为Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR。
5.权利要求1所述的产1，3-丙二醇基因工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-TetR在生产1，3-丙二醇中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于该基因工程菌以甘油为底物发酵生产1，3-丙二醇，具体生产工艺为：
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC 25955-pUC18-yqhD-TetR；
(2)种子培养基：酵母膏4-5g/l，麦芽3.0-4.0g/l，蛋白胨4-5g/l，NaCl 8-12g/l，四环素浓度20-40μg/l；
种子培养：250ml三角瓶，装液量35ml，培养温度31-37℃，摇床转速120-180r/min，培养12-24h；
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏4-5g/l，K2HPO4·3H2O 8-12g/l，KH2PO4 1.5-2.5g/l，NH4Cl 0.8-1g/l，NaCl 0.3-0.6g/l，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/l，FeCl3·6H2O 25-35mg/l，CoCl2·6H2O 4-6mg/l，VitaminB12 4-6mg/l，glycerol 50-70g/l；
培养条件：接种量10v/v％，发酵温度31-37℃，接种6小时好氧发酵，加入IPTG诱导，IPTG的终浓度1.0mmol/L，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境发酵即可。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: JIANGSU HENGSHUNDA BIO-ENERGY Co.,Ltd. Assignor: Nanjing Tech University Contract record no.: 2012320000324 Denomination of invention: Gene engineering bacterium for producing 1,3-propanediol and its preparation method and application Granted publication date: 20120201 License type: Exclusive License Open date: 20080910 Record date: 20120328 |
|
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120201 Termination date: 20130423 |