CN103305543A

CN103305543A - 一株失活乙酰乳酸合成酶的工程菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用

Info

Publication number: CN103305543A
Application number: CN2013102308474A
Authority: CN
Inventors: 周胜; 秦启伟; 李莉莉; 黄友华; 高任
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2013-06-09
Filing date: 2013-06-09
Publication date: 2013-09-18

Abstract

本发明公开了一株失活乙酰乳酸合成酶的工程菌及其构建方法和在生产1,3-丙二醇中的应用。本发明利用同源重组、基因插入失活的方法使产1,3-丙二醇的野生型菌株中的乙酰乳酸合成酶基因沉默，从而得到2,3-丁二醇代谢途径被阻断的基因工程菌。用本发明的工程菌进行1,3-丙二醇的发酵生产，副产物2,3-丁二醇生产大幅度降低，使得副产物2,3-丁二醇对代谢分流作用大大减少，生产1,3-丙二醇的转化率提高；另外，由于副产物2,3-丁二醇减少，也降低了后提取压力，所以降低了生产成本。实验证明，将本发明的工程菌按常规方法发酵36小时，1,3-丙二醇浓度可达72g/L。本发明将在微生物发酵法生产1,3-丙二醇的工业化生产中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。

Description

一株失活乙酰乳酸合成酶的工程菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株失活乙酰乳酸合成酶的工程菌及其构建方法和在生产1,3-丙二醇中的应用。

背景技术：

1,3-丙二醇（PDO）是一种重要的化工原料。PDO可作为有机溶剂，应用于耐压高润滑剂、染料、油墨、防冻剂等行业；也可用来合成杂环、药物中间体、聚酯和聚氨酯；其中最主要的用途是作为单体合成聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）。PTT是继50年代聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、70年代聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT）之后实现工业规模的新的可成纤聚酯高分子材料，是一种极有发展前途的新型聚酯材料。1998年PTT被美国评为六大石化新产品之一。PTT与PET、PBT相比除具有聚酯的耐化学性外，还具有其它一些更优良的特性。如尼龙的弹性、恢复性；在全范围无需添加特殊化学药品即能呈现良好的连续印染特性；抗紫外、臭氧和氮氧化合物的着色性；抗内应力；低水吸附、低静电以及良好的可生物降解性；可循还利用性等。由于PTT的优良特性，它在地毯工业、服装材料、工程热塑料以及其它众多领域有着很广泛的应用。

生产PTT纤维的关键在于单体原料PDO的来源。PTT占领市场的关键在于价格，而PTT的价格主要取决于PDO的价格。由于不能廉价制得PDO，制约了PTT的生产和市场开拓；直到90年代中期实现了工业化生产PDO，使得PDO价格大大降低，PTT才开始工业化生产和应用。

Dupont和Shell两家跨国公司曾采用化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生产PDO。化学合成法生产PDO的缺点是选择性和产率较低，操作条件需要高温高压，设备投资巨大，原料不可再生；由于产量有限，长期以来PDO售价偏高。

生物法生产1,3-丙二醇主要是微生物发酵。与化学合成法相比，微生物发酵法生产1,3-丙二醇具有显著的优点：1、利用成本较低的可再生资源（如甘油、玉米、淀粉）为原料；2、生产条件温和，操作简便，不需贵重金属催化剂；3、选择性好，副产物较少，易于分离纯化；4、环境污染小。微生物发酵法是以生物技术为特征的“绿色工业”向传统石油化工提出的强有力的挑战，具有重要的现实意义，因而越来越受到重视。

微生物发酵法生产1,3-丙二醇是利用微生物歧化甘油产生。至今所有被发现的1,3-丙二醇生产菌种均为细菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreudii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具有较高的1,3-丙二醇转化率和1,3-丙二醇生产强度，具有较高的开发前景，从而得到了较多关注。

目前被用来生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌主要分离自土壤环境中。克雷伯氏菌只能利用甘油合生1,3-丙二醇。在合成1,3-丙二醇的过程中，甘油发生岐化反应，氧化途径中的产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1,3-丙二醇。氧化途径中甘油先被氧化生成丙酮酸；丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰CoA和甲酸，甲酸往往又会分解为CO₂和H₂。乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸的过程中生成过量的ATP，而在经乙醛形成乙醇的反应中要消耗2摩尔还原力；丙酮酸也可能转化为2,3-丁二醇,乳酸和琥珀酸，生成乳酸的过程要消耗1摩尔还原力。而生成琥珀酸的过程要消耗2摩尔还原力。还原途径包括两步反应：第一步，由依赖于辅酶B₁₂的甘油脱水酶催化甘油脱水生成3-羟基丙醛；第二步，由1,3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛还原生成1,3-丙二醇，此过程消耗1摩尔还原力。

在克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇的过程中，细胞的生长受到底物甘油和多种产物的抑制作用。野生型克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇的过程中，副产物以乳酸产量最多,可达40g/L以上；2,3-丁二醇的产量其次，可达20g/L以上；研究报导，失活乳酸合成的关键酶基因，乳酸合成抑制，但2,3-丁二醇的产量大幅度增加，可达40g/L以上。大量副产物的生成不利于发酵生产1,3-丙二醇，不但造成底物甘油的浪费，而且由于合成2,3-丁二醇的途径会争夺还原力，导致1,3-丙二醇产量降低。由于2,3-丁二醇的产生，使底物甘油更多地进入氧化途径，导致底物甘油合成目标产物1,3-丙二醇转化率降低。另外，副产物的生成，使产品提取压力增加，能耗成本提高。因此，减少副产物2,3-丁二醇的生成，对提高生产水平，降低微生物发酵生产1,3-丙二醇成本，具有重要的意义。对于副产物乳酸，研究报道敲除乳酸代谢途径关键编码基因乳酸脱氢酶基因，可以使乳酸合成大幅度减少，1,3-丙二醇生产能力得到增强。但2,3-丁二醇合成代谢途径关键酶乙酰乳酸合成酶失活对克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇的影响未知。

发明内容：

本发明的目的是提供失活乙酰乳酸合成酶的工程菌及其构建方法和在生产1,3-丙二醇中的应用。

本发明的失活乙酰乳酸合成酶的工程菌是通过以下方法构建的，其特征在于，是将产1,3-丙二醇的野生型菌株中的乙酰乳酸合成酶基因（ALS）敲除后获得的工程菌。

所述的将产1,3-丙二醇的野生型菌株中的乙酰乳酸合成酶基因敲除，优选通过以下方法敲除：

a、PCR扩增产1,3-丙二醇的野生型菌株的乙酰乳酸合成酶基因的部分同源序列，将其与自杀载体相连，然后再导入杂交供体菌株中；

b、将步骤a获得的携带有乙酰乳酸合成酶基因的部分同源序列与自杀载体的供体菌与产1,3-丙二醇的野生型菌株进行双亲本杂交，利用同源重组、基因插入失活，经筛选后获得乙酰乳酸合成酶基因被沉默的失活乙酰乳酸合成酶的工程菌。

所述的1，3-丙二醇的野生型菌株优选为克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌，进一步优选为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。

所述的步骤a的PCR扩增产1，3-丙二醇的野生型菌株的乙酰乳酸合成酶基因的部分同源序列是乙酰乳酸合成酶基因的哪一部分序列并不重要，只要是同源序列即可。当所述的产1，3-丙二醇的野生型菌株为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)时，所述的步骤a的PCR扩增肺炎克雷伯氏菌的乙酰乳酸合成酶基因的部分同源序列优选为是以肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以上游引物ALS-F：gcgaattctggacaaacagtatccggtacgc与下游引物ALS-R：tagagctcacagaatctgactcagatgcag组成的引物进行PCR扩增后的序列。

所述的自杀载体可为自杀载体pGPCm，可从试剂公司购买。

所述的将携带有乙酰乳酸合成酶基因部分同源序列的自杀载体导入杂交供体菌株中，可以通过热激法、电转化法、接合转化法等常规方法转化杂交供体菌。

所述的杂交供体菌可以为大肠杆菌SM10(λpir)。通过双亲本杂交，使乙酰乳酸合成酶基因的部分序列与产l,3-丙二醇的目的菌株发生同源重组，从而使产1,3-丙二醇的野生型菌株中的乙酰乳酸合成酶基因插入失活，从而获得失活乙酰乳酸合成酶的工程菌。

本发明还提供了失活乙酰乳酸合成酶的工程菌在生产1，3-丙二醇中的应用。

本发明利用同源重组、基因插入失活的方法使产1,3-丙二醇的野生型菌株中的乙酰乳酸合成酶基因沉默，从而得到2,3-丁二醇代谢途径被阻断的基因工程菌。用本发明的工程菌进行1,3-丙二醇的发酵生产，副产物2,3-丁二醇生产大幅度降低，使得副产物2,3-丁二醇对代谢分流作用大大减少，生产1,3-丙二醇的转化率提高；另外，由于副产物2,3-丁二醇减少，也降低了后提取压力，所以降低了生产成本。实验证明，将本发明的工程菌按常规方法发酵36小时，1,3-丙二醇浓度可达72g/L。本发明将在微生物发酵法生产1,3-丙二醇的工业化生产中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。

附图说明：

图1是PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳图；

图2为载体pGPCm的物理图谱。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、2,3-丁二醇代谢途径基因失活的失活乙酰乳酸合成酶的工程菌的构建

(l)、乙酰乳酸合成酶基因ALS部分序列的克隆

根据乙酰乳酸合成酶基因ALS完整的DNA序列（GenBank号：YP_006633876.1）设计引物，PCR扩增其部分同源序列，引物序列如下：上游引物ALS-F：gcgaattctggacaaacagtatccggtacgc与下游引物ALS-R：tagagctcacagaatctgactcagatgcag。以野生型肺炎克雷伯氏菌（CCTCC M2011075）基因组DNA为模板，在引物ALS-F和ALS-R的引导下，PCR扩增乙酰乳酸合成酶基因ALS的部分序列，PCR扩增条件为：先95℃3min;然后94℃1min，55℃1min，72℃2min，共33个循环；最后72℃10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化约1500bp的目的片段（图1），将其克隆入载体pGEM-T easy（TaKaRa公司）中，得重组产物，将重组产物转化大肠杆菌Dh5α感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶EcoRI和sacI进行酶切与并测序鉴定（插入的序列如SEQ ID NO.1所示），结果表明，如SEQ ID NO.1所示的序列插入了载体pGEM-Teasy中，由此得到重组载体，命名为pT-ALS。

(2)、乙酰乳酸合成酶基因ALS自杀载体pGP-ALS的构建

用限制性内切酶EcoRI和sacI酶切pT-ALS质粒，回收并纯化步骤（1）扩增的长度约为1500bp的ALS部分DNA片段，再将其与经EcoRI和sacI酶切的自杀载体pGPCm（图2）用DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌SM10(λpir)感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，得到乙酰乳酸合成酶基因ALS自杀载体（其是将约为1500bp的ALS部分序列插入到自杀载体pGPCm中），命名为pGP-ALS。

(3)、克雷伯氏菌2,3-丁二醇代谢途径关键基因失活突变株的构建

将携带有载体pGP-ALS的大肠杆菌SM10(λpir)（供体菌）和野生型肺炎克雷伯氏菌（CCTCC M2011075）（受体菌）进行双亲本杂交，具体方法为：在含有氯霉素（25Μm）的LB液体培养基中过夜培养供体菌和受体菌；供体菌和受体菌按数量比3:1比例混合于10mM的MgSO₄溶液中，过滤，将滤膜置于LB平板上，37℃培养8-12小时；用10mM的MgSO₄溶液洗下长在滤膜上的菌苔，梯度稀释后涂布于氯霉素（25Μm）抗性LB平板上，37℃培养进行筛选。最终得到具有氯霉素(Cm)抗性的重组菌株，即为2,3-丁二醇代谢途径关键基因乙酰乳酸合成酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株（失活乙酰乳酸合成酶的工程菌）。

2、2,3-丁二醇代谢途径关键基因失活工程菌乙酰乳酸合成酶的活性检测

对步骤1构建的2,3-丁二醇代谢途径关键基因失活的肺炎克雷伯氏菌突变株（失活乙酰乳酸合成酶的工程菌）进行乙酰乳酸合成酶的活性检测，以野生型菌株为对照，具体方法包括以下步骤：

(l)将失活乙酰乳酸合成酶的肺炎克雷伯氏菌突变株接种于100mL培养基（每L水中含有甘油30g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl5g，pH7.0，120℃灭菌20min）中，在37℃下振荡培养6-10小时，每2小时取样离心收集菌体；

(2)用100mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.5)悬浮洗涤菌体2次；

(3)用2.5mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.5)悬浮菌体；

(4)4℃超声波破碎菌体；

(5)酶活测定根据乙酰乳酸在一定温度条件下会脱羧形成乙偶姻，而乙偶姻在碱性条件下可以与肌酸和α-萘酚的混合物反应生成红色物质,可在525nm下检测。反应体系为1mL0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0),其中含40mmol/L的丙酮酸钠,1mmol/L的氯化镁,1mmol/L的TPP,10μmol/L的FAD,37℃加入20μL酶液（即破碎菌体液）启动反应,10min后加50μL3mol/L硫酸终止反应,37℃脱羧25min,2000r/min离心1min后,上清稀释20倍后取500μL加入0.25mL0.17%肌酸和0.25mL1.7%的α-萘酚,37℃显色30min,于525nm处测定吸光度。乙偶姻的标准曲线方程为:y=0.0139x,其中x为乙偶姻浓度(μmol/L),y为OD525值。酶活单位(IU)定义为在该反应条件下,1min内催化生成1μmol/L乙偶姻所需的酶量。

结果显示，步骤1构建的2,3-丁二醇代谢途径关键基因失活的肺炎克雷伯氏菌突变株（失活乙酰乳酸合成酶的工程菌）的乙酰乳酸合成酶活性为野生型菌株的1.4%-3.2%，表明步骤l构建的工程菌的乙酰乳酸合成酶失活。

3、乙酰乳酸合成酶失活的肺炎克雷伯氏菌突变株（失活乙酰乳酸合成酶的工程菌）发酵生产1,3-丙二醇

(1)培养基

LB培养基（g·L^-1）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，琼脂10，调节至pH7.0，用于克雷伯氏菌菌种的短期保藏及活化。种子及发酵培养基组成见表1：

表1培养基组成

(2)培养方式

(i)种子活化：从甘油管保藏的步骤1中的失活乙酰乳酸合成酶ALS基因的肺炎克雷伯氏菌突变株（失活乙酰乳酸合成酶的工程菌）菌种接种至LB培养基斜面活化，温度37℃下培养12小时活化种子。

(ii)种子培养：250mL三角瓶9层纱布封口，装液量100mL，接入斜面菌苔一环，摇床中进行好氧种子培养，温度30℃，转速150r·min^-1。

(iii)发酵培养：为了考察所构建的失活乙酰乳酸合成酶ALS基因对工程菌发酵甘油产1,3-丙二醇的影响，以步骤1中的失活乙酰乳酸合成酶ALS基因的肺炎克雷伯氏菌突变株（失活乙酰乳酸合成酶的工程菌）为实验组，以出发野生菌克雷伯氏菌为对照组，进行补料批式发酵，采用岛津LC-20A HPLC分析发酵液中物质组成。

在5L搅拌发酵罐中进行发酵实验，装液量4L，接种量1%，通入0.5vvm空气进行微氧发酵培养，搅拌转速为250rpm。发酵温度恒定在37℃；NaOH调节pH至6.8，发酵过程中体系pH通过流加40%的NaOH溶液调控。待菌株进入对数生长期后进行甘油补料，甘油浓度控制在1-50g/L。

(iv)发酵结果

发酵进行28小时，1,3-丙二醇及副产物生产情况结果见表2。

表2：失活乙酰乳酸合成酶ALS基因对克雷伯氏菌发酵甘油产1,3-丙二醇的影响

从发酵结果可以得知，失活乙酰乳酸合成酶ALS基因使2,3-丁二醇合成代谢途径被切断，2,3-丁二醇合成量大幅度降低80.71%，发酵液中1,3-丙二醇浓度增加4.71%，1,3-丙二醇的生产强度增加4.65%；部分代谢流转向副产物乳酸合成，1,3-丙二醇得率略有提高。

因而，本发明所报道失活2,3-丁二醇代谢途径关键酶编码基因乙酰乳酸合成酶ALS基因可以使发酵副产物2,3-丁二醇生产大幅度降低，降低合成2,3-丁二醇对底物甘油的分流作用以及对辅酶NADH的竞争作用，发酵生产PDO浓度增加，生产强度与得率均提高；另外，由于副产物2,3-丁二醇减少，可以降低提取阶段生产成本。本发明所描述的方法在微生物发酵法生产1,3-丙二醇的工业化生产中具有重要的应用前景。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种失活乙酰乳酸合成酶的工程菌的构建方法，其特征在于，是将产1,3-丙二醇的野生型菌株中的乙酰乳酸合成酶基因敲除后获得的工程菌。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的将产1,3-丙二醇的野生型菌株中的乙酰乳酸合成酶基因敲除是通过以下方法敲除：

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的1，3-丙二醇的野生型菌株为克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的1，3-丙二醇的野生型菌株为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，当所述的产1，3-丙二醇的野生型菌株为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)时，所述的步骤a的PCR扩增肺炎克雷伯氏菌的乙酰乳酸合成酶基因的部分同源序列是以肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以上游引物ALS-F：gcgaattctggacaaacagtatccggtacgc与下游引物ALS-R：tagagctcacagaatctgactcagatgcag组成的引物进行PCR扩增得到的序列。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的自杀载体为自杀载体pGPCm。

7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的杂交供体菌株为大肠杆菌SM10(λpir)。

8.一种按照权利要求1、2、4、5、6或7所述的构建方法构建的失活乙酰乳酸合成酶的工程菌。

9.权利要求8所述的失活乙酰乳酸合成酶的工程菌在生产1，3-丙二醇中的应用。